25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum L-MS/MS AP I Analysis Kit...
Transcript of 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum L-MS/MS AP I Analysis Kit...
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analysis Kit
User Manual
ZV-3046-0200-10
200
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
2
Contents 1. INTENDED USE ........................................................................................................................................ 3
2. SUMMARY AND EXPLANATION ........................................................................................................ 3
3. IVD SYMBOLS............................................................................................................................................ 4
4. TEST PRINCIPLE...................................................................................................................................... 4
5. WARNINGS AND PRECAUTIONS ...................................................................................................... 4
6. STORAGE AND STABILITY .................................................................................................................. 5
7. MATERIALS SUPPLIED ......................................................................................................................... 5
8. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED ............................................................................. 6
9. PROCEDURE NOTES .............................................................................................................................. 7
10. PRE-SETUP INSTRUCTIONS ............................................................................................................... 7
11. LIMITATIONS OF PROCEDURE ......................................................................................................... 8
12. SAMPLE PRETREATMENT .................................................................................................................. 8
13. QUALITY CONTROL ................................................................................................................................ 9
14. CALCULATION OF RESULTS ............................................................................................................... 9
15. INTERPRETATION OF RESULTS .................................................................................................... 10
16. EXPECTED VALUES ............................................................................................................................. 10
17. LC-MS/MS PARAMETERS ................................................................................................................. 11
18. ANALYTICAL PERFORMANCE ........................................................................................................ 13
19. SAMPLE CHROMATOGRAM ............................................................................................................. 14
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
3
1. INTENDED USE
Quantitative HPLC analysis kit for 25-hydroxy metabolites of Vitamin D2 and D3 in
human serum samples.
2. SUMMARY AND EXPLANATION
Vitamin D, commonly known as the “sunshine vitamin”, is essential for maintaining
calcium metabolism and bone health. The major physiologic function of Vitamin D is
to maintain the blood calcium and phosphorus levels within the normal range in order
to maintain metabolic functions that are essential for most life processes, Vitamin D3
and Vitamin D2 are metabolized to 25-OH-Vitamin D3 and 25-OH-Vitamin D2 in the
liver by the 25-OHase enzyme. The quantitation of these metabolites is widely used
for determining of vitamin D status in human. The Vitamin D status has a clinical
significance in a variety of disorders which related to hormones. The measurements
of the serum concentration of 25-OH-Vitamin D3 and 25-OH-Vitamin D2 have been
used for differential diagnosis of hypocalcemic and hypercalcemic metabolic bone
disorders.
The analysis of these metabolites is considered to be difficult. Some reasons of the
difficulties are given below.
- The low concentrations of 25-OH Vitamin D metabolites in serum (level of μg/L).
- The low stability in the presence of light and heat.
- The presence of other metabolites which have chemical similarity.
- The large amount of other related neutral lipids (such as cholesterol)
25-OH Vitamin D2-D3 HPLC Analysis Kit was developed for rapid, automated,
sensitive and reliable quantitative detection of the 25-OH Vitamin D2-D3
concentrations in human serum samples and it gives results in 2 minutes. Main
methods and procedures that have been selected are based on EN ISO 13485 and
98/79/EC.
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
4
3. IVD SYMBOLS
Conformite European
Manufacturer
In vitro diagnostic
Order number
Lot number
Sufficient for <N> Tests
Temperature limits
4. TEST PRINCIPLE
The 25-hydroxyvitamin D metabolites are extracted from human serum samples
using an organic extraction solution after deproteinization step. Separation was made
with an isocratic elution on Zivak 25-OH Vitamin D HPLC column and measured by
Tandem mass spectrometer system.
5. WARNINGS AND PRECAUTIONS
For in-vitro diagnostic use only.
For professional use only.
Read the instructions carefully, before you start.
In case of damage of the kit package, please contact Zivak or your supplier.
Do not use expired kits and components.
Please check the lot number and expiry date before start.
Protective gloves and goggles should be worn.
Please take any necessary precautions to prevent infection with blood borne
pathogens while working with biological fluids. Appropriate bio-safety
precautions and disposal of bio-hazardous wastes should be followed.
Please check the labels on reagent bottles. Reagents of this kit contain hazardous
material may cause eye and skin irritations.
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
5
6. STORAGE AND STABILITY
This analysis kit can be shipped at room temperature.
