2a Clase Sondas y Pcr

MARCACION DE SONDASMARCACION DE SONDAS PCR Y APLICACIONES:PCR Y APLICACIONES: CONDICIONES DE LA REACCIONCONDICIONES DE LA REACCION PRIMERS DEGENERADOSPRIMERS DEGENERADOS RT – PCR RT – PCR REAL TIME PCRREAL TIME PCR

Dra. Liliana N. GuerraDra. Liliana N. Guerra

BIOLOGIA MOLECULAR EN BIOLOGIA MOLECULAR EN MEDICINA MEDICINA

Marcación de SONDASMarcación de SONDAS LA PREPARACION DE LA SONDA ES CRITICA PARA LA PREPARACION DE LA SONDA ES CRITICA PARA

LAS TECNICAS DE HIBRIDIZACION MOLECULARLAS TECNICAS DE HIBRIDIZACION MOLECULAR

EN LA HIBRIDIZACION:EN LA HIBRIDIZACION:LA SONDA Y EL ACIDO NUCLEICO A HIBRIDIZAR LA SONDA Y EL ACIDO NUCLEICO A HIBRIDIZAR

DEBEN ESTAR COMO SIMPLE CADENA DEBEN ESTAR COMO SIMPLE CADENA

SOUTHERN: SE TRATA EL GEL CON HCl PARA SOUTHERN: SE TRATA EL GEL CON HCl PARA DESNATURALIZAR EL ADN, SE NEUTRALIZA CON DESNATURALIZAR EL ADN, SE NEUTRALIZA CON NaOH Y SE TRANSFIERE A LA MEMBRANA EN NaOH Y SE TRANSFIERE A LA MEMBRANA EN SOLUCION DE ALTA FUERZA IONICASOLUCION DE ALTA FUERZA IONICA

NORTHERN: NO ES NECESARIO EL TRATAMIENTO, NORTHERN: NO ES NECESARIO EL TRATAMIENTO, SOLO MANTENER ARN SIN ESTRUCTURA SOLO MANTENER ARN SIN ESTRUCTURA SECUNDARIASECUNDARIA

Marcación de SONDASMarcación de SONDAS

TECNICAS MAS USADAS:TECNICAS MAS USADAS:

NICK – TRANSLATIONNICK – TRANSLATION RANDOM PRIMER EXTENSIONRANDOM PRIMER EXTENSION OLIGONOCLEOTIDES PROBESOLIGONOCLEOTIDES PROBES

SE USA UN NUCLEOTIDO MARCADO:SE USA UN NUCLEOTIDO MARCADO:

α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP: α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP: GENERALMENTE d CTPGENERALMENTE d CTP

biotina-11-d UTP, dioxigenina-11-d UTPbiotina-11-d UTP, dioxigenina-11-d UTP


LA SONDA PUEDE SER/ O NO RADIOACTIVA, LA SONDA PUEDE SER/ O NO RADIOACTIVA, EN TODOS LOS CASOS DEBE TENER ALTA EN TODOS LOS CASOS DEBE TENER ALTA ACTIVIDAD ESPECIFICAACTIVIDAD ESPECIFICA

DETERMINACION DE ACTIVIDAD DETERMINACION DE ACTIVIDAD ESPECIFICA: UNA VEZ MARCADO EL ADN ESPECIFICA: UNA VEZ MARCADO EL ADN SE PRECIPIA CON TCA 5% Y SE CUENTA LA SE PRECIPIA CON TCA 5% Y SE CUENTA LA MARCA PRECIPITADA MARCA PRECIPITADA

AE = AE = TOTAL DE CUENTAS INCORPORADASTOTAL DE CUENTAS INCORPORADAS

MASA DE ACIDO NUCLEICO USADOMASA DE ACIDO NUCLEICO USADO


NICK TRANSLATIONNICK TRANSLATION

ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y DNApolimerasa ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y DNApolimerasa 11

SE UTILIZA ADN DOBLE CADENASE UTILIZA ADN DOBLE CADENA SE INTRODUCE NICK (AGUJERO) AL AZAR EN UNA SE INTRODUCE NICK (AGUJERO) AL AZAR EN UNA

