9-Transcriptoma Proteoma y Analisis de La Secuencia de Adn

7/26/2019 9-Transcriptoma Proteoma y Analisis de La Secuencia de Adn

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TRANSCRIPTOMATRANSCRIPTOMA


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- Northern blot- Northern blot

- Aporta informacin sobre la presencia de un transcrito, su abundancia y su tamao

- Electroforesis: Se realiza en condiciones desnaturalizantes, Gel: agarosa 0,8-1,4% yformaldehdo 6%, en buffer MOPS (3-(N-morfolino)propano-sulfnico)

- Las muestras deben desnaturalizarse, buffer de carga: MOPS, formamida, formaldehdo,colorante

- Transferencia: por capilaridad o vaco, similar a Southern

- Hibridacin: similar a Southern, buffer con ms formamida (50%)

- Para comparar diferencias en los niveles de

expresin de un gen es muy importante lautilizacin de un control: generalmente ungen que se exprese constitutivamente:citoesqueleto (-actina), un gen de ARNr. Lasintensidades de la seal del gen en estudio

deben normalizarse con las del control


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- RT-PCR- RT-PCR

- PCR tiempo real- PCR tiempo real


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- ANLISIS DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL- ANLISIS DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL

- Obtener informacin sobre genes que se transcriben nicamente o con mayor intensidaden una determinada condicin respecto a otra. Se busca analizar el transcriptoma completo.

- Estos mtodos se basan en la utilizacin de dos poblaciones de ADNc obtenidas a partirdel ARN de las dos condiciones a ensayar:

Mtodos clsicos:

- Hibridacin substractiva

- Differential display

- cDNA-AFLP- ESTs

Mtodos basados en genmica:

- Microarreglos- RNA sequencing


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-Se basa en la eliminacin de las molculas de ADNc que estn repetidas enlas dos condiciones a travs de un proceso de hibridacin; las molculashbridas formadas entre ADNc de las dos condiciones son entonceseliminadas, el resto (expresadas diferencialmente) se aslan y estudian.

- p.ej. Sistema SSH (Supression Substractive hybridization), deClontech

- Hibridacin substractiva- Hibridacin substractiva


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- Hibridacin substractiva- Hibridacin substractiva


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- Similar al mtodo de AFLPs pero partiendo del ADNc obtenido a partir de doscondiciones en lugar de DNA genmico. Los patrones de bandas obtenidoscon ambas condiciones se comparan para detectar bandas presentes slo en

una condicin, indicativo la expresin diferencial de un transcrito.

- cDNA-AFLP- cDNA-AFLP


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- Consiste en visualizar en un gel el nivel de expresin de los transcritos provenientesde dos condiciones diferentes y detectar diferencias en la misma.

- Actualmente se utilizan mtodos basados en PCR (DD-PCR).

- Esquema:

- Para cada poblacin de RNA se ponen 3 reacciones de sntesis de ADNc,cada una con un primer oligo-dT anclado: T12A, T12C, T12G

- Finalizada la sntesis de la hebra de ADNc, se aade el primer arbitrario(10-12 bases) y todos los componentes para una reaccin de PCR, con 32P-dCTP

- Se cargan las muestras, previa desnaturalizacin, en un gel de acrilamidadel 6% desnaturalizante (7 M urea). Autorradiografa

- Cortar las bandas de inters (expresadas diferencialmente), eluir el ADN y

precipitar con acetato de potasio, glicgeno y etanol.- Reamplificar por PCR usando la combinacin adecuada de primer T12M(M= A, C o G) con arbitrario

- Correr un gel de agarosa con el producto de la PCR. Extraer el fragmentodel gel para subclonarlo, secuenciarlo, etc.

- Differential display- Differential display


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- Differential display- Differential display

Para cada condicin se tiene un pool de RNAque se utiliza para sntesis de ADNc yamplificacin con: primer oligo-dT anclado +primer arbitrario. Se obtiene as un patrn de

bandas amplificadas para cada condicin, lascuales se comparan en un gel depoliacrilamida para detectar transcritosexpresados diferencialmente.


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- Se basa en tres principios

- Una secuencia corta, tag (etiqueta), de 10-14 nucletidos, contiene suficienteinformacin para identificar de forma nica un transcrito.