Serum controls, calibrators and reagent 2 must be stored at 2-8 °C until
reconstitution.
After arrival, mobile phases and reagent 1 must be stored at room temperature.
After reconstitution serum calibrators and controls must be stored at -20 °C.
All components are guaranteed until expiry date when stored at recommended
temperatures and used as described in these instructions.
7. MATERIALS SUPPLIED
Order No Volume Symbol Component
ZV-3046-02R1-10 3 x 45 mL
Reagent 1, Contains aqueous buffer
ZV-3046-02R2-10 3 x 45 mL
Reagent 2, Contains Internal Standard
ZV-3046-02MP-10 1 x 0.5 L
Mobile Phase A, Contains organic solvent
ZV-3046-02MT-10 1 x 0.5 L
SPE Buffer, Contains organic solvent
ZV-3046-02WB-10 2 x 1 L
Wash Solution
ZV-4027-KK-10 1 x 1 pc
User Guide
R1
R2
WB
KK
MA
MB
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
6
8. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Materials listed in the table below are required and should be ordered separately.
Order No Volume Symbol Component
ZV-3046-02S1-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Calibrator Level-1
ZV-3046-02S2-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Calibrator Level-2
ZV-3046-02S3-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Calibrator Level-3
ZV-3046-02S4-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Calibrator Level-4
ZV-3046-02S5-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Calibrator Level-5
ZV-3046-02S6-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Calibrator Level-6
ZV-3046-02K1-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Control Level-1
ZV-3046-02K2-10 1 x 3 mL
Lyophilized, Serum Control Level-2
ZV-3046-02C1-10 1 x 1 pc 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analytical Column
ZV-3046-CSPE-10 1 x 1 pc 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Column Cartridge
ZV-3046-02C2-10 1 x 1 pc 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Column Holder
ZS-9020-0001-00 200 – 1000 µL pipette
ZS-9007-0500-00 200 – 1000 µL pipette tips
ZS-2ML-8-1001 2 x 100 pc 2 mL glass vial
ZS-9004-0100-00 2 x 100 pc 2 mL glass vial caps pre-slit
Distilled or deionized water
Calibrator Level 1
Calibrator
Level 2
Calibrator Level 3
Calibrator
Level 4
Control Level 1
Control Level 2
Calibrator Level 5
Calibrator Level 6
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
7
9. PROCEDURE NOTES
Any inappropriate handling of samples or modification of the test procedure may
influence the results. The indicated pipetting volumes, temperatures and pre-
treatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use
calibrated pipettes and devices only.
Once the test has been started, all steps should be completed without interruption.
Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the
appropriate time.
Leave aside all reagents to reach room temperature (18-25 °C) and gently swirl each
vial of liquid reagent before use. Mix reagents without foaming.
Avoid contamination of reagents, pipettes and tubes. Use new disposable plastic
pipette tips for each reagent, standard or specimen. Do not interchange the vial caps.
Always keep vials closed when not been used. Do not re-use vials.
10. PRE-SETUP INSTRUCTIONS
Instrument Setup
• Purge HPLC pumps with 5000 µL/min flow rate after connecting mobile phase A
and SPE buffer. Purge pumps until there are no air bubbles inside the tubing lines.
• Connect wash solution into system and purge syringe pumps until there are no air
bubbles in tubing lines.
• Make sure the bottle of mobile phase is closed well, otherwise components
of the mobile phase could evaporate; this alters the retention times.
• Wait for 15 minutes for conditioning after activating method.
Valve Connections
Injection Valve
Switching Valve
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
8
Preparation of Calibrators
• Add 3 mL of deionized water to each serum calibrator and dissolve.
• After preparation, they must be aliquoted into 450 µL volumes and stored at -
20°C.
Preparation of Controls
• Add 3 mL of deionized water to each serum control and dissolve.
• After preparation, they must be aliquoted into 450 µL volumes and stored at -
20°C.
11. LIMITATIONS OF PROCEDURE
Specimen collection and storage have a significant effect on the test results. Serum
samples from earlier days must be kept frozen before the analysis.
12. SAMPLE PRETREATMENT
Sample Pretreatment (Manual)
Take 400 µL of patient sample (or calibrators and controls) into the sample preparation tube.
Add 450 µL Reagent 1 and vortex for 10 seconds.
Add 400 µL Reagent 2 and vortex for 10 seconds.
