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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 7 7 , N o . 1 0 , p p . 6 1 1 4 - 6 1 1 8 , O c t o b e r 1 9 8 0I m m u n o l o g y

C e l l s u r f a c e a n t i g e n s o f human m a l i g n a n t m e l a n o m a : D e f i n i t i o n o fs i x a n t i g e n i c s y s t e m s w i t h m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s( s e r o l o g y / t u m o r a n t i g e n s / h y b r i d o m a s / g l y c o p r o t e i n s )

WOLFGANG G . D I P P O L D , KENNETH 0 . L L O Y D , Lucy T . C . L I , H I S A M I I K E D A , HERBERT F . O E T T G E N ,AND LLOYD J . OLDM e m o r i a l S l o a n - K e t t e r i n g C a n c e r C e n t e r , 1 2 7 5 Y o r k A v e n u e , Ne w Y o r k , New Y o r k 1 0 0 2 1C o n t r i b u t e d b y L l o y d J . O l d , J u l y 3 , 1 9 8 0ABSTRACT E i g h t e e n m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r es e l e c t e d f o r r e a c t i v i t y w i t h c e l l s u r f a c e a n t i g e n s o f t h e i m m u -n i z i n g h u m a n m e l a n o m a c e l l l i n e S K - M E L - 2 8 . S i x d i s t i n c t a n -t i g e n i c s y s t e m s w e r e d e f i n e d b y d i r e c t s e r o l o g i c a l a s s a y s a n da b s o r p t i o n t e s t s w i t h a p a n e l o f 4 1 c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m n o r m a la n d m a l i g n a n t h u m a n t i s s u e s . B i o c h e m i c a l a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a t t w o o f t h e a n t i g e n s a r e g l y c o p r o t e i n s w i t h m o l e c u l a r s i z e so f 9 5 , 0 0 0 a n d 1 5 0 , 0 0 0 d a l t o n s ( g p 9 5 a n d g p l S 0 ) . Two o t h e r a n -t i g e n i c s y s t e m s ( 0 5 a n d t h e R 2 4 g r o u p ) a r e a s s o c i a t e d w i t hh e a t - s t a b l e m o l e c u l e s h a v i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f g l y c o l i p i d s .T h e r e m a i n i n g t w o a n t i g e n s ( M 1 9 a n d R ) a r e h e a t l a b i l e , b u tm o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n h a s n o t b e e n p o s s i b l e . E a c h o f t h ea n t i g e n i c s y s t e m s h a s a d i s t i n c t i v e p a t t e r n o f d i s t r i b u t i o n o nv a r i o u s c e l l t y p e s , v a r y i n g f r o m a b r o a d r e p r e s e n t a t i o n t o a m o r er e s t r i c t e d o c c u r r e n c e . O s a p p e a r s t o b e a s p e c i e s a n t i g e n , b e i n gp r e s e n t o n v i r t u a l l y e v e r y h u m a n c e l l t y p e t e s t e d . g p 9 5 , g p l S 0 ,M 1 9 , a n d R 8 a r e f o u n d o n a c h a r a c t e r i s t i c p r o p o r t i o n o f m e l a -n o m a s , a s t r o c y t o m a s , a n d e p i t h e l i a l c a n c e r s a n d o n n o r m a lk i d n e y c e l l s . T h e a n t i g e n d e f i n e d b y t h e R 2 4 a n t i b o d y h a s t h em o s t r e s t r i c t e d d i s t r i b u t i o n o f a l l . R e a c t i v i t y i s f o u n d w i t hm e l a n o m a s a n d a s t r o c y t o m a s , w h e r e a s e p i t h e l i a l c e l l t y p e s ,f i b r o b l a s t s , a n d c e l l s o f h e m a t o p o i e t i c o r i g i n l a c k R 2 4 . A l t h o u g ho c c u r r e n c e o f g p 9 5 , g p l 5 0 , M 1 9 , a n d B 8 d i s t i n g u i s h e s a s m a l ls u b s e t o f m e l a n o m a s n o t e x p r e s s i n g t h e s e a n t i g e n s , R 2 4 i s f o u n do n a l l m e l a n o m a c e l l s .

T h i s c o m m u n i c a t i o n d e s c r i b e s t h e r e s u l t s o f o u r i n i t i a l a n a l y s i so f s u r f a c e a n t i g e n s o f h u m a n m a l i g n a n t m e l a n o m a b y u s i n gm o n o c l o n a l a n t i b o d i e s p r o d u c e d b y t h e h y b r i d o m a t e c h n o l o g yo f K o h l e r a n d M i l s t e i n ( 1 ) .MATERIALS AND ME T H O D S

T i s s u e C u l t u r e s . F o r d e r i v a t i o n a n d c u l t u r e o f m e l a n o m aa n d o t h e r c e l l l i n e s , s e e r e f s . 2 a n d 3 . M e l a n o c y t e s w e r e c u l t u r e df r o m p o s t m o r t e m s p e c i m e n s o f a d u l t h u m a n c h o r o i d b y A .H o u g h t o n .S e r o l o g i c a l P r o c e d u r e s . P r o t e i n A - m i x e d h e m a d s o r p t i o n( P A - M H A ) t e s t s a n d a b s o r p t i o n t e s t s w e r e p e r f o r m e d a s d e -s c r i b e d ( 2 , 3 ) . F o r a n t i - I g G a s s a y s ( I g G - M H A ) , i n d i c a t o r c e l l sw e r e p r e p a r e d b y c o n j u g a t i n g t h e i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o no f r a b b i t a n t i - m o u s e I g ( D A K O , C o p e n h a g e n ) t o h u m a n 0e r y t h r o c y t e s w i t h 0 . 0 1 c h r o m i u m c h l o r i d e .I m m u n i z a t i o n s . ( B A L B / c X C 5 7 B L / 6 ) F 1 f e m a l e m i c e w e r ei m m u n i z e d w i t h S K - M E L - 2 8 , a n e s t a b l i s h e d m e l a n o m a c e l ll i n e ( 2 ) , b y s e v e n i m m u n i z a t i o n s o v e r a 7 - m o i n t e r v a l w i t h i n -c r e a s i n g n u m b e r s o f c e l l s . F o r t h e i n i t i a l i m m u n i z a t i o n , 2 X 1 0 6m e l a n o m a c e l l s w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h F r e u n d ' sc o m p l e t e a d j u v a n t . T h e m i c e w e r e f u r t h e r i m m u n i z e d a t 4 - w ki n t e r v a l s b y i n t r a p e r i t o n e a l i n o c u l a t i o n o f m e l a n o m a c e l l s . T h ef i n a l i m m u n i z a t i o n c o n s i s t e d o f 5 0 X 1 0 6 m e l a n o m a c e l l s i n -j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y a n d i n t r a v e n o u s l y .