- Una vez aislados, estos tags pueden unirse para formar largas series demolculas de ADN que pueden clonarse y secuenciarse.

- La cuantificacin del nmero de veces que un determinado tag est presente enuna condicin indica el nivel de expresin del gen correspondiente en esa

condicin

- SAGE: Serial analysis of gene expression- SAGE: Serial analysis of gene expression


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- SAGE- SAGE

- Se cortan con las enzimas NlaIII yBsmFI las secuencias tag de cadatranscrito de una condicin determinada

- Se ligan las secuencias aisladas

formando largas cadenas de ADN quese secuencian

- La secuencia nos indica el nmero deveces que un tag particular estpresente, lo que refleja la abundancia de

ese transcrito en una determinadacondicin, permitiendo hacercomparaciones cuantitativas entre dos oms condiciones

- Finalmente se identifican los genes a

que corresponden los tags mediantecomparacin de la secuencia del tag conuna base de datos que contenga todoslos genes caracterizados de la especieen cuestin


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- SAGE- SAGE

Obtencin de los tags: Se corta con NlaIII, se aaden adaptadores (linkers) paraBsmFI y se corta con esta enzima. BsmFI es del tipo IIs, corta a una distancia de unos15 pares de bases del sitio de reconocimiento (en el linker), generando fragmentos conuna secuencia de 15 pb (SAGE tag), que se ligan para formar concatmeros.


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- ESTs: Expressed Sequence Tags- ESTs: Expressed Sequence Tags

- Ms que un mtodo de differential display es una tcnica que permite identificar cientos detranscritos que se estn expresando en una clula en un momento y condicionesdeterminados: transcriptoma

- Consiste en la obtencin de ADNc de la muestra o muestras en estudio, y en la realizacinde una nica reaccin de secuencia que permita identificar mediante bsquedas en basesde datos los genes a que corresponden cada uno de los clones secuenciados. Se obtieneas una representacin del transcriptoma que puede compararse entre dos condicionesdistintas.


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- MICROARREGLOS- MICROARREGLOS

- Un arreglo de ADN es una coleccin de molculas de ADN (ADNC u oligonucletidos)dispuestas sobre un soporte slido como una matriz de filas y columnas

- Macroarreglos: puntos sobre una membrana de nylon o nitrocelulosa, pequeonmero. Las sondas (ADNc que proviene de dos condiciones) se marcan porradiactividad. Se detecta la intensidad de la seal en cada punto y se compara la mismaentre las dos condiciones.

- Microarreglos: Habitualmente oligonucletidos (20-80 nucletidos), cada uno de elloses una secuencia identificativa de un gen. Contienen hasta 40.000-60.000 puntos. Elmarcaje de las sondas de ADNc se realiza con fluorescencia: rojo (Cy5) para lacondicin problema y verde (Cy3) para la condicin de referencia. El detector compara laintensidad de la fluorescencia e integra el resultado en cada punto, observndose el

resultado final como un punto rojo (genes sobreexpresados en la condicin problema),verde (genes con menor expresin en la condicin problema) o amarillo-naranja (genescon expresin similar en las condiciones problema y de referencia)


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Confeccin del microarreglo

1. Colecciones de ExpressedSequences Tags (EST)

2. Bibliotecas de ADNc3. Secuencias genmicas

Procedencia de la informacin desecuencia para la elaboracin delos oligonucletidos o fragmentosde ADN que se fijarn al arreglo.


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Confeccin de arreglos

MICROARREGLOS

Siembra 0,25-1 nL/puntogenerando puntos de 100-150 m de dimetro.


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Confeccin de microarreglos


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El experimento tipo consiste en la comparacin de los niveles de expresin de

todos los genes de un organismo en dos estados celulares (condiciones).

Proceso

1. Aislar ARNm a partir de una muestra biolgica.

2. Convertir el ARNm en ADNc, utilizando una transcriptasa reversa.3. Marcar el ADNc con nucletidos fluorescentes (Cy5 y Cy3)4. Hibridar el ADNc marcado en el microarreglo.5. Detectar y cuantificar la fluorescencia utilizando un laser scanner confocal.6. Analizar los resultados.