Centrifuge at 5000 rpm x 3 minutes.
0.5 mL Take the upper phase to vial.
Inject 50 µL to LC-MS/MS system.
Prepared samples are stable for 24 hours at 2-4 °C temperature.
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
9
Sample Pretreatment (Automated)
If Calibrator/Control will be analyzed, take 400 µL of calibrator/control sample into glass vial and put vials into related tray on instrument.
Place serum samples into system tray on Zivak Multitasker Full Automated Sample Preparation and Injection System.
Analysis will automatically start after clicking Start button on software.
Injections, calculations and reporting done automatically by instrument.
Prepared samples are stable for 24 hours at 2-4 °C temperature.
13. QUALITY CONTROL
The test results are only valid if the test has been performed by following the
instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good
Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All standards and kit
controls must be found within the acceptable ranges as stated on the QC (Quality
Control) Certificate. If the criteria are not met, the run is not valid and should be
repeated.
Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any
deviation, the following technical issues should be proven.
Expiry dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation
conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate
quality assessment trials.
14. CALCULATION OF RESULTS
Results of Vitamin D2 and D3 will be calculated by the ratio between compound peak
area to Internal Standard area. A linear calibration curve will created with these ratios
from each calibrator levels. Calculation formula is given below.
𝐷3 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =𝐷3 𝐴𝑟𝑒𝑎
𝐼𝑆 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐷3 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =
𝐷3 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡
𝐼𝑆 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡
𝐷2 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =𝐷2 𝐴𝑟𝑒𝑎
𝐼𝑆 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐷2 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =
𝐷2 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡
𝐼𝑆 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡
Sample signals above the highest control level have to be confirmed by a reference
method.
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
10
15. INTERPRETATION OF RESULTS
Various societies recommend different Cut-Off values for repetition of the
measurement and the application of confirmatory assays. Depending on the
application of patient samples from different populations, it is highly recommended
that each laboratory establishes its own range of normal values and that this
distribution of values is coordinated with the recommendations of the responsible
society of this geographic region.
The results themselves should not be the only reason for any therapeutic
consequences. They have to be correlated to other clinical observations and
diagnostic tests.
16. EXPECTED VALUES
These reference ranges represent clinical decision values, based on the 2011 Institute
of Medicine report, that apply to males and females of all ages, rather than population-
based reference values. Population reference ranges for 25-OH-VitD vary widely
depending on ethnic background, age, geographic location of the studied populations,
and the sampling season.
<10 ng/mL Severe
deficiency Could be associated with osteomalacia or rickets
10-19 ng/mL Mild to
moderate deficiency
May be associated with increased risk of osteoporosis or secondary hyperparathyroidism
20-50 ng/mL Optimum
levels
Optimum levels in the healthy population; patients with bone disease may benefit from higher levels within this range
51-80 ng/mL
Increased risk of
hypercalciuria
Sustained levels >50 ng/mL 25OH-Vitamin D along with prolonged calcium supplementation may lead to hypercalciuria and decreased renal function
>80 ng/mL Toxicity possible
80 ng/mL is the lowest reported level associated with toxicity in patients without primary hyperparathyroidism who have normal renal function. Most patients with toxicity have levels >150 ng/mL. Patients with renal failure can have very high 25-OH-Vitamin D levels without any signs of toxicity, as renal conversion to the active hormone 1.25-OH-Vitamin D is impaired or absent
It is recommended that each laboratory establishes its own range of normal values.