C e l l F u s i o n T e c h n i q u e . S p l e e n c e l l s f r o m a n i m m u n i z e dm o u s e ( 3 d a y s a f t e r t h e f i n a l i m m u n i z a t i o n ) w e r e m i x e d w i t hM O P C - 2 1 N S / 1 c e l l s a t a r a t i o o f 5 - 1 0 : 1 , a n d t h e c e l l m i x t u r e( a f t e r p e l l e t i n g b y c e n t r i f u g a t i o n ) w a s s u s p e n d e d i n 1 m l o f 4 2( w t / v o l ) p o l y e t h y l e n e g l y c o l i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e w i t h1 5 ( v o l / v o l ) d i m e t h y l s u l f o x i d e . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 1 m i na t r o o m t e m p e r a t u r e , 1 5 m l o f RPMI 1 6 4 0 m e d i u m w a s a d d e dd r o p w i s e o v e r a p e r i o d o f 3 m i n . A f t e r t h i s , t h e c e l l s w e r e c e n -t r i f u g e d a n d r e s u s p e n d e d i n c o m p l e t e RPMI 1 6 4 0 m e d i u mc o n t a i n i n g 1 0 f e t a l b o v i n e s e r u m ( s u p p l e m e n t e d w i t h s t r e p -t o m y c i n , p e n i c i l l i n , p y r u v a t e , a n d g l u t a m i n e ) a n d 0 . 2 mMh y p o x a n t h i n e , 8 0 MM a m i n o p t e r i n , a n d 3 2 MM t h y m i d i n e( H A T m e d i u m ) . A p p r o x i m a t e l y 2 X 1 0 5 c e l l s i n 1 m l o f HATm e d i u m w a s a d d e d t o w e l l s o f C o s t a r p l a t e s ( 2 4 w e l l s p e r p l a t e )w i t h a t t a c h e d f e e d e r c e l l s ( B A L B / c s p l e e n ) . A f t e r 1 0 d a y s i nHA T m e d i u m , c u l t u r e s w e r e f e d w i t h c o m p l e t e RPMI 1 6 4 0m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 2 mM h y p o x a n t h i n e a n d 3 2 ,M t h y m i -d i n e .C l o n i n g o f H y b r i d o m a s a n d P a s s a g e i n M i c e . A f t e r c e l lc o l o n i e s 1 - 2 mm i n d i a m e t e r f o r m e d , s a m p l e s o f s u p e r n a t a n t sw e r e h a r v e s t e d a n d a s s a y e d f o r a n t i b o d y b y u s i n g PA-MHAt e s t s a g a i n s t a n i n i t i a l s c r e e n i n g p a n e l o f 1 0 h u m a n c e l l l i n e s - 5m e l a n o m a c e l l l i n e s ( S K - M E L - 1 3 , - 2 7 , - 2 8 , - 3 1 , - 3 7 ) a n d 5n o n m e l a n o m a c e l l l i n e s ( S K - R C - 6 a n d - 7 , M E - 1 8 0 , EBV-B c e l l s ,a n d s l d n f i b r o b l a s t s ) . C e l l s f r o m w e l l s c o n t a i n i n g a n t i b o d y w e r ep a s s a g e d a t l o w c e l l d e n s i t y ( t w o t o f i v e c e l l s p e r w e l l ) a n d , i fa n t i b o d y c o n t i n u e d t o b e d e t e c t e d , t h e c e l l s w e r e c l o n e d ( o n ec e l l p e r w e l l ) t w o c o n s e c u t i v e t i m e s . C u l t u r e s o f c l o n e d h y b r i -d o m a s w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y i n t o n u / n u m i c e ( S w i s sb a c k g r o u n d ) a n d a l s o w e r e s t o r e d i n l i q u i d n i t r o g e n . S e r a f r o mm i c e w i t h p r o g r e s s i v e l y g r o w i n g t u m o r s w e r e c o l l e c t e d , s t o r e da t e i t h e r - 2 0 ' C o r - 7 0 ' C , a n d u s e d f o r s e r o l o g i c a l a n d b i o -c h e m i c a l a n a l y s i s . S e r a w e r e o b t a i n e d f r o m m i c e p r i o r t o t u m o ri n o c u l a t i o n , a n d o n l y m i c e w i t h l o w l e v e l s o f p r e e x i s t i n g n a t u r a la n t i b o d y a g a i n s t h u m a n c e l l s w e r e u s e d .I m m u n o p r e c i p i t a t i o n P r o c e d u r e s . S K - M E L - 2 8 c e l l s w e r el a b e l e d a s f o l l o w s : ( i ) s u r f a c e l a b e l i n g w i t h 1 2 5 I b y t h e l a c t o -

p e r o x i d a s e p r o c e d u r e ( 4 ) , ( i i ) m e t a b o l i c i n c o r p o r a t i o n o f[ a 5 S ] m e t h i o n i n e ( A m e r s h a m , 1 0 0 0 C i / m m o l ; 1 C i = 3 . 7 X 1 0 1b e c q u e r e l s ) b y u s i n g 2 5 0 M C i i n 1 0 m l o f m e t h i o n i n e - f r e em i n i m a l e s s e n t i a l m e d i u m c o n t a i n i n g 1 f e t a l b o v i n e s e r u mf o r 1 6 h r , a n d ( i i i ) m e t a b o l i c i n c o r p o r a t i o n o f [ 3 H ] g l u c o s a m i n e( N e w E n g l a n d N u c l e a r , 3 0 - 6 0 C i / m m o l ) b y u s i n g 1 5 0 , M C i i n1 0 m l o f m i n i m a l e s s e n t i a l m e d i u m w i t h 1 0 ( v o l / v o l ) f e t a lb o v i n e s e r u m f o r 7 2 h r . L a b e l e d c e l l s w e r e e x t r a c t e d w i t h 0 . 1N o n i d e t P - 4 0 i n 0 . 1 5 M N a C l / 0 . 0 1 M T r i s , pH 7 . 2 ( T r i s b u f f e r )c o n t a i n i n g 0 . 1 mM p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e , a n d t h es o l u t i o n w a s c l a r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 , 0 0 0 x g a n df i l t e r e d t h r o u g h a 0 . 2 2 - M m f i l t e r . E x t r a c t s o f [ s 5 S ] m e t h i o n i n e -T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g ec h a r g e p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d a d -v e r t i s e m e n t i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t et h i s f a c t .

6 1 1 4

A b b r e v i a t i o n s : HA T m e d i u m , h y p o x a n t h i n e / a m i n o p t e r i n / t h y m i d i n em e d i u m ; MHA, m i x e d h e m a d s o r p t i o n t e s t s ; P A - M H A , p r o t e i n A -m i x e d h e m a d s o r p t i o n t e s t s .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 ) 6 1 1 5l a b e l e d c e l l s w e r e a l s o f r a c t i o n a t e d o n a c o n c a n a v a l i n A -S e p h a r o s e ( P h a r m a c i a ) c o l u m n , a n d s a m p l e s e l u t e d w i t h 0 . 2M a - m e th y l D - m a nn o s i d e w e r e u s e d i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n t s . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n w a s c a r r i e d o u t b y m i x i n ga p o r t i o n o f t h e c e l l e x t r a c t ( 5 - 1 0 X 1 0 5 c p m ) w i t h 5 A s l o f m o u s ea n t i b o d y , 1 5 A I o f r a b b i t a n t i - m o u s e I g ( C a p p e l L a b o r a t o r i e s ,C o c h r a n v i l l e , P A ) s e r u m , a n d 5 0 0 A I o f 0 . 1 I N o n i d e t P - 4 0 i nT r i s b u f f e r w i t h 1 gamma g l o b u l i n - f r e e f e t a l b o v i n e s e r u m .[ B e f o r e u s e , c e l l e x t r a c t s w e r e p r e c l e a r e d w i t h 5 A l o f n o r m a lm o u s e s e r u m , 1 5 A l o f r a b b i t a n t i - m o u s e I g , a n d 3 0 0 1 A I o f 1 0( w t / v o l ) S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s s u s p e n s i o n ( N e w E n g l a n dE n z y m e C e n t e r , B o s t o n ) ] . I m m u n e c o m p l e x e s w e r e i s o l a t e db y u s i n g S . a u r e u s , a n d t h e l a b e l e d c o m p o n e n t s w e r e d e t e c t e db y N a D o d S 0 4 / p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d f l u o -r o g r a p h y a s d e s c r i b e d ( 5 ) . T w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ( 6 )w a s c a r r i e d o u t u s i n g a m i x t u r e o f a m p h o l y t e s , pH 3 . 5 - 1 0 . 0( L K B ) / p H 2 . 5 - 5 . 0 ( P h a r m a c i a ) , 3 : 2 ( v o l / v o l ) .S o l u b i l i z a t i o n a n d G e l F i l t r a t i o n o f S K - M E L - 2 8 A n t i g e n s .W a s h e d m o n o l a y e r c u l t u r e s o f S K - M E L - 2 8 c e l l s w e r e i n c u -b a t e d f o r 1 0 m i n a t 3 7 0 C w i t h 0 . 2 s o d i u m d e o x y c h o l a t e i n T r i sb u f f e r a n d 1 mM EDTA ( 2 0 m l p e r 4 9 0 - c m 2 r o l l e r f l a s k ) . C e l -l u l a r d e b r i s w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 0 X g f o r 1 0m i n , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s i n c u b a t e d f o r 5 m i n a t 3 7 0 C w i t hp a p a i n ( 0 . 8 u n i t / m l o f e x t r a c t , W o r t h i n g t o n ) , 0 . 4 M c y s t i n e ,a n d 1 mM E D T A . D i g e s t i o n w a s t e r m i n a t e d w i t h 0 . 4 M i o d o -a c e t a m i d e , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s c l a r i f i e d b y u l t r a c e n t r i f -u g a t i o n a t 1 0 0 , 0 0 0 X g f o r 1 h r . d i a l y z e d e x t e n s i v e l y a g a i n s t T r i sb u f f e r , a n d c o n c e n t r a t e d b y u s i n g a n A m i c o n p r e s s u r e s y s t e m( P M 1 0 m e m b r a n e ) . E x t r a c t s w e r e t h e n a p p l i e d t o S e p h a c r y lS - 2 0 0 c o l u m n s ( 8 6 X 2 6 c m ) e q u i l i b r a t e d w i t h T r i s b u f f e rc o n t a i n i n g 0 . 0 2 s o d i u m d e o x y c h o l a t e . E v e r y f i v e f r a c t i o n s( 2 m l e a c h ) w e r e p o o l e d , c o n c e n t r a t e d t o 1 m l , a n d t e s t e d f o ra n t i b o d y i n h i b i t o r y a c t i v i t y i n PA-MHA a n d I g G - M H A a s s a y s( s e e r e f . 7 f o r i n h i b i t i o n t e s t s a n d d e f i n i t i o n o f i n h i b i t o r yu n i t s ) .