DE LAS CADENAS DEL ADNDE LAS CADENAS DEL ADN SE USA ENZIMA CON ACTIVIDAD 5’-3’ SE USA ENZIMA CON ACTIVIDAD 5’-3’

EXONUCLEASA: REMUEVE EL d NTP DEL EXONUCLEASA: REMUEVE EL d NTP DEL EXTREMO 5’ (pol 1) Y EL NICK SE VA EXTREMO 5’ (pol 1) Y EL NICK SE VA TRASLADANDOTRASLADANDO

SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA SEPHADEXSEPHADEX


RANDOM PRIMERRANDOM PRIMER

SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA O DE TIPO OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA O DE TIPO HEXANUCLEOTIDOS (CUALQUIERA CONSENSO)HEXANUCLEOTIDOS (CUALQUIERA CONSENSO)

SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA POR CALOR)POR CALOR)

SE USA ENZIMA QUE NO POSEA ACTIVIDAD 5’ – 3’ SE USA ENZIMA QUE NO POSEA ACTIVIDAD 5’ – 3’ EXONUCLEASA PARA QUE NO DEGRADE AL EXONUCLEASA PARA QUE NO DEGRADE AL PRIMER (Klenow)PRIMER (Klenow)

SE GENERA CADENA COMPLEMENTARIA SE GENERA CADENA COMPLEMENTARIA SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR

PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA SEPHADEXSEPHADEX

Marcación de SONDASMarcación de SONDASNICK TRANSLATION

RANDOM PRIMER

MASA A MARCAR 50 – 500 ng 25 – 250 ng

ACTIVIDAD ESPECIFICA

5 x 10 8 dpm/ug 1 X 10 9 dpm / ug

LARGO del FRAGMENTO MARCADO

200 – 500 d NTP 200 – 2000 d NTP

SONDA NO RADIOACTIVA:

SE USA 1 ug DE MASA A MARCAR

SENSIBILIDAD COMO RAD. CON AE = 1 x 10 8 dpm/ug


MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOSMARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS

SE UTILIZAN PARA REALIZAR SCREENING DE SE UTILIZAN PARA REALIZAR SCREENING DE BIBLIOTECASBIBLIOTECAS

SE MARCAN USANDO LA ENZIMA SE MARCAN USANDO LA ENZIMA DEOXINUCLEOTIDO TRANSFERASA (TdT) QUE DEOXINUCLEOTIDO TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA d NTP AL EXTREMO 3’AGREGA d NTP AL EXTREMO 3’

TEMPLADO DE 20 a 30 NTTEMPLADO DE 20 a 30 NT MASA A MARCAR: 20 ngMASA A MARCAR: 20 ng ACTIVIDAD ESPECIFICA: 5 x 10 ACTIVIDAD ESPECIFICA: 5 x 10 66 dpm/ ug dpm/ ug SE OBTIENE BAJA SEÑAL QUE AYUDA A NO SE OBTIENE BAJA SEÑAL QUE AYUDA A NO

TENER FONDO “SUCIO”TENER FONDO “SUCIO”

Polymerase chain reaction (PCR)

Inventada en 1985 por Kary B. Mullis (Premio Nobel de Química, 1993)

Se usa en criminología/medicina forense (identificar personas a través de muestras de sangre, cabellos, por comparación de DNA)

En el área de evolución (obtener enormes cantidades de DNA a partir de fósiles que contienen trazas de DNA).

Revolucionó el diagnóstico de defectos genéticos, (mutaciones), la detección de virus (HIV, HCV).

Permite hacer millones de copias de una muestra ínfima de DNA.

Polymerase chain reaction (PCR)Si repetimos este ciclo (desnaturalización,

annealing, extensión) muchas veces logramos una amplificación exponencial


EL PRODUCTO FORMADO A PARTIR DE LA PCR SE PUEDE LLAMAR AMPLICON. ES ESPECIFICO Y SOLO DEBE VERSE UNA BANDA POR AMPLIFICACION CON PRIMERS ESPECIFICOS.