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
11
17. LC-MS/MS PARAMETERS
Instrument Zivak Tandemgold LC-MS/MS System
Column Zivak 25-Hidroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analytical Column
Injection Volume
50 µL
Ionization Mode
APCI Positive
CID Gas 2.4 mTorr
API Nebulizing Gas
55 psi
Vaporizer Gas 15 psi
Vaporizer Gas Temperature
350 °C
Drying Gas 25 psi
Drying Gas Temperature
300 °C
Spray Chamber Temperature
60 °C
SIM Width 1.5 amu
Scan Time 0.600 seconds
Corona Current 10 µA
Shield Voltage 600 V
Detector Voltage
1600 V
Pump Program
Time (min)
Flow Rate (µL/min)
%A %B
1 00.00 700 50 50
2 02.00 700 50 50
Online SPE Valve Program
Time (min)
Position
1 00.00 Load
2 00.40 Inject
3 01.80 Load
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
12
MS Scan Parameters
No Analyte Retention
Time (min) First Mass
(m/z)
Second Mass (m/z)
Capillary (eV)
CE
1 25-OH Vitamin D3 1.06 (+) 383.3 257.3 80 V 16 V
2 25-OH Vitamin D2 1.11 (+) 395.3 269.2 80 V 18 V
3 IS 1.06 (+) 389.3 263.3 80 V 16 V
Multitasker Method Parameters
Parameter Barcode Reading
Sample Adding
Reagent Adding (R1)
Reagent Adding (R2)
Centrifuge Sample
Injection
Process Type Parallel Serial Parallel Parallel Parallel Serial
From
Tray Sample
Tray Sample
Tray LR LR
Analysis Tray
Analysis Tray
Vial 1 1 1 2 1 1
Needle Height - 7 0 0 0 1.3 mm
Quantity - 500 650 µL 650 µL - 60 µL
Use Detection - Active Passive Passive - Active
Search Limit - 10 - - - 0
Shake Passive - Passive Passive - Passive
To
Tray - Analysis
Tray Analysis Tray
Analysis Tray
- -
Vial - 1 1 1 - -
Needle Height - 15 17 18 - -
Amount - 400 450 µL 400 µL - -
Washing
Wash Place - 1. Wash C 2. Wash A
1. Wash B 2. Wash A
1. Wash B 2. Wash C 3. Wash A
-
1. Wash C 2. Injection
Valve 3. Wash A
Syringe Pump - Reagent Syringe
Reagent Syringe
Reagent Syringe
- Reagent Syringe
Volume x Count - 1. 1000 x 2 2. 500 x 2
1. 10000 x 1 2. 500 x 1
1. 10000 x 1 2. 500 x 1 3. 500 x 1
- 1. 3000 x 1 2. 1000 x 1 3. 1000 x 1
Aspirate Port - I6 I6 I6 - I6
Dispense Port - 1. O4 2. O1
O1 1. O1 2. O4 3. O1
- 1. O4 2. O1 3. O1
Syringe Speeds
Syringe Pump - Reagent Syringe
Reagent Syringe
Reagent Syringe
- XCalibur
Aspirate Speed / Wait / Port
- 18 / 1500 /
I1 13 / 3000 /
I2 13 / 3000 /
I5 - 16 / 1500
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
13
Dispense Speed / Wait / Port
- 14 / 1500 /
O1 14 / 3000 /
O1 14 / 3000 /
O1 - 18 / 1500
Waste Before
Quantity - - 10000 10000 - -
To - - Wash B Wash B - -
Air Segment
Quantity - 20 20 20 - 20
Selection - At First At First At First - At First and
Last
Centrifuge
Run Time - - - - 1 min -
Speed - - - - 5000 RPM -
Vortex - - - - Active -
V. Run Time - - - - 1 min -
V. Speed - - - - 1000 RPM -
Purge Before
Wash Place Syringe P. Volume Repeat Aspirate P. Dispense P.
Wash A Reagent Syringe
1000 2 I6 O1
Batch
Parameter Value Batch Active
Batch Count 108
18. ANALYTICAL PERFORMANCE
No Analyte Accuracy
(%)
Intra-assay Precision
(%CV)
Inter-assay Precision
(%CV)
1 25-OH
Vitamin D3 94.7 2.16 2.74
2 25-OH
Vitamin D2 96.4 4.60 4.74
No Analyte LOD
(µg/L) LOQ
(µg/L) Linearity
(R2)
1 25-OH
Vitamin D3 1.48 4.90 0.993
2 25-OH
Vitamin D2 1.06 3.50 0.992
Analytical Specificity (Cross Reactivity): No cross-reactivity was found with the typical substances tested.