RESULTSE i g h t e e n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d e t e c t i n g c e l l s u r f a c e a n t i g e n so f t h e i m m u n i z i n g m e l a n o m a c e l l l i n e S K - M E L - 2 8 w e r e a n a -l y z e d i n t h i s s e r i e s . A n t i b o d i e s r e a c t i n g w i t h H L A , I a , o r 2 ma n t i g e n s w e r e e x c l u d e d d u r i n g i n i t i a l s c r e e n i n g . T h e f i n e s e -r o l o g i c a l s p e c i f i c i t y o f t h e 1 8 a n t i b o d i e s w a s t e s t e d o n a p a n e lo f 4 1 e s t a b l i s h e d h u m a n c e l l l i n e s ( 1 6 m e l a n o m a s , 5 a s t r o c y -t o m a s , 1 3 e p i t h e l i a l c a n c e r s , 6 B - a n d T - c e l l l i n e s , a n d 1 f e t a lc e l l l i n e ) a n d o n e a r l y c u l t u r e s o f f e t a l b r a i n , a d u l t k i d n e y e p -i t h e l i u m , s k i n f i b r o b l a s t s , a n d m e l a n o c y t e s . I n a d d i t i o n t oc u l t u r e d c e l l s , w e e x a m i n e d e r y t h r o c y t e s , p e r i p h e r a l b l o o dl e u k o c y t e s , a n d p r e p a r a t i o n u o f f e t a l l i v e r , f e t a l b r a i n , a n d a d u l tb r a i n . I n m o s t c a s e s , s e r o l o g i c a l a n a l y s i s c o n s i s t e d o f b o t h d i r e c tt e s t s a n d a b s o r p t i o n t e s t s . ( C u l t u r e d m e l a n o c y t e s c o u l d n o t b eo b t a i n e d i n s u f f i c i e n t n u m b e r f o r a b s o r p t i o n t e s t s a n d p r e p a -r a t i o n s o f a d u l t h u m a n b r a i n a r e n o t s u i t a b l e f o r d i r e c t t e s t s . )E x c e p t f o r a n t i b o d y 0 5 ( s e e b e l o w ) , n o r e a c t i o n s w e r e o b -s e r v e d w i t h A , B , A B , o r 0 h u m a n e r y t h r o c y t e s i n d i r e c th e m a g g l u t i n a t i o n t e s t s a n d i n a b s o r p t i o n t e s t s . S h e e p e r y t h r o -c y t e s , l y o p h i l i z e d g u i n e a p i g k i d n e y , a n d p u r i f i e d p r e p a r a t i o n so f h u m a n b l o o d g r o u p s A , B , a n d 0 , Le g l y c o p r o t e i n s , a n dp n e u m o c o c c a l X I V p o l y s a c c h a r i d e w e r e n e g a t i v e i n a b s o r p t i o na n d i n h i b i t i o n t e s t s . T h e p o s s i b i l i t y t h a t f e t a l b o v i n e s e r u mc o m p o n e n t s o n c u l t u r e d c e l l s w e r e b e i n g d e t e c t e d w a s r u l e do u t b y g r o w i n g t a r g e t c e l l s i n h u m a n s e r u m f o r m o r e t h a n t h r e ep a s s a g e s b e f o r e t e s t i n g ; n o c h a n g e i n s e r o l o g i c a l r e a c t i v i t y w a so b s e r v e d .T h e s e s e r o l o g i c a l s t u d i e s , i n c o n j u n c t i o n w i t h i m m u n o p r e -c i p i t a t i o n a n a l y s i s o f r a d i o l a b e l e d c e l l e x t r a c t s a n d a n t i b o d y ,i n h i b i t i o n t e s t s w i t h s o l u b i l i z e d a n t i g e n , i n d i c a t e t h a t t h e 1 8m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d e t e c t 6 a n t i g e n i c s y s t e m s . Two o f t h e

