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Practical Training Basic: LC Theory for Troubleshooting

Autumn Breaud

Johns Hopkins University

LC Basics Part I:Demystifying Liquid Chromatography Separations and Hardware

Introduction to Liquid Chromatography

• What is HPLC?• High performance liquid chromatography

• Principles of HPLC• Stationary phase

• Mobile phase

To MS

Principles of HPLC

• Stationary phase + mobile phase + pump = separation

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Principles of HPLC

• Stationary Phase• Common column types

• Non‐polar• C18, C8, C4

• Polar

• Silica, amino, cyano

• Ion Exchange

• Cation and anion exchange

• Size‐exclusion

• Phenyl/alkyl

• Mixed mode

• Combinations of above media

• Mobile Phase• Aqueous: Water/Buffer

• Organic: Methanol/Acetonitrile

• Additives:

• Acetic acid

• Formic acid

• Ammonium formate

• Ammonium hydroxide

• Ammonium acetate

• TFA*

HPLC Hardware: The Missing Link(s)

HPLC Hardware: The Missing Link: Autosampler

To MS

Anatomy of an AS‐HPLC System

Autosampler Pump

Mobile Phases

Stationary Phase

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Anatomy of an AS‐HPLC System: AutosamplerSyringe and Injector Valve

Anatomy of an AS‐HPLC System: Pumps

Anatomy of an AS‐HPLC System: Common pump components• Mobile phase inlet

• Mobile phase outlet

• Pump head

• Piston

• Check valve

Anatomy of an AS‐HPLC System: Common pump components• Check valve

• Inlet and outlet pictured

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Anatomy of an AS‐HPLC System: Check Valves• What are they and why do I care?

• Common cause of HPLC run failure

• Stuck ball valve

• Debris in valve chamber

Slide Credit: M. Sagar Kishor Savale

Anatomy of an AS‐HPLC System: Valves

Anatomy of an AS‐HPLC System: Valves• Selection valves

• Bypass valves

• Injection valves• Common cause of HPLC run failure

Anatomy of an AS‐HPLC System: Valves• Stator face

• Rotor

• Rotor seal

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Variations on a Theme: The Many Faces of Liquid Chromatography• UHPLC

• Nanoflow/Microflow

• Multiplexing

• Multi‐dimensional separations

Variations on a Theme: UHPLC

HPLC

• Particle size larger

• 3‐10 um

• Longer run times

• Lower line pressure

• 100‐200 bar max

UHPLC

• Particle size smaller

• 0.75‐<2um

• Shorter run times

• Higher line pressure

• >500 bar max

• Improved resolution

• Lower sample and solvent volumes

Variations on a Theme: NanoflowChromatography

HPLC/UHPLC

‐typical flow: 200‐1000 uL/min

‐column ID: 0.5‐0.075mm

Nanoflow

‐typical flow <200 uL/min

‐column ID: 2‐4 mm1 min 4 min.

Channel

1

1 min .2 min .

2 min

Channel

2

MS Data

Acquisition Window

Idle Time Idle Time

Each channel connects to the detector during the

elution step

MS Fully Utilized 3 min 4 min etc.

Variations on a Theme: Multiplexing

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Variations on a Theme: MultiplexingVariations on a Theme: Multi‐dimensional Separations

LC Basics Part II:Troubleshooting and Staying Productive, or Up a Creek? Pick a Paddle

Troubleshooting LC Systems

• Diagnostic tools• Pressure trace analysis

• Check valve failures

• Empty sample/vial/well

• Air in LC lines

• Mobile phase composition errors

• Loss of pressure analysis• Locate your clog

• Lot check‐in logs• Use them or lose it

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Troubleshooting LC Systems: Pressure Trace AnalysisStep 1) Characterize a ‘healthy’ pressure trace:

Reverse Phase Pressure Trace:Normal Phase Pressure Trace:

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Troubleshooting LC Systems: Pressure Trace Analysis

Step 2) Learn to ‘read’ aberrant pressure traces

‐Check valve failure

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Troubleshooting LC Systems: Pressure Trace Analysis

Step 2) Learn to ‘read’ aberrant pressure traces

‐Sample vial/well empty or AS does not transfer sample volume

28

Troubleshooting LC Systems: Pressure Trace Analysis

Step 2) Learn to ‘read’ aberrant pressure traces

‐Empty mobile phase line/s

Healthy pressure trace Aberrant pressure trace

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Normal Pressure Trace Problem Pressure Trace