CONCEPTOS BASICOS:CONCEPTOS BASICOS:

ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO PRODUCTO DE AMPLIFICACIONPRODUCTO DE AMPLIFICACION

EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE AMPLIFICACION EN FUNCION DEL NUMERO DE AMPLIFICACION EN FUNCION DEL NUMERO DE CICLOSCICLOS

FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA DNA POLIMERASA DURANTE LA COPIADNA POLIMERASA DURANTE LA COPIA

SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE NECESITA PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE NECESITA PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE COPIASCOPIAS

VARIANTES DE PCR:VARIANTES DE PCR:

NESTED PCR: NESTED PCR: SE REALIZA UNA SEGUNDA REACCION DE PCR A SE REALIZA UNA SEGUNDA REACCION DE PCR A

PARTIR DEL AMPLICON, USANDO PRIMERS INTERNOS PARTIR DEL AMPLICON, USANDO PRIMERS INTERNOS A LA 1ª AMPLIFICACIONA LA 1ª AMPLIFICACION

AUMENTA LA SENSIBILIDAD : SE REALIZAN 2 AUMENTA LA SENSIBILIDAD : SE REALIZAN 2 REACCIONES CONSECUTIVAS DE PCRREACCIONES CONSECUTIVAS DE PCR

AUMENTA LA ESPECIFICIDAD: SE UTILIZAN OTROS AUMENTA LA ESPECIFICIDAD: SE UTILIZAN OTROS PRIMERS INTERNOS ESPECIFICOSPRIMERS INTERNOS ESPECIFICOS

PCR MULTIPLEX: PCR MULTIPLEX: UNA REACCIÓN DE PCR CON VARIOS PARES DE UNA REACCIÓN DE PCR CON VARIOS PARES DE

PRIMERS QUE AMPLIFICAN DIFERENTES SECUENCIASPRIMERS QUE AMPLIFICAN DIFERENTES SECUENCIAS



DNA polimerasas para PCR :Termoestables


APLICACION LONGITUD TEMPLADO HASTA

ENZIMA

RUTINA

5kb Taq Pol

ALTA ESPECIFICIDAD Tº AMBIENTE

5kb Platinum Taq Pol

ALTA ESPECIFICIDAD ALTA FIDELIDAD

12kb Platinum Pfu Pol

SIN AGREGADO DE A (PARA GENOTIPIFICACION)

500pb Platinum Genotype Pol

ALTO CONTENIDO DE GC CODONES REPETIDOS

Dependiendo de la polimerasa

Taq, Platinum Taq


Cómo diseñamos los primers?

Tº MELTINGTº MELTING MAYOR DE 20 nt: MAYOR DE 20 nt:

Tm = 8105 + 16.6 log M + 0.41 (G-C) – Tm = 8105 + 16.6 log M + 0.41 (G-C) – 500/ longitud500/ longitud

HASTA 20 nt:HASTA 20 nt:

Tm = 4 ∑ ( G + C) + 2 ∑ (A + T)Tm = 4 ∑ ( G + C) + 2 ∑ (A + T)


RESUMENRESUMEN

LONGITUD DE 18 a 24 d NTPLONGITUD DE 18 a 24 d NTP ESPECIFICOSESPECIFICOS Tm = 55 a 75 C, CON Tm SIMILARES ENTRE SITm = 55 a 75 C, CON Tm SIMILARES ENTRE SI DISEÑAR PRIMERS CON CANTIDAD APROXIMADAMENTE 50% DISEÑAR PRIMERS CON CANTIDAD APROXIMADAMENTE 50%

DE GC Y DISTRIBUCION AL AZARDE GC Y DISTRIBUCION AL AZAR EVITAR PRIMERS CON SECUENCIAS DE POLIPURINAS Y/O EVITAR PRIMERS CON SECUENCIAS DE POLIPURINAS Y/O

POLIPIRIMIDINAS (Poly GC: DISMINUYE ESPECIFICIDAD - Poly POLIPIRIMIDINAS (Poly GC: DISMINUYE ESPECIFICIDAD - Poly AT: DISMINUYE EFICIENCIA)AT: DISMINUYE EFICIENCIA)

EVITAR SECUENCIAS QUE FORMEN ESTRUCTURAS EVITAR SECUENCIAS QUE FORMEN ESTRUCTURAS SECUNDARIASSECUNDARIAS

CONTROLAR QUE LOS PRIMERS NO HIBRIDICEN ENTRE SICONTROLAR QUE LOS PRIMERS NO HIBRIDICEN ENTRE SI EVITAR MAS DE 3 CG SEGUIDAD EN EL EXTREMO 3´EVITAR MAS DE 3 CG SEGUIDAD EN EL EXTREMO 3´ COMENZAR Y TERMINAR CON PURINASCOMENZAR Y TERMINAR CON PURINAS