A B1 2 0 -9 8 -

4 3 -x 2 8 -

1 7 -

II . . ._ < J8 7 6 5 4C D pH

1 2 0 ~ w9 8 -c~6 8 -

x 4 3 -t -8 -

1 7 -

6pH 5 4

F I G . 1 . A u t o r a d i o g r a m s o f [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e - l a b e l e d g l y c o p r o t e i n sf r o m l y s a t e s o f SK-MEL-28 i m m u n o p r e c i p i t a t e d b y m o n o c l o n a la n t i b o d y 1 1 2 ( A a n d B ) a n d b y m o n o c l o n a l a n t i b o d y N g ( C a n d D ) .( A a n d C ) N a D o d S O 4 p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . ( B a n d D )T w o - d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . M o l e c u l a rw e i g h t m a r k e r s : f l - g a l a c t o s i d a s e ( 1 2 0 , 0 0 0 ) , p h o s p h o r y l a s e ( 9 8 , 0 0 0 ) ,b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( 6 8 , 0 0 0 ) , o v a l b u m i n ( 4 3 , 0 0 0 ) , c o n c a n a v a l i nA ( 2 8 , 0 0 0 ) , a n d m y o g l o b i n ( 1 7 , 0 0 0 ) .s y s t e m s a r e g l y c o p r o t e i n s w i t h m o l e c u l a r s i z e s o f 9 5 , 0 0 0 d a l t o n s( g p 9 5 ) a n d 1 5 0 , 0 0 0 d a l t o n s ( g p I 5 0 ) , a n d t w o s y s t e m s h a v ec h a r a c t e r i s t i c s o f g l y c o l i p i d a n t i g e n s . T h e b i o c h e m i c a l n a t u r eo f t h e r e m a i n i n g t w o a n t i g e n i c s y s t e m s h a s n o t b e e n d e t e r -m i n e d .g p 9 5 A n t i g e n i c S y s t e m . S i x m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s [ I 1 2 ( y 2 b ) ,K 5 ( 7 1 ) , L l ( y i ) , L i o ( . l , M 1 7 - t i , a n d R i g ( i ) ] p r e c i p i t a t e d a9 5 , 0 0 0 - d a l t o n c o m p o n e n t f r o m l a b e l e d e x t r a c t s o f S K - M E L - 2 8( s e e F i g . 1 f o r 1 1 2 ) . G e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f a n t i g e ns o l u b i l i z e d b y l i m i t e d p a p a i n d i g e s t i o n o f S K - M E L - 2 8 s h o w e di n h i b i t o r y a c t i v i t y i n t h e s a m e m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e ( s e e F i g .2 f o r 1 1 2 a n d L I o ) . B e c a u s e t h e a n t i g e n d e t e c t e d b y t h e s e m o -n o c l o n a l a n t i b o d i e s b o u n d t o c o n c a n a v a l i n A a n d c o u l d b e l a -b e l e d b y s u r f a c e 1 2 5 I i o d i n a t i o n a n d b y m e t a b o l i c i n c o r p o r a t i o no f [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e o r [ 3 H ] g l u c o s a m i n e , i t w a s c o n c l u d e d t h a tt h e 9 5 , 0 0 0 - d a l t o n c o m p o n e n t i s a c e l l s u r f a c e g l y c o p r o t e i n( g p 9 5 ) . B o t h 1 1 2 a n d L i o p r e c i p i t a t e d g p 9 5 c o m p o n e n t s w i t ht h e s a m e i s o e l e c t r i c p o i n t , p I 5 . 0 ( s e e F i g . 1 f o r 1 1 2 ) , e v e n t h o u g ht h e y s h o w e d d i f f e r e n c e s i n t h e i r s e r o l o g i c a l r e a c t i v i t i e s ( s e e

1 . 00

C 0 . 5

m < m

12

I

3200 - F1600 8 00 : , , 4400 0200 *10

i

8/13/2019 6114.full

3/5

6 1 1 6 I m m u n o l o g y : D i p p o l d e t a l .b e l o w ) . T h e g p 9 5 d e t e r m i n a n t s d e t e c t e d b y t h e s e s i x m o n o -c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e h e a t l a b i l e .T h e g p 9 5 p h e n o t y p e o f o u r c e l l p a n e l a s a n a l y z e d w i t h I 1 2a n d L i o i s g i v e n i n T a b l e 1 . W i t h r e g a r d t o t h e o t h e r g p 9 5 -d e t e c t i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s , K 5 r e s e m b l e s I 1 2 , w h e r e a s L 1 ,M 1 7 , a n d R i 9 r e s e m b l e L i o i n t h e i r p a t t e r n o f r e a c t i v i t y . E l e v e nm e l a n o m a c e l l l i n e s s h o w e d s t r o n g r e a c t i v i t y ( t i t e r a n d s t r e n g t ho f r o s e t t e f o r m a t i o n ) w i t h t h e s i x m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d e -t e c t i n g g p 9 5 . S K - M E L - 4 0 w a s n o t r e a c t i v e w i t h I 1 2 , M 1 7 , a n dR 1 9 i n d i r e c t t e s t s . A b s o r p t i o n t e s t s i n d i c a t e d t h a t t h i s w a s n o td u e t o a b s e n c e o f a n t i g e n b u t r a t h e r t o a l o w l e v e l o f a n t i g e ne x p r e s s i o n , b e c a u s e S K - M E L - 4 0 c o u l d s p e c i f i c a l l y a b s o r b t h er e a c t i v i t y o f t h e s e a n t i b o d i e s . S K - M E L - 4 4 a l s o d e m o n s t r a t e dt h i s d i r e c t - t e s t - n e g a t i v e / a b s o r p t i o n - t e s t - p o s i t i v e p h e n o t y p ew i t h s e l e c t e d a n t i b o d i e s ( L 1 , L 1 o , M 1 7 , a n d R i 9 ) . T h r e e o t h e r

T a b l e 1 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g p 9 5 a n t i g e n i c s y s t e m *S e r o l o g i c t e s t sAb I 1 2 ( y 2 b ) Ab L l o ( . y l )T i t e r T i t e rC e l l s X 1 0 - 3 t A b s t x 1 0 - 3 t A b s t

M e l a n o m a sS K - M E L - 2 8 , 1 9 , 5 7 , 6 4 , 9 4 3 0 0 3 0 0 S K - M E L - 1 3 , 2 3 , 3 7 , 6 1 , 7 9 , 9 0 1 2 6 0 SK-MEL-40 - 6 0 SK-MEL-44 - - S K - M E L - 2 9 , 3 1 , 4 2 - - - -A s t r o c y t o m a sAS,U138MG,U373MG 1 2 1 2 A N , A J - - - -E p i t h e l i a l c a n c e r sR e n a l : S K - R C - 2 6 0 3 0 0S K - R C - 9 1 2 3 0 0 S K - R C - 6 - - 2S K - R C - 7 r e a s t : B T - 2 0 , MCF-7 - - - A l A b - - - -B l a d d e r : T - 2 4 6 0 6 0

O v a r i a n : S K - O V - 3 C o l o n : H T - 2 9 - C e r v i x : M E - 1 8 0 - - - L u n g : S K - L C - L L T e s t i c l e : S K - G R - 1 - - -

L y m p h o b l a s t o i d c e l l sT c e l l : M O L T 4 - T - 4 5 - -EBV-B c e l l : AH,BD,BT - - - N o r m a l c e l l sM e l a n o c y t e sF i b r o b l a s t s - - - K i d n e y e p i t h e l i u m : 1 , 2 6 0 3 0 0B r a i n 'L e u k o c y t e s - F e t a l f i b r o b l a s t s - -F e t a l b r a i nF e t a l l i v e r* A n t i b o d y ( A b ) s u b c l a s s w a s d e t e r m i n e d o n c u l t u r e s u p e r n a t a n t sb y d o u b l e d i f f u s i o n i n a g a r w i t h a n t i - I g h e a v y c h a i n s p e c i f i c r e a g e n t s( B i o n e t i c s , K e n s i n g t o n , M D ) . H e a t s t a b i l i t y o f a n t i g e n i c d e t e r m i -n a n t s : l a b i l e ( c e l l s w e r e e x p o s e d t o 1 0 0 C f o r 5 m i n a n d a s s a y e d f o rr e s i d u a l a n t i g e n a c t i v i t y i n a b s o r p t i o n t e s t s ) . - M r b y i m m u n o p r e c i -p i t a t i o n : 9 5 , 0 0 0 . Mr b y g e l f i l t r a t i o n : 7 0 , 0 0 0 - 1 0 0 , 0 0 0 ( i n h i b i t o r ya c t i v i t y w a s a l s o f o u n d i n t h e Mr 3 5 , 0 0 0 - 5 5 , 0 0 0 r e g i o n , s e e t e x t ) .t - , No r e a c t i o n i n d i r e c t t e s t s a t a s e r u m d i l u t i o n o f 1 : 5 0 .I A b s , a b s o r p t i o n t e s t s . S e e r e f . 3 f o r d e t a i l s . S e r u m ( d i l u t e d a c c o r d i n gt o e n d p o i n t ) w a s a b s o r b e d w i t h t h e i n d i c a t e d c e l l t y p e a n d t e s t e df o r r e s i d u a l a c t i v i t y f o r S K - M E L - 2 8 t a r g e t c e l l s . + , C o m p l e t e a b -s o r p t i o n ; i , p a r t i a l a b s o r p t i o n ; - , no a b s o r p t i o n . F o r d i r e c t t e s t s w i t h EBV-B c e l l s , P A- M HA i n d i c a t o r c e l l s w e r eu s e d .