D. No: ZV-3046-KK-10.R15
14
19. SAMPLE CHROMATOGRAM
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analiz Kiti
Kullanım Kılavuzu
ZV-3046-0200-10
200
2-8 °C
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
2
İçindekiler 1. KULLANIM AMACI .................................................................................................................................. 3
2. ÖZET VE AÇIKLAMA .............................................................................................................................. 3
3. IVD SEMBOLLERİ .................................................................................................................................... 3
4. TEST PRENSİBİ ........................................................................................................................................ 4
5. UYARILAR VE ÖNLEMLER .................................................................................................................. 4
6. SAKLAMA VE DAYANIKLILIK ............................................................................................................ 4
7. KİT İÇERİĞİ ................................................................................................................................................ 5
8. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER ............................................................. 6
9. ÇALIŞMA NOTLARI ................................................................................................................................. 6
10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR .............................................................................................................. 7
11. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR.......................................................................................................... 8
12. NUMUNE HAZIRLIĞI .............................................................................................................................. 8
13. KALİTE KONTROL .................................................................................................................................. 9
14. SONUÇLARIN HESAPLANMASI ......................................................................................................... 9
15. SONUÇLARIN YORUMLANMASI..................................................................................................... 10
16. BEKLENEN DEĞERLER ...................................................................................................................... 10
17. LC-MS/MS PARAMETRELERİ ......................................................................................................... 11
18. ANALİTİK PERFORMANS .................................................................................................................. 13
19. ÖRNEK KROMATOGRAM .................................................................................................................. 14
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
3
1. KULLANIM AMACI
Serum ve plazma numunelerinde Vitamin D2 ve D3’ün 25-hidroksivitamin
metabolitlerinin LC-MS/MS yöntemi ile kantitatif analizi.
2. ÖZET VE AÇIKLAMA
Vitamin D, halk arasında ‘güneş ışığı vitamini’ olarak bilinen, kalsiyum metabolizması
ve kemiklerin sağlığı açısından çok önemli olan bir maddedir. Vitamin D’nin en önemli
fizyolojik fonksiyonu yaşamsal faaliyetler için gerekli olan kalsiyum ve fosforun
kandaki seviyesini belirli limitler içinde tutmaktır. Vitamin D2 ve D3 karaciğerde 25-
hidroksilaz enzimi tarafından sırasıyla 25-OH Vitamin D2 ve D3’e metabolize
edilmektedir. Bu metabolitlerin miktar tayini yaygın olarak insan kanındaki vitamin
D miktarını tespit etmek için kullanılmaktadır. Vücuttaki Vitamin D durumu
hormonlara bağlı olan birçok hastalık için klinik anlamda önem taşır. 25-OH-Vitamin
D3 ve 25-OH-Vitamin D2 serumdaki konsantrasyonlarının miktarı hipokalsemik ve
hiperkalsemik gibi metabolik kemik hastalıklarının ayrıcı tanısında kullanılır.
Bu metabolitlerin analizi aşağıdaki bazı nedenlerden dolayı oldukça zordur.
- Serumdaki düşük 25-OH Vitamin D metabolit konsantrasyonu(μg/L seviyesinde).
- Işık ve sıcaklık etkisi altında düşük kararlılık.
- Benzer kimyasal özelliklere sahip başka metabolitlerin varlığı.
- Kolesterol gibi doğal yağların fazla miktarda bulunması
25-Hidtoksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analiz Kiti ile serumdaki 25-OH
Vitamin D2-D3 metabolit konsantrasyonlarının ölçümü hızlı, hassas ve güvenilir bir
biçimde 2 dakikada sonuç alacak şekilde yapılabilmektedir. Kullanılan yöntem ve
prosedürler EN ISO 13485 ve 98/79/EC direktiflerine dayanmaktadır.
3. IVD SEMBOLLERİ
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
4
Conformite European
Üretici firma
In vitro diagnostic
Sipariş kodu
Lot numarası
<N> Test için yeterli
Sıcaklık aralığı
4. TEST PRENSİBİ
25-hidroksivitamin D metabolitleri, deproteinizasyon adımından sonra bir organik
ekstraksiyon çözeltisi kullanılarak insan serum örneklerinden ekstrakte edilir. Daha
sonra, bu metabolitlerin Zivak 25-OH Vitamin D UHPLC kolonu kullanarak izokratik
ayırımı sağlanır ve ölçümü tandem kütle spektrometresi ile yapılır.
5. UYARILAR VE ÖNLEMLER
Sadece in-vitro tanı amaçlı kullanım içindir.
Yalnızca profesyonel kullanım içindir.
Başlamadan önce talimatları dikkatli bir şekilde okuyun.
Kit paketinin hasar görmesi durumunda lütfen Zivak veya tedarikçiniz ile temasa
geçin.
Süresi geçmiş kitleri ve bileşenleri kullanmayın.
Başlamadan önce lot numarası ve son kullanma tarihini kontrol edin.