EXISTEN PROGRAMAS DNAstar PARA DISEÑO DE PRIMERSEXISTEN PROGRAMAS DNAstar PARA DISEÑO DE PRIMERS

PRIMERS DEGENERADOS:PRIMERS DEGENERADOS:

SE USAN CUANDO QUIERO AMPLIFICAR SE USAN CUANDO QUIERO AMPLIFICAR UN GEN Y SOLO CONOZCO SU UN GEN Y SOLO CONOZCO SU SECUENCIA DE AMINOACIDOSSECUENCIA DE AMINOACIDOS

SE REALIZAN TODOS LOS PRIMERS SE REALIZAN TODOS LOS PRIMERS POSIBLES PARA UNIRLOS A LA POSIBLES PARA UNIRLOS A LA SECUENCIA DE INTERESSECUENCIA DE INTERES

NO LOS DISENO LOS DISEÑAMOS EN NUESTRO ÑAMOS EN NUESTRO LABORATORIO, SE PIDENLABORATORIO, SE PIDEN


PRIMERS DEGENERADOS:PRIMERS DEGENERADOS:

SE USAN SECUENCIAS QUE ESTEN SE USAN SECUENCIAS QUE ESTEN CONSERVADAS PARA UNA FAMILIA CONSERVADAS PARA UNA FAMILIA DE PROTEINASDE PROTEINAS

SE USA SECUENCIA CON MENOR SE USA SECUENCIA CON MENOR CANTIDAD DE CODONES POSIBLESCANTIDAD DE CODONES POSIBLES

SE INCLUYEN SITIOS DE SE INCLUYEN SITIOS DE RESTRICCION PARA CLONAR RESTRICCION PARA CLONAR POSTERIORMENTEPOSTERIORMENTE



PCR

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

0 25 40 50 60

Nº ciclos

Nº

pb


CONDICIONES PARA MEJORAR LA CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDADESPECIFICIDAD

DISMINUIR:DISMINUIR: Mg++Mg++ [d NTP][d NTP] LARGO DE LOS CICLOSLARGO DE LOS CICLOS NUMERO DE CICLOSNUMERO DE CICLOS CONCENTRACION DE PRIMERCONCENTRACION DE PRIMER

AUMENTAR:AUMENTAR: Tº DE ANNEALINGTº DE ANNEALING


RESUMENRESUMEN

MENOR TIEMPO Y MAYOR Tº DE ANNEALING: MENOR TIEMPO Y MAYOR Tº DE ANNEALING: MAYOR ESPECIFICIDADMAYOR ESPECIFICIDAD

CICLOS EXTRAS: MENOR ESPECIFICIDADCICLOS EXTRAS: MENOR ESPECIFICIDADPARA OBTENER MAS MASA DE AMPLIFICACION SE PARA OBTENER MAS MASA DE AMPLIFICACION SE

REALIZA REAMPLIFICACIONREALIZA REAMPLIFICACION

CONTROL NEGATIVO:CONTROL NEGATIVO: SIN ADNSIN ADN MUESTRA CON ADN QUE NO CONTIENE MUESTRA CON ADN QUE NO CONTIENE

SECUENCIA TARGETSECUENCIA TARGET SOLUCION DE EXTRACCION DE ADNSOLUCION DE EXTRACCION DE ADN


VARIANTES DE PCR PARA MEJORAR VARIANTES DE PCR PARA MEJORAR ESPECIFICIDAD:ESPECIFICIDAD:

HOT START PCR: EVITA PRODUCTOS HOT START PCR: EVITA PRODUCTOS INESPECIFICOS GENERADOS INICIALMENTE INESPECIFICOS GENERADOS INICIALMENTE CUANDO AUMENTA LA Tº CUANDO AUMENTA LA Tº

SE REALIZA LA DESNATURALIZACIÓN DEL ADN SE REALIZA LA DESNATURALIZACIÓN DEL ADN Y AHÍ SE AGREGA LA POLIMERASAY AHÍ SE AGREGA LA POLIMERASA