m e l a n o m a l i n e s ( S K - M E L - 2 9 , - 3 1 , a n d - 4 2 ) a p p e a r e d t o l a c ka n y g p 9 5 e x p r e s s i o n a s i n d i c a t e d b y b o t h d i r e c t t e s t s a n d a b -s o r p t i o n t e s t s . C o m p a r a b l e a n a l y s i s o f o t h e r h u m a n c e l l t y p e ss h o w e d t h a t g p d e t e r m i n a n t s c a n b e d e m o n s t r a t e d o n a w i d er a n g e o f c e l l t y p e s , b o t h r o r m a l a n d m a l i g n a n t . A s i n t h e c a s eo f m e l a n o m a c e l l l i n e s , l e v e l s o f g p 9 5 r a n g e d f r o m e a s i l y d e -t e c t a b l e ( e . g . , T - 2 4 a n d n o r m a l k i d n e y e p i t h e l i u m ) t o d e t e c t a b l eo n l y b y a b s o r p t i o n t e s t s ( e . g . , H T - 2 9 ) t o n o t d e m o n s t r a b l e ( e . g . ,A l A b a n d S K - O V - 3 ) .A l t h o u g h t h e o v e r a l l p a t t e r n o f s e r o l o g i c a l r e a c t i v i t y o f t h es i x d i f f e r e n t m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d e t e c t i n g g p 9 5 w a s s i m i l a r ,t h e r e w e r e e v i d e n t d i f f e r e n c e s . F o r i n s t a n c e , t h e g p 9 5 d e t e r -m i n a n t d e t e c t e d b y L 1 0 o n s e v e r a l e p i t h e l i a l c a n c e r s i n a b -s o r p t i o n t e s t s w a s n o t d e t e c t e d b y I 1 2 . F u r t h e r i n d i c a t i o n t h a tt h e s p e c i f i c i t i e s o f I 1 2 a n d L j o w e r e d i f f e r e n t c o m e s f r o ma n t i b o d y i n h i b i t i o n t e s t s w i t h s o d i u m d e o x y c h o l a t e / p a p a i n -s o l u b i l i z e d p r e p a r a t i o n s f r o m S K - M E L - 2 8 . F r a c t i o n a t i o n o f t h i sm a t e r i a l b y g e l f i l t r a t i o n s h o w e d t h a t i n h i b i t o r y a c t i v i t y f o r 1 1 2w a s c o n f i n e d t o o n e p e a k , w h e r e a s i n h i b i t o r y a c t i v i t y f o r L 1 0w a s f o u n d i n t w o m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e s ( F i g . 2 ) . T h e s e r e s u l t ss u g g e s t t h a t a t l e a s t t w o d i s t i n c t d e t e r m i n a n t s o n t h e g p 9 5m o l e c u l e a r e r e c o g n i z e d b y t h i s s e r i e s o f m o n o c l o n a l a n t i -b o d i e s .g p l 5 O A n t i g e n i c S y s t e m . F o u r m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s[ N 9 ( - l ) , R 2 3 ( l ) , Q 1 4 ( y l ) , a n d Q 2 4 ( , ) ] p r e c i p i t a t e d a 1 5 0 , 0 0 0 -d a l t o n c o m p o n e n t f r o m l a b e l e d e x t r a c t s o f S K - M E L - 2 8 ( s e e F i g .1 f o r N g ) . A f i f t h a n t i b o d y t h a t d i d n o t h a v e p r e c i p i t a t i n g a c -t i v i t y [ J l l y l ] i s p r o v i s i o n a l l y i n c l u d e d i n t h i s g r o u p b e c a u s e o fi t s r e l a t e d s e r o l o g i c a l r e a c t i v i t y . G e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h yo f a n t i g e n s o l u b i l i z e d b y l i m i t e d p a p a i n d i g e s t i o n o f S K -MEL-28 s h o w e d i n h i b i t o r y a c t i v i t y i n t h e r a n g e 1 1 0 , 0 0 0 -1 5 0 , 0 0 0 d a l t o n s ( s e e F i g . 2 f o r N 9 ) . S u r f a c e l a b e l i n g w i t h 1 2 5 I ,m e t a b o l i c l a b e l i n g w i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e a n d [ 8 H ] g l u c o s a m i n e ,a n d c o n c a n a v a l i n A b i n d i n g i n d i c a t e t h a t t h e 1 5 0 , 0 0 0 - d a l t o nc o m p o n e n t i s a c e l l s u r f a c e g l y c o p r o t e i n ( g p 1 5 0 ) . B o t h N 9 a n dQ 2 4 p r e c i p i t a t e d g p l 5 0 c o m p o n e n t s w i t h t h e same i s o e l e c t r i cp o i n t , p I 4 . 2 ( s e e F i g . 1 f o r N 9 ) , e v e n t h o u g h t h e y s h o w e d d i f -

f e r e n c e s i n t h e i r s e r o l o g i c a l r e a c t i v i t i e s ( s e e b e l o w ) . T h e g p l 5 0d e t e r m i n a n t s d e t e c t e d b y t h e s e f i v e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r eh e a t l a b i l e .T h e g p 1 5 0 p h e n o t y p e o f o u r c e l l p a n e l , a s a n a l y z e d w i t h N 9a n d Q 2 4 , i s g i v e n i n T a b l e 2 . R 2 3 a n d Q 1 4 r e s e m b l e d N 9 i n t h e i rp a t t e r n o f r e a c t i v i t y . T h e d i s t r i b u t i o n o f g p l 5 0 d e t e r m i n a n t si s c l e a r l y d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h a t o f g p 9 5 ( e . g . , S K - M E L - 2 9a n d - 4 2 , t w o m e l a n o m a c e l l l i n e s t h a t a r e g p 9 5 - n e g a t i v e , a r es t r o n g l y g p l 5 0 - p o s i t i v e ; S K - M E L - 7 9 , w h i c h i s g p l 5 O - n e g a t i v e ,i s s t r o n g l y g p 9 5 - p o s i t i v e ) . g p l 5 0 d e t e r m i n a n t s w e r e f o u n d o na w i d e r a n g e o f o t h e r c e l l t y p e s o f n o r m a l a n d m a l i g n a n t o r i g i n .A s w i t h g p 9 5 , l e v e l s o f g p l 5 0 o n d i f f e r e n t c e l l t y p e s ( e v e n o nt h o s e d e r i v e d f r o m t h e s a m e c e l l l i n e a g e ) v a r i e d f r o m e a s i l yd e m o n s t r a b l e i n d i r e c t t e s t s t o d e m o n s t r a b l e o n l y b y a b s o r p t i o nt o n o t d e t e c t a b l e . A b s o r p t i o n a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t a t l e a s t twod i s t i n g u i s h a b l e d e t e r m i n a n t s w e r e r e c o g n i z e d o n g p l 5 0 b y t h i ss e r i e s o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e g p l 5 0 d e t e r m i n a n t d e -t e c t e d b y N 9 , R 2 3 , a n d Q 1 4 a p p e a r e d t o b e c l o s e l y r e l a t e d o ri d e n t i c a l a n d c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h a t d e t e c t e d b y Q 2 4o n t h e b a s i s o f a b s o r p t i o n t e s t s w i t h M E - 1 8 0 , S K - O V - 3 , a n dS K - L C - L L e p i t h e l i a l c a n c e r l i n e s .M j 9 a n d R 8 A n t i g e n i c S y s t e m s . T h e r e a c t i v i t y o f M l g ( i ) a n dR ( . l ) i n d i r e c t s e r o l o g i c a l t e s t s a n d a b s o r p t i o n a n a l y s i s ( T a b l e3 ) d e f i n e d t w o d i s t i n c t a n t i g e n i c s y s t e m s u n r e l a t e d t o g p l 5 0 ,g p 9 5 , o r t h e o t h e r s u r f a c e a n t i g e n s d e t e c t e d b y o u r p r e s e n tb a t t e r y o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t sr e c o g n i z e d b y M 1 9 a n d R 8 w e r e h e a t l a b i l e . I n t h e c a s e o f M 1 g ,g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f a n t i g e n s o l u b i l i z e d b y l i m i t e dp a p a i n d i g e s t i o n o f S K - M E L - 2 8 s h o w e d i n h i b i t o r y a c t i v i t y f o rM 1 9 a n t i b o d y i n t h e 5 0 , 0 0 0 - 7 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 )