Koruyucu eldiven ve gözlük takılmalıdır.
Biyolojik sıvılarla çalışırken kan yoluyla bulaşan patojenlerle bulaşmayı önlemek
için lütfen gerekli tedbirleri alın. Uygun biyogüvenlik önlemleri alınmalı ve
biyolojik tehlikeli atıkların atılması prosedürü takip edilmelidir.
Lütfen reaktif şişeleri üzerindeki etiketleri kontrol edin. Bu kitin reaktifleri
tehlikeli madde içerdiğinden göz ve cilt tahrişlerine neden olabilir.
6. SAKLAMA VE DAYANIKLILIK
• Bu analiz kiti oda sıcaklığında saklanabilir.
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
5
• Reaktif 2, Serum kalibratör ve kontrolleri 2-8 °C’de saklanmalıdır.
• Serum kalibratör ve kontrolleri saf su ile çözüldükten sonra -20 °C’de
saklanmalıdır.
• Diğer bileşenler oda sıcaklığında saklanmalıdır.
• Tüm bileşenler, tavsiye edilen sıcaklıklarda depolandığında ve bu talimatlarda
açıklandığı gibi kullanıldığı takdirde son kullanma tarihine kadar garanti
kapsamındadır.
7. KİT İÇERİĞİ
Sipariş Kodu Miktar Sembol Bileşen
ZV-3046-02R1-10 3 x 45 mL
Reaktif 1, Sulu tampon içerir
ZV-3046-02R2-10 3 x 45 mL
Reaktif 2, İnternal standart içerir
ZV-3046-02MP-10 1 x 0,5 L
Mobil Faz A, Organik çözücü içerir
ZV-3046-02MT-10 1 x 0,5 L
SPE Buffer, Organik çözücü içerir
ZV-3046-02WB-10 2 x 1 L
Yıkama Solüsyonu
ZS-2ML-8-1001 2 x 100 adet 2 mL cam vial
ZS-9004-0100-00 2 x 100 adet 2 mL kesikli cam vial kapağı
ZV-3046-KK-10 1 x 1 adet
Kullanım Kılavuzu
R1
R2
MA
SPE
WB
KK
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
6
8. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER Aşağıdaki tabloda yer alan ürünler ayrıca sipariş edilmelidir.
Sipariş Kodu Miktar Sembol Bileşen
ZV-3046-02S1-10 1 x 3 mL
İyofilize, Serum Kalibratör Level-1
ZV-3046-02S2-10 1 x 3 mL
İyofilize, Serum Kalibratör Level-2
ZV-3046-02S3-10 1 x 3 mL
İyofilize, Serum Kalibratör Level-3
ZV-3046-02S4-10 1 x 3 mL
İyofilize, Serum Kalibratör Level-4
ZV-3046-02K1-10 1 x 3 mL
İyofilize, Serum Kontrol Level-1
ZV-3046-02K2-10 1 x 3 mL
İyofilize, Serum Kontrol Level-2
ZV-3046-02C1-10 1 x 1 adet 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analitik Kolon
ZV-3046-CSPE-10 1 x 1 adet 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Kolon Kartuşu
ZV-3046-02C2-10 1 x 1 adet 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Kolonu Tutucu
ZS-9020-0001-00 200 – 1000 µL pipet
ZS-9007-0500-00 200 – 1000 µL pipet ucu
Bidistile veya deiyonize su
9. ÇALIŞMA NOTLARI
Numunelerin uygunsuz şekilde taşınması veya test prosedürünün değiştirilmesi
sonuçları etkileyebilir. Belirtilen pipetleme hacimleri, sıcaklık ve ön işlem
basamakları kesinlikle talimatlara uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kalibre edilmiş
pipetleri ve cihazları kullanın.
Test başladıktan sonra, tüm basamaklar kesintisiz tamamlanmalıdır. Gerekli
reaktiflerin, materyallerin ve cihazların uygun zamanda hazır olduğundan emin olun.
Calibrator Level 1
Calibrator
Level 2
Control Level 1
Control Level 2
Calibrator Level 3
Calibrator
Level 4
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
7
Oda sıcaklığına (18-25 °C) erişmek için tüm reaktifleri bir kenara bırakın ve
kullanımdan önce sıvı reaktifin her şişesini hafifçe döndürün. Reaktifleri köpürmeden
karıştırın.