Hibridacin en microarreglos


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Sntesis de ADNc


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Hibridacin en microarreglos

Cy5 Cy3

Cy5 = 633 nm Cy3 = 532 nm

Expresin de 1 > 2

21

Expresin de 1 = 2

Expresin de 1 < 2


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Microarreglo de levadura


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- RNA Sequencing- RNA Sequencing

- Secuenciacin del transcriptoma mediante los nuevos mtodos de secuenciacin(Next Generation Sequencing)

- Permite la obtencin de millones de secuencias: gran precisin estadstica

- Permite la deteccin de ARNm con maduracin alternativa o transcritos no descritos,mientras que los microarreglos slo permiten estudiar transcritos ya conocidos (lo quese ha depositado en el microarreglo)

-Puede realizarse con especies en las cuales no existe informacin previa de susecuencia genmica (si bien los resultados ptimos se consiguen cuando s estsecuenciado el genoma)


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PROTEOMA


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ESTUDIOS CON PROTENAS: SDS-PAGEESTUDIOS CON PROTENAS: SDS-PAGE

SDS-PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis. Permite separar protenas desnaturalizadasen un gel de poliacrilmida en funcin de su tamao.

Se utiliza acrilamida/bis 37:1. La mezcla que se indica espara un gel con un porcentaje de acrilamida del 12%, si esteporcentaje vara debe recalcularse la cantidad de

acrilamida/bis y de agua destilada a aadir.Mezcla para gel separador:

Acrilamida/bis 40% 9 ml

Tris-HCl 1,5 M pH 8,5 7.5 ml

Agua destilada 13 ml

10% SDS 300 l10% APS 100 l

TEMED 15 l

Mezcla para gel concentrante:

Acrilamida/bis 40% 1 ml

Tris-HCl 1M pH 6,8 1.25 ml

Agua destilada 7.6 ml

10% SDS 100 l

10% APS 35 l

TEMED 5 l


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SDS-PAGESDS-PAGE

Buffers y soluciones

Tampn de electroforesis:

25 mM Tris, 192 mM Glicina,0.1% SDS, pH 8.3

Tampn de muestra:

0.3 M TrisHCl, pH 6.8, 5%SDS, 50% glycerol, Azul de

bromofenol 0.01%, 2--mercaptoetanol 0,5%

Solucin de teido:

0.125% Coomassie Brilliant

Blue R-250, 50% Metanol, 10%cido Actico

Solucin de desteido:

50% Metanol, 10% cidoActico


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SDS-PAGESDS-PAGE

Tincin con Coomasie

Solucin de teido:

0.125% Coomassie BrilliantBlue R-250, 50% Metanol, 10%

cido Actico

Tincin con sales de plata

1- Etanol, cido actico, H2O (30:10:60)2- Etanol 30%

3- Nitrato de plata 0,1%4- NaCl, CuSO4, NH4OH, tiosulfato sdico5- cido actico 1%


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PAGEPAGE

PAGE: Gel de poliacrilamida nativo, sin SDS

- Cuando se pretende extraer una protena del gel de forma que conserve su actividad, o

bien cuando se quiere ensayar una actividad enzimtica en el propio gel, las protenasno deben desnaturalizarse. Para ello se llevan a cabo las siguientes modificaciones:

- No se aade SDS al gel, buffer de muestra ni buffer de electroforesis

- No se aade -mercaptoetanol al buffer de muestra para evitar la reduccinde los puentes disulfuro

- Las muestras no se calientan y la electroforesis se desarrolla a 4C

- Para ver actividad en el gel: ste se incuba con el sustrato adecuado hastaque aparezcan bandas de actividad

Debe tenerse muy en cuenta el pH del gel, ya que las protena entrarn y se movern enel gel slo si tienen carga neta negativa, y esto depende de su punto isoelctrico.