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Troubleshooting LC Systems: Mobile Phase Composition Error

Step 2) Learn to ‘read’ aberrant pressure traces

‐Mobile phase B topped off before run

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Troubleshooting LC Systems: No Pressure‐Find that Clog

Lot check‐in logs: Use them or lose it

• Consumables:

• columns

• mobile phases 

• internal standard solution lots

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Troubleshooting LC Systems: Lot Change Tracking

The Six Most Common LC Problems and How to Spot Them

• Column aging and degradation• Peak tailing, fronting, 

broadening

• Changes in retention time

• Loss of signal 

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The Six Most Common LC Problems and How to Spot Them• Clogging

Healthy pressure trace Aberrant pressure trace

The Six Most Common LC Problems and How to Spot Them• Check valve failure

• Could be air in the line/s

The Six Most Common LC Problems and How to Spot Them• Autosampler syringe failure

Normal Chromatogram Problem Chromatogram

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RT: 0.00 - 3.90 SM: 7B

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5Time (min)

0

5

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20

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65

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75

80

85

90

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100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

Peak Area: 158640

1.73

2.420.89 2.571.050.30 3.01 3.20 3.793.641.48

NL:1.13E4TIC F: + c ESI sid=1.00 SRM ms2 353.150 [283.990-284.010] MS Cal_007

RT: 0.00 - 3.90 SM: 7B

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5Time (min)

0

5

10

15

20

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50

55

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65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

Peak Area: 2129282

2.17

2.923.42 3.571.290.920.36 1.640.55

NL:1.03E5TIC F: + c ESI sid=1.00 SRM ms2 353.150 [283.990-284.010] MS Cal_007

The Six Most Common LC Problems and How to Spot ThemIncorrect mobile phase composition

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January 12, 2018 37

The Six Most Common LC Problems and How to Spot ThemIncorrect mobile phase composition

Healthy pressure trace Aberrant pressure trace

The Six Most Common LC Problems and How to Spot Them• Best and most insidious problem:

The Six Most Common LC Problems and How to Spot Them• Best and most insidious problem:

The Six Most Common LC Problems and How to Spot Them• Best and most insidious problem:

• LC eluant on floor

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LC Basics Part III:Case Studies in Separations Sleuthing

Case Studies in LC Troubleshooting• Case Study 1:

• The case of the vanishing busulfanpeak 

Case Studies in LC Troubleshooting• Case Study 1:

• The case of the vanishing busulfanpeak 

• Pressure trace analysis

Healthy pressure trace Aberrant pressure trace

Case Studies in LC Troubleshooting• Case Study 1:

• The case of the vanishing busulfan peak 

• Check valve replaced, new problem arises

Healthy pressure trace New aberrant pressure trace

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Case Studies in LC Troubleshooting• Case Study 1:

• The case of the vanishing busulfan peak • Check valve failure

• Gradient pressure profile still looks unusual

• Mobile phase A (aqueous) as loaded in position of mobile phase B• Mobile phase A lot check‐in procedure not completed, but bottle is labeled with new date 

• ‘Marker test’

• No elution of analyte

• No pressure changes associated with solvent front or change in mobile phase surface tension from aqueous to organic 

Case Studies in LC Troubleshooting

• Case Study 2:• The case of the intermittent missing antiretroviral peaks

Healthy pressure trace Aberrant pressure trace

Case Studies in LC Troubleshooting

• Case Study 2:• The case of the intermittent missing antiretroviral peaks

Case Studies in LC Troubleshooting

• Case Study 2:• The case of the intermittent missing antiretroviral peaks

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Case Studies in LC Troubleshooting

• Case Study 2:• The case of the intermittent missing antiretroviral peaks

Case Studies in LC Troubleshooting

• Case Study 2:• The case of the intermittent missing antiretroviral peaks

• Flat pressure profile upon injection is aberrant and associated with missing internal standard signal

• Change of AS syringe, needle, needle seal, injector rotor seal: still see intermittent signal loss

Case Studies in LC Troubleshooting

• Case Study 2:• The case of the intermittent missing antiretroviral peaks

• Change of bungee cord: no more intermittent loss of signal

• Pressure of injection was not high enough to overcome line pressure at moment of injection

• Optimized needle penetration height in injector port

https://www.surveymonkey.com/r/7QMFZYJ

Please let us know what training resources you need

chris.herold@msacl.org jastone@ucsd.edu

Speaker and Presentation Evaluation for Dr. Autumn BreaudSurvey Monkey