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4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 ) 6 1 1 7T a b l e 2 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g p 1 5 0 a n t i g e n i c s y s t e m * -

S e r o l o g i c a l t e s t sAb N 9 ( , i ) Ab Q 2 4 ( y )T i t e r T i t e rC e l l s X 1 0 - 3 t A b s t X 1 0 - 3 t A b s tM e l a n o m a s

S K - M E L - 2 8 , 1 3 , 1 9 , 2 3 , 2 9 ,3 7 , 4 0 , 4 2 , 5 7 , 6 4 , 9 0 . 9 4 1 5 0 0 1 5 0 0 SK-MEL-61 6 0 6 0 SK-MEL-44 - - -S K - M E L - 3 1 , 7 9 - - - -A s t r o c y t o m a sAS,U138MG 1 5 0 0 1 5 0 0 U373MG 3 0 0 6 0

N 6 0 - AJ E p i t h e l i a l c a n c e r sR e n a l : S K - R C - 6 3 0 0 6 0S K - R C - 2 , 7 - S K - R C - 9 - - - -B r e a s t : B T - 2 0 , M C F - 7 , A l A b B l a d d e r : T - 2 4 6 0 6 0 O v a r i a n : S K - O V - 3 - C o l o n : H T - 2 9 6 0 6 0 C e r v i x : ME-180 - L u n g : S K - L C - L L -T e s t i c l e : S K - G R - 1 - L y m p h o b l a s t o i d c e l l sT c e l l : MOLT 4 T - 4 5 - -EBV-B c e l l k : BD,BT - -

AH - - -N o r m a l c e l l s

M e l a n o c y t e s 1 1F i b r o b l a s t s 2 0 . 5 K i d n e y e p i t h e l i u m : 1 , 2 1 5 0 0 1 5 0 0B r a i n L e u k o c y t e sF e t a l f i b r o b l a s t s - - F e t a l b r a i n 3 0 0 6 0 F e t a l l i v e r * M e t h o d s , l a y o u t , a n d f o o t n o t e s a s i n T a b l e 1 . H e a t s t a b i l i t y : l a b i l e .Mr b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n : 1 5 0 , 0 0 0 . Mr b y g e l f i l t r a t i o n1 1 0 , 0 0 0 - 1 5 0 , 0 0 0 .No i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f s o l u b i l i z e d a n t i g e n w a s f o u n d w i t h R ga n t i b o d y . A s y e t , i t h a s n o t b e e n p o s s i b l e t o i m m u n o p r e c i p i t a t ea n t i g e n f r o m r a d i o l a b e l e d e x t r a c t s o f S K - M E L - 2 8 w i t h e i t h e rM 1 9 o r R 8 a n t i b o d i e s .0 5 A n t i g e n i c S y s t e m . T h e d e t e r m i n a n t r e c o g n i z e d b y 0 5 ( O )w a s p r e s e n t ( i n v a r i a b l e a m o u n t s ) o n e v e r y h u m a n c e l l t y p et e s t e d , i n c l u d i n g e r y t h r o c y t e s . T h e 0 5 d e t e r m i n a n t w a s h e a ts t a b l e . No a n t i g e n i c a c t i v i t y c o u l d b e d e t e c t e d i n s o l u b l e e x -t r a c t s e i t h e r b y a n t i b o d y i n h i b i t i o n t e s t s o r b y i m m u n o p r e c i -p i t a t i o n .A n t i g e n s D e f i n e d b y t h e R 2 4 M o n o c l o n a l A n t i b o d y G r o u p .F o u r m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s [ K 9 ( 7 M ) , I 2 4 ( - y m ) , C s ( 3 ) , a n d R 2 4 ( . 3 ) ]d e f i n e d a n t i g e n s t h a t w e r e h e a t s t a b l e , a n d i n i t i a l b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n i n d i c a t e d t h a t g l y c o l i p i d d e t e r m i n a n t s w e r ei n v o l v e d . T h e y a r e g r o u p e d t o g e t h e r b e c a u s e o f t h e i r r e l a t e ds e r o l o g i c a l r e a c t i v i t y , a l t h o u g h i t i s n o t k n o w n w h e t h e r t h e yd e t e c t a s i n g l e d e t e r m i n a n t o r a f a m i l y o f d e t e r m i n a n t s . T h ec e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f a n t i g e n s d e t e c t e d b y t h e R 2 4 g r o u p ( s e eT a b l e 4 f o r K g a n d R 2 4 ) w a s m o r e r e s t r i c t e d t h a n t h e d i s t r i b u -t i o n o f g p 9 5 , g p l 5 O , R 8 , M 1 9 , a n d 0 5 a n t i g e n s . M e l a n o m a s a n da s t r o c y t o m a s w e r e t h e m o s t r e a c t i v e c e l l t y p e s , w i t h o t h e r c e l l se x p r e s s i n g l i t t l e o r n o a n t i g e n . T h e v i r t u a l a b s e n c e o f t h e s ea n t i g e n s o n e p i t h e l i a l c a n c e r s w a s p a r t i c u l a r l y s t r i k i n g . T h e

T a b l e 3 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e M 1 9 a n d R 8 a n t i g e n i c s y s t e m s *S e r o l o g i c a l S e r o l o g i c a lt e s t s t e s t sAb M l 9 ( 1 ) Ab RT i t e r T i t e rC e l l s x 1 0 - 3 t A b s t C e l l s X 1 0 - 3 t A b s t

M e l a n o m a sS K - M E L - 2 8 , 6 4 1 5 0 0S K - M E L - 2 3 , 2 9 , 3 7 6 0S K - M E L - 4 4 , 5 7 , 6 1 ,9 0 , 9 4 1 2S K - M E L - 3 1 , 7 9 -SK-MEL-1 3 , 1 9 , 4 0 , 4 2 -

A s t r o c y t o m a sA S , U 1 3 8 M G ,U373MG 6 0A N , A J E p i t h e l i a l c a n c e r sR e n a l : S K - R C - 6 , 9 6 0S K - R C - 2 -B r e a s t : A l A b ,

B T - 2 0 , MCF-7 -B l a d d e r : T - 2 4 O v a r i a n : S K - O V - 3 1 2C o l o n : H T - 2 9 C e r v i x : ME-180 L u n g : S K - L C - L L T e s t i c l e : S K - G R - 1 L y m p h o b l a s t o i d c e l l sT - c e l l MOLT 4 , T - 4 5EBV-B c e l l :BD,BTAH N o r m a l c e l l s

M e l a n o c y t e s 1F i b r o b l a s t s 1 2K i d n e y e p i t h e l i u m :1 , 2 1 2B r a i nL e u k o c y t e sF e t a l f i b r o b l a s t s 2F e t a l b r a i nF e t a l l i v e r

M e l a n o m a s S K - M E L - 1 9 , 2 8 , 4 2 , 9 0 1 5 0 0S K - M E L - 1 3 , 6 4 6 0 S K - M E L - 2 3 , 5 7 , 7 9 1 2 S K - M E L - 2 9 , 3 7 , 4 0 0 . 5S K - M E L - 3 1 , 6 1 -- S K - M E L - 4 4 , 9 4 -A s t r o c y t o m a sAS,U138MG 2 A J , A N , U 3 7 3 M G - E p i t h e l i a l c a n c e r s R e n a l : S K - R C - 2 , 6 ,7 , 9 6 0B r e a s t : A l A b ,- B T - 2 0 , MCF-7 -- B l a d d e r : T - 2 4 6 0