TOUCH DOWN PCR: Tº DE ANNEALING TOUCH DOWN PCR: Tº DE ANNEALING DECRECIENTES PARA ASEGURAR MAXIMA DECRECIENTES PARA ASEGURAR MAXIMA COMPLEMENTARIDAD DE LOS PRIMERSCOMPLEMENTARIDAD DE LOS PRIMERS

APLICACIONES DE PCRAPLICACIONES DE PCR MUTAGENESISMUTAGENESIS RT-PCRRT-PCR PRODUCCION DE SONDASPRODUCCION DE SONDAS DETECCIÓN DE INFECCIONES BACTERIANAS DETECCIÓN DE INFECCIONES BACTERIANAS

Y VIRALESY VIRALES DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

HEREDITARIASHEREDITARIAS ESTUDIOS DE EVOLUCIÓN MOLECULARESTUDIOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR ESTUDIOS DE MEDICIDNA FORENSE ESTUDIOS DE MEDICIDNA FORENSE ESTUDIOS DE FILIACIÓNESTUDIOS DE FILIACIÓN


RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

RNAc DNA


RNAc DNART-PCR Semi-cuantitativa

Control interno para normalizar: gen constitutivo (eliminar errores en la cantidad inicial de muestra)

PRIMERS: del gen de interés y del control interno.

Cuantifico las bandas: relación gen/control interno

C: células no tratadas. LPS: células expuestas a 100 µg/ml LPS (E. colio, P. aeruginosa). ARP: acidic ribosomal phosphoprotein

(controlinterno para normalizar la cantidad de mRNA

inicial).

PCR o RT-PCR CUANTITATIVA:PCR o RT-PCR CUANTITATIVA:SE REALIZA UN CONTROL INTERNO SE REALIZA UN CONTROL INTERNO

QUE SE UTILIZA PARA QUE SE UTILIZA PARA RELATIVIZAR LA CANTIDAD DE RELATIVIZAR LA CANTIDAD DE AMPLICON OBTENIDA DEL GEN AMPLICON OBTENIDA DEL GEN DE INTERESDE INTERES

SE REALIZA LA DETECCION DEL SE REALIZA LA DETECCION DEL CONTROL INTERNO Y DEL GEN DE CONTROL INTERNO Y DEL GEN DE INTERES CON SONDAS INTERES CON SONDAS ESPECIFICAS Y DIFERENTESESPECIFICAS Y DIFERENTES


0

5

10

15

20

2530

35

40

45

50

0 15 20 25 30 35 40 45 50

No de ciclos

Ab

so

rba

nc

ia SEÑALCONTROL

SEÑALINTERES



RNAc DNART -PCRRT -PCR

PRUEBA CUANTITATIVA PARA HIVPRUEBA CUANTITATIVA PARA HIV CARGA VIRAL = VIREMIACARGA VIRAL = VIREMIA HIV ES RETROVIRUS, SE OBTIENE HIV ES RETROVIRUS, SE OBTIENE

RNA Y SE REALIZA RT-PCRRNA Y SE REALIZA RT-PCR SEGUIMIENTO DE LA TERAPIA DE SEGUIMIENTO DE LA TERAPIA DE

PACIENTE INFECTADOPACIENTE INFECTADO LIMITE DE DETECCIÓN: 40 COPIAS LIMITE DE DETECCIÓN: 40 COPIAS

VIRALES/ML (ULTRASENSIBLE)VIRALES/ML (ULTRASENSIBLE)


RNAc DNA

Rapid Amplification of cDNA Ends RACE-PCR

RT-PCR para amplificar secuencias desconocidas del extremo 3‘ y 5' del mRNA

Se realiza la RACE y se SECUENCIA el producto obtenido

EVITA ERRORES DE LA PCR PUES PRODUCTOS CORTOS


RNAc DNA


RNAc DNA


Fluorocromo + Quencher (absorbe la energía del fluorocromo cuando está cerca fluorocromo no fluoresce)


Aplicaciones de la PCR: PROTOCOLO DE AMPLIFICACION DE LAS REPETICIONES TELOMERICAS QUE MIDE ACTIVIDAD DE TELOMERASA


Aplicaciones de la PCR: deteminación de polimorfismos genéticos

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