- Si se quiere recuperar la actividad de una protena despues de un SDS-PAGE existenprotocolos para renaturalizar la protena


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Western BlotWestern Blot

Deteccin de una protena mediante anticuerpos tras un SDS-PAGE


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Actividad de la enzimafosfatasa alcalinaconjugada con el anticuepo

secundario


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Reaccin cruzada con anticuerpos policlonales


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Cuantificacin de la protena tras un Western blot como mtodo dedeterminacin de la expresin del gen


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Tcnicas de ProtemicaTcnicas de Protemica

Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Isoelectroenfoque:

separacin de lasprotenas en funcinde su puntoisoelctrico: pH al cualla carga neta total de laprotena es 0

SDS-PAGE:separacin de lasprotenas en funcinde su tamao


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Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Pueden llegar a

detectarse todas lasprotenas que se estnexpresando en unaclula

Permite establecer

comparaciones entredos condiciones:sistema de anlisis deexpresin diferencial


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Mtodos de identificacin de las protenas

Las protenas separadas en un 2D (o purificadas por cualquier otro mtodo) pueden

analizarse para conocer su masa molecular, huella peptdica y secuencias de pptidosinternos en sistemas de espectrometra de masas; esto permite su identificacin.

- Huella peptdica: tras digestin con tripsina se obtiene la masa molecular precisa de todoslos pptidos resultantes, la cual se compara con la masa virtual obtenida de la informacinde los genes en la base de datos. Se lleva a cabo con un MALDI-TOF (Matrix-assisted laser

desorption ionization-time of flight)- Para completar la identificacin puede hacerse una microsecuenciacin de pptidosinternos con un LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem MS). Se obtienen secuenciasde longitud corta (6-14 aminocidos) que a menudo presentan ambigedades.

- Microsecuenciacin por Degradacin de Edman : Mtodo clsico de secuenciacin depptidos. Requiere al menos 0,5 g de protena. Es un mtodo ms directo, puedenobtenerse secuencias de hasta 20-25 aa, mayor fiabilidad.


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Huella peptdica


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Huella peptdica


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Huella peptdica


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SECUENCIACIN DEL ADNSECUENCIACIN DEL ADN


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Mtodo de Sanger o de los didesoxinucletidosMtodo de Sanger o de los didesoxinucletidos

- Se basa en la utilizacin de terminadores: molculas de didesoxinucletidos que alincorporarse a la cadena de ADN detienen la reaccin de polimerizacin.

U l d l 4 d i l id 1 did i l id


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- Una mezcla de los 4 desoxinucletidos con 1 didesoxinucletido concretoocasionar que la reaccin de polimerizacin se detenga al azar generando molculasde diferente tamao que se separan en un gel de acrilamida


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ANLISIS DE LA SECUENCIA DE

NUCLETIDOS

3-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-55-A-3

5-AGA-35-AGACCTGCA-3

5-AGACCTGCATTTA-35-AGACCTGCATTTATAA-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3

4 reacciones: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

ddATP

5-A-3

5-AGA-3

5-AGACCTGCA-3

5-AGACCTGCATTTA-3

5-AGACCTGCATTTATA-3

5-AGACCTGCATTTATAA-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3

ddATP

3-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5

5-AG-3

5-AGACCTG-3

5-AGACCTGCATTTATAAG-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCG-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCG-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAG-3

ddGTP


5-AGACCT-3

5-AGACCTGCAT-3

5-AGACCTGCATT-3

5-AGACCTGCATTT-3

5-AGACCTGCATTTAT-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAGT-3

ddTTP


5-AGAC-3

5-AGACC-3

5-AGACCTGC-3

5-AGACCTGCATTTATAAGC-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCC-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGC-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCC-3

ddCTP

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGC-3


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- Gel de acrilamida con reacciones de secuencia, se visualiza una autorradiografagenerada por la seal del istopo 35S-dATP


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- En la actualidad el proceso se hace de forma automtica. Los terminadores llevan

incorporados colorantes fluorescentes de diferente longitud de onda, que permitenhacer la reaccin en un nico tubo. Tras un proceso de electroforesis capilar undetector lser recoge la seal de cada terminador (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)


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Secuenciacin automtica


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S n i in p im lkin


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Secuenciacin shot-gun

Secuenciacin primer walking

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- Tenemos un fragmento parasecuenciar clonado en unvector plasmdico. Se lleva acabo la primera reaccin desecuencia con un primeruniversal. A partir de lasecuencia obtenida se diseaun segundo primerhacia elextremo 3 de la misma paraque haga de iniciador en lasiguiente reaccin, y as

sucesivamente hasta completarel fragmento a secuenciar

E i d i i


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Estrategias de secuenciacin en proyectos genoma

Shot-gun Clon a clon deuna genoteca


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Algunos sitios web relacionados con proyectos genoma

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