O v a r i a n : S K - O V - 3 C o l o n : HT-29 C e r v i x : ME-180 - L u n g : S K - L C - L L - T e s t i c l e : S K - G R - 1 L y m p h o b l a s t o i d c e l l s T - c e l l : MOLT 4 , T - 4 5EBV-B c e l l : BD,BT - AH N o r m a l c e l l s

M e l a n o c y t e s F i b r o b l a s t sK i d n e y e p i t h e l i u m :1 , 2 B r a i n L e u k o c y t e s F e t a l f i b r o b l a s t s F e t a l b r a i n F e t a l l i v e r

0 . 1

0 . 5

* M e t h o d s , l a y o u t , a n d f o o t n o t e s a s i n T a b l e 1 . H e a t s t a b i l i t y : l a b i l e .Mr o f M 1 9 b y g e l f i l t r a t i o n : 5 0 , 0 0 0 - 7 0 , 0 0 0 .a n t i g e n d e f i n e d b y t h e R 2 4 a n t i b o d y w a s t h e m o s t r e s t r i c t e d o fa l l , r e a c t i v i t y w i t h c e l l l i n e s b e i n g c o n f i n e d t o m e l a n o m a s a n dt w o o f f i v e a s t r o c y t o m a s . F u r t h e r s t u d i e s a r e n e e d e d t o d e t e r -m i n e t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e w e a k r e a c t i o n s o b s e r v e d w i t hm e l a n o c y t e s a n d t h e p a r t i a l a b s o r p t i o n s o b s e r v e d w i t h n o r m a lb r a i n .

DISCUSSIONNo w t h a t t h e t e c h n i c a l a s p e c t s o f g e n e r a t i n g h y b r i d o m a s a n ds c r e e n i n g f o r a n t i b o d y a c t i v i t y a r e b e c o m i n g r e l a t i v e l ys t r a i g h t f o r w a r d , t h e m a j o r c h a l l e n g e c o n f r o n t i n g t h e c e l l s u r -f a c e s e r o l o g i s t i s i n d e f i n i n g t h e s p e c i f i c i t y o f t h e r e s u l t i n gm o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . T h i s t a s k i s g r e a t l y s i m p l i f i e d i f t h ea n t i b o d i e s b e i n g s o u g h t a r e d i r e c t e d a g a i n s t a n t i g e n i c s y s t e m st h a t h a v e b e e n p r e v i o u s l y d e f i n e d b y c o n v e n t i o n a l i m m u n es e r a . I n t h e c a s e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o n e w a n t i g e n i cs y s t e m s t h a t a r e n o t a l l o a n t i g e n i c , o n e o f t h e k e y p r o b l e m s i st o d i s t i n g u i s h p r e s e n c e v s . a b s e n c e o f a n t i g e n f r o m h i g h v s . l o we x p r e s s i o n o f a n t i g e n , a n d t h i s p r o b l e m i s o f p a r t i c u l a r c o n c e r nt o t h e t u m o r i m m u n o l o g i s t i n h i s s e a r c h f o r t u m o r - s p e c i f i c

I m m u n o l o g y : D i p p o l d e t a l .

8/13/2019 6114.full

5/5

6 1 1 8 I m m u n o l o g y : D i p p o l d e t a l .T a b l e 4 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e R 2 4 a n t i g e n i c s y s t e m *

S e r o l o g i c a l t e s t sAb K 9 ( I g M ) Ab R 2 4 ( y 3 )T i t e r T i t e rC e l l s X 1 0 - 3 t A b s t X 1 0 - 3 t A b s tM e l a n o m a sS K - M E L - 2 8 , 1 9 , 2 94 2 , 5 7 , 6 4 , 9 4 2 5 2 5

S K - M E L - 1 3 , 3 7 , 4 0 , 9 0 2 2 5 S K - M E L - 2 3 , 4 4 , 7 9 1 5 S K - M E L - 3 1 , 6 1 - 1 A s t r o c y t o m a sAJ 5 5A N - AS,U138MG,U373MG E p i t h e l i a l c a n c e r sR e n a l : S K - R C - 7

S K - R C - 2 , 6 , 9 - - - -B r e a s t : B T - 2 0 , M C F - 7 , A l A b B l a d d e r : T - 2 4 O v a r i a n : S K - O V - 3 C o l o n : H T - 2 9 C e r v i x : M E - 1 8 0 L u n g : S K - L C - L L T e s t i c l e : S K - G R - 1 - - - -

L y m p h o b l a s t o i d c e l l sT - c e l l s : M O L T 4 -T - 4 5 - -NALL - - - -EBV-B c e l l k AH,BD,BT - - - -N o r m a l c e l l sM e l a n o c y t e s 0 . 1F i b r o b l a s t s - 1K i d n e y e p i t h e l i u m : 1 , 2

B r a i n L e u k o c y t e s F e t a l f i b r o b l a s t s - -F e t a l b r a i n F e t a l l i v e r * M e t h o d s , l a y o u t , a n d f o o t n o t e s a s i n T a b l e 1 . H e a t s t a b i l i t y : s t a b l e .a n t i g e n s . W h a t h a s b e e n s h o w n r e p e a t e d l y w i t h c o n v e n t i o n a li m m u n e s e r a o r n a t u r a l l y o c c u r r i n g a n t i b o d i e s i n a n i m a l a n dh u m a n s y s t e m s i s t h a t d i r e c t s e r o l o g i c a l t e s t s a r e f r e q u e n t l y l e s ss e n s i t i v e t h a n a b s o r p t i o n t e s t s i n t y p i n g c e l l s f o r p r e s e n c e o ra b s e n c e o f a n t i g e n . C e l l s t h a t d o n o t r e a c t w i t h a p a r t i c u l a ra n t i b o d y m a y n e v e r t h e l e s s s p e c i f i c a l l y a b s o r b a n t i b o d y r e a c -t i v i t y , i n d i c a t i n g t h a t c e l l s d o e x p r e s s a n t i g e n b u t n o t a t a s u f -f i c i e n t l e v e l t o s c o r e p o s i t i v e i n d i r e c t t e s t s . A n u m b e r o f e x -a m p l e s o f t h i s d i r e c t - t e s t - n e g a t i v e / a b s o r p t i o n - t e s t - p o s i t i v ep h e n o t y p e h a v e b e e n f o u n d i n t h e p r e s e n t a n a l y s i s o f m o n o -c l o n a l a n t i b o d i e s t o m e l a n o m a c e l l s . T h u s , a l t h o u g h d i r e c t t e s t s

w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d y a r e u s e f u l i n i d e n t i f y i n g q u a n t i t a t i v ed i f f e r e n c e s a m o n g d i f f e r e n t c e l l p o p u l a t i o n s , t h e y c a n n o t b er e l i e d o n t o e s t a b l i s h t h e a n t i g e n i c p h e n o t y p e o f n o n r e a c t i v ec e l l s . F o r t h i s p u r p o s e , a b s o r p t i o n t e s t s a r e o f g r e a t v a l u e .T h e 1 8 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n a l y z e d i n t h i s s t u d y i d e n t i f y6 d i s t i n g u i s h a b l e s y s t e m s o f m e l a n o m a s u r f a c e a n t i g e n s . Twoo f t h e s e a n t i g e n i c s y s t e m s ( g p 9 5 a n d g p l 5 0 ) a r e g l y c o p r o t e i n s ,a s j u d g e d b y l e c t i n b i n d i n g a n d r a d i o l a b e l i n g w i t h a m i n o a c i da n d c a r b o h y d r a t e p r e c u r s o r s . A n o t h e r , t h e R 2 A a n t i g e n i c s y s t e m ,h a s p r o p e r t i e s o f a g l y c o l i p i d , a s i n d i c a t e d b y h e a t s t a b i l i t y a n da n t i b o d y i n h i b i t i o n t e s t s w i t h g l y c o l i p i d f r a c t i o n s o f r e a c t i v ec e l l s ( C . P u k e l , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e o t h e r t h r e e a n -