Reaktiflerin, pipetlerin ve tüplerin kirlenmesini önleyin. Her reaktif, standart veya
numune için yeni atılabilir plastik pipet uçları kullanın. Şişe kapaklarını
değiştirmeyin. Kullanılmadığı zamanlarda tüpleri daima kapalı tutun. Tüpleri tekrar
kullanmayın.
10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR
Cihazın Hazırlanması
• HPLC pompalarına mobil faz ve SPE buffer bağlandıktan sonra 5000 µL/dak akış
hızı ile yıkama verilir. Hatlarda hava kabarcığı kalmayana kadar yıkama işlemine
devam edilir.
• Yıkama sıvısı sisteme bağlanır ve şırınga pompalarının hatlarında hava kabarcığı
kalmayana kadar yıkama verilir.
• Mobil faz şişesinin iyi kapalı olduğundan emin olun, aksi takdirde mobil faz
bileşenleri buharlaşabilir; Bu, alıkonma sürelerini değiştirir.
• Metot aktif edildikten sonra sistemin şartlanması için 15 dakika beklenmelidir.
Valf Bağlantısı
Enjeksiyon Valfi
Değiştirme Valfi
Kalibratörlerin Hazırlanması
• Serum kalibratör numuneleri 3 mL distile su eklenip çözülür.
• Hazırlanan kalibratörler 450 µL’lik hacimlere bölünerek -20 °C’de saklanmalıdır.
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
8
Kontrollerin Hazırlanması
• Serum kontrol numuneleri 3 mL distile su eklenip çözülür.
• Hazırlanan kontroller 450 µL’lik hacimlere bölünerek -20 °C’de saklanmalıdır.
11. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR
Numune toplama ve saklama koşulları test sonuçları üzerinde önemli bir etkiye
sahiptir. Daha sonraki günlerde çalışılacak serum numuneleri analiz yapılana kadar
dondurulmuş olarak saklanmalıdır.
12. NUMUNE HAZIRLIĞI
Numune Hazırlığı (El ile)
400 µL kalibratör, kontrol veya hasta numunesi 2 mL’lik cam viallere alınır.
Üzerine 450 µL Reaktif 1 eklenir ve 10 saniye vortekslenir.
Üzerine 400 µL Reaktif 2 eklenir ve 10 saniye vortekslenir.
10000 rpm x 3 dakika santrifüj edilir.
Üst faz 0.5 mL’lik plastik viale alınır.
LC-MS/MS sistemine 50 µL enjeksiyon verilir.
Hazırlanmış numune 2-4 °C ‘de 24 saat boyunca stabildir.
Numune Hazırlığı (Otomatik)
Kalibratör/Kontrol çalışılacak ise, 400 µL kalibratör veya kontrol numunesi 2 mL’lik cam viallere alınır ve cihaz üzerindeki ilgili tablaya yerleştirilir.
Serum tüpüne alınmış hasta numunesi Zivak Multitasker Tam Otomatik Numune Hazırlama ve Enjeksiyon Sistemi üzerindeki yerine yerleştirilir.
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
9
Yazılım üzerinde Başlat butonuna tıklandığında analizler otomatik olarak başlayacaktır.
Enjeksiyonlar, hesaplamalar ve raporlama cihaz tarafından otomatik olarak yapılır.
Hazırlanmış numune 2-4 °C ‘de 24 saat boyunca stabildir.
13. KALİTE KONTROL
Test sonuçları ancak verilen test talimatlarına uyulduğu takdirde geçerlidir.
Kullanıcılar çalışırken GLP(Good Laboratory Practice) veya diğer kurumlar
tarafından belirlenmiş olan kurallara ve standartlara bağlı kalmalıdır.
Bütün standart ve kontrol değerleri kalite kontrol sertifikasında belirtilen aralıklarda
olmalıdır. Değerler bu aralıkların dışında kaldığı takdirde analiz geçerli değildir ve
tekrarlanmalıdır.
Her laboratuvar daha ileri aşama kontroller için değeri bilinen numuneleri
kullanmalıdır. Bu değerlerden sapma olması halinde reaktiflerin son kullanma tarihi,
saklama koşulları, kullanılan pipetlerin doğruluğu, cihazlar, inkübasyon koşulları ve
yıkama metotları gibi teknik detayların doğruluğundan emin olunmalıdır.