t i g e n s a r e n o t a s w e l l c h a r a c t e r i z e d , b u t i n i t i a l i n d i c a t i o n s a r et h a t 0 5 i s a g l y c o l i p i d a n t i g e n . E a c h o f t h e s e a n t i g e n i c s y s t e m sh a s a d i s t i n c t i v e p a t t e r n o f e x p r e s s i o n o n d i f f e r e n t c e l l t y p e s .S o m e a r e w i d e l y r e p r e s e n t e d , w h e r e a s o t h e r s s h o w c h a r a c t e r -i s t i c s o f m o r e r e s t r i c t e d d i f f e r e n t i a t i o n a n t i g e n s . O f p a r t i c u l a ri n t e r e s t a r e t h o s e t h a t d e f i n e s u b s e t s o f m e l a n o m a s ( g p 9 5 ,g p l 5 0 , M i 9 , R 8 ) a n d t h o s e t h a t s h o w a h i g h d e g r e e o f r e s t r i c t i o nt o m e l a n o m a ( e . g . , R 2 4 ) . N o n e , h o w e v e r , c a n b e c o n s i d e r e dm e l a n o m a - s p e c i f i c , a s e v e n R 2 4 i s f o u n d o n a s t r o c y t o m a s a n dm a y a l s o b e p r e s e n t i n n o r m a l b r a i n a n d o n m e l a n o c y t e s . B e -c a u s e o f t h e d i f f e r e n t s e r o l o g i c a l m e t h o d o l o g y a n d t h e u s e o fd i f f e r e n t c e l l p a n e l s , i t i s n o t p o s s i b l e t o m a k e a n y d i r e c t c o m -p a r i s o n s b e t w e e n t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d e f i n e d i n t h i sr e p o r t a n d t h o s e d e s c r i b e d b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s i n s t u d i e s o fm e l a n o m a ( 8 - 1 0 ) . F o r t h i s , a n e x c h a n g e o f r e a g e n t s w i l l b en e c e s s a r y . H o w e v e r , i t a p p e a r s l i k e l y t h a t t h e p 9 7 m e l a n o m as u r f a c e a n t i g e n d e s c r i b e d b y W o o d b u r y e t a l . ( 1 0 ) i s r e l a t e dt o t h e g p 9 5 a n t i g e n i d e n t i f i e d b y s i x o f o u r m o n o c l o n a l a n t i -b o d i e s .C o n t i n u e d a p p l i c a t i o n o f h y b r i d o m a m e t h o d o l o g y s h o u l dr e s u l t i n a c o m p r e h e n s i v e p i c t u r e o f t h e s u r f a c e a n t i g e n i cs t r u c t u r e o f m e l a n o m a a n d , i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e a n a l y s i s o fs o m a t i c c e l l h y b r i d s , p r o v i d e w a y s t o d e f i n e t h e g e n e t i c d e -

t e r m i n a n t s i n v o l v e d i n t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e m e l a n o m a c e l ls u r f a c e . O f c o u r s e , a c e n t r a l a i m o f t h e a n a l y s i s i s t o d e t e r m i n ew h e t h e r t h e m o u s e r e c o g n i z e s a n t i g e n s t h a t a r e m e l a n o m a -s p e c i f i c . A n o t h e r a i m i s t o s e e w h e t h e r m o u s e m o n o c l o n a l a n -t i b o d i e s a r e f o r m e d a g a i n s t m e l a n o m a a n t i g e n s t h a t h a v e b e e nd e f i n e d b y h u m a n s e r u m , s u c h a s A U ( 2 ) , A H ( 1 1 ) , o r M e l 1( 1 2 ) . W h e n t e c h n i q u e s f o r t h e p r o d u c t i o n o f h u m a n m o n o c l o n a la n t i b o d i e s a r e p e r f e c t e d , c o m p a r a b l e q u e s t i o n s c a n b e a s k e da b o u t t h e f u l l r a n g e o f m e l a n o m a a n t i g e n s t h a t a r e r e c o g n i z e db y h u m a n s .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s a n d c o n t r a c t s f r o m t h e N a t i o n a lC a n c e r I n s t i t u t e ( C A 0 8 7 4 8 , C A 1 9 7 6 5 - 0 3 , C A 2 1 4 4 5 , a n d C B 7 4 1 2 4 )a n d t h e O l i v e r S . a n d J e n n i e R . D o n a l d s o n C h a r i t a b l e T r u s t . W . G . D .i s r e c i p i e n t o f a F e l l o w s h i p f r o m t h e D e u t s c h e F o r s c h u n g s g e m e i n -

s c h a f t .1 . K o h l e r , G . & M i l s t e i n C . ( 1 9 7 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 5 6 , 4 9 5 -4 9 7 .2 . C a r e y , T . E . , T a k a h a s h i , T . , R e s n i c k , L . A . , O e t t g e n , H . F . O l d ,L . J . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 , 3 2 7 8 - 3 2 8 2 .3 . U e d a , R . , S h i k u , H . , P f r e u n d s c h u h , M . , T a k a h a s h i , T . , L i , L . T .C . , W h i t m o r e , W . F . , O e t t g e n , H . F . & O l d , L . J . ( 1 9 7 9 ) J . E x p .M e d . 1 5 0 , 5 6 4 - 4 7 9 .4 . P h i l l i p s , D . R . & M o r r i s o n , M . ( 1 9 7 1 ) B i o c h e m i s t r y 1 0 , 1 7 6 6 -1 7 7 1 .5 . L l o y d , K . O . , T r a v a s s o s , L . R . , T a k a h a s h i , T . & O l d , L . J . ( 1 9 7 9 )J . N a t l . C a n c e r I n s t . 6 3 , 6 2 3 - 6 3 4 .6 . O ' F a r r e l l , P . H . ( 1 9 7 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 0 , 4 0 0 7 - 4 0 2 1 .7 . C a r e y , T . E . , L l o y d , K . O . , T a k a h a s h i , T . , T r a v a s s o s , L . R . & O l d ,L . J . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 6 , 2 8 9 8 - 2 9 0 2 .

8 . K o p r o w s k i , H . , S t e p l e w s k i , Z . , H e r l y n , D . & H e r l y n , M . ( 1 9 7 8 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 5 , 3 4 0 - 3 4 0 9 .9 . Y e h , M . - Y . , H e l l s t r o m , I . , B r o w n , J . P . , W a r n e r , G . A . , H a n s e n ,J . A . & H e l l s t r 6 m , K . E . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ,2 9 2 7 - 2 9 3 1 .1 0 . W o o d b u r y , R . C . , B r o w n , J . P . , Y e h , M . - Y . , H e l l s t r o m , I . &H e l l s t r 6 m , K . E . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 , 2 1 8 3 -2 1 8 7 .1 1 . S h i k u , H . , T a k a h a s h i , T . , R e s n i c k , L . A . , O e t t g e n , H . F . & O l d ,L . J . ( 1 9 7 7 ) J . E x p . M e d . 1 4 5 , 7 8 4 - 7 8 9 .1 2 . H o u g h t o n , A . N . , T a o r m i n a , M . C . , I k e d a , H . , W a t a n a b e , T . ,O e t t g e n , H . F . O l d , L . J . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ,4 2 6 0 - 4 2 6 4 .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 )