Ayrıca uygun dış kalite kontrol programına üye olunması önerilir.
14. SONUÇLARIN HESAPLANMASI
Elde edilen analitlerin alanlarının iç standart alanına oranı ile Vitamin D2 ve D3
sonuçları hesaplanır. Her bir seviye kalibratörde yapılan bu oranlama üzerinden
lineer kalibrasyon eğrisi oluşturularak sonuçlar hesaplanır. Hesaplamalar için
kullanılan denklemler aşağıda belirtilmiştir.
𝐷3 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =𝐷3 𝐴𝑙𝑎𝑛
𝐼𝑆 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝐷3 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =
𝐷3 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟
𝐼𝑆 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟
𝐷2 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =𝐷2 𝐴𝑙𝑎𝑛
𝐼𝑆 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝐷2 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =
𝐷2 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟
𝐼𝑆 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟
En yüksek kontrol seviyesinin üstündeki örnek sinyaller bir referans yöntemi ile teyit
edilmelidir.
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
10
15. SONUÇLARIN YORUMLANMASI
Farklı toplumlarda farklı Cut-Off değerleri belirlenmelidir. Farklı toplumlardaki hasta
numuneleri için yapılan çalışmalara bağlı olarak, her laboratuvarın kendi normal
değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir ve bu değerlerin dağılımı o coğrafi
bölgedeki sorumlu kurumun önerdiği değerler ile uyumlu olmalıdır.
Tanı ve tedavi aşamalarında bu analizlerin sonuçları klinik gözlemler ve tanı testleri
ile desteklenmelidir.
16. BEKLENEN DEĞERLER
Burada belirtilen referans aralıkları, popülasyona dayalı referans değerlerini değil,
her yaştan erkek ve kadın için geçerli olan 2011 Institute of Medicine raporuna dayalı
klinik karar değerlerini temsil eder. 25-OH-Vitamin D için popülasyon referans
aralıkları, etnik köken, yaş, incelenen popülasyonların coğrafi konumu ve örnekleme
mevsimine bağlı olarak büyük farklılıklar göstermektedir.
<10 ng/mL Çok düşük Osteomalazi veya raşitizm ile ilgili olabilir
10-19 ng/mL Düşük Osteoporoz veya sekonder hiperparatiroidizm riski ile ilişkili olabilir
20-50 ng/mL Normal Sağlıklı popülasyondaki optimum düzeyler; kemik hastalığı olan hastalar bu aralık içinde daha yüksek düzeylerde yararlanabilir
51-80 ng/mL Artan
Hiperkalsüri riski
50 ng/mL üzeri 25OH-Vitamin D ve uzun süreli kalsiyum takviyesi ile devam eden seviyeler hiperkalsüriye ve böbrek fonksiyonlarında azalmaya neden olabilir
>80 ng/mL Olası
toksisite
80 ng/mL, primer hiperparatiroidizm olmayan, normal böbrek fonksiyonlarına sahip hastalarda toksisite ile ilişkili olarak bildirilen en düşük seviyedir. Toksisiteye sahip hastaların çoğunda >150 ng/mL düzeyi gözlenir. 1.25-OH-Vitamin D aktif hormon böbrek dönüşümü bozulmuş veya mevcut olmadığı için, böbrek yetmezliği olan hastalar toksisite belirtileri göstermeden çok yüksek 25-OH-Vitamin D düzeylerine sahip olabilirler.
Her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir.
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
11
17. LC-MS/MS PARAMETRELERİ
Cihaz Zivak Tandemgold LC-MS/MS Sistemi
Kolon Zivak 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analitik Kolonu
Enjeksiyon Miktarı
50 µL
İyonizasyon Modu
APCI Pozitif
CID Gaz 2,4 mTorr
API Nebulizing Gaz
55 psi
Vaporizer Gaz 15 psi
Vaporizer Gaz Sıcaklığı
350 °C
Drying Gaz 25 psi
Drying Gaz Sıcaklığı
300 °C
Spray Chamber Sıcaklığı
60 °C
SIM Width 1,5 amu
Tarama Zamanı
0,600 saniye
Corona Akımı 10 µA
Shield Voltajı 600 V
Dedektör Voltajı
1600 V
Pompa Programı
Zaman (dak)
Akış (µL/dak)
%A %B
1 00,00 700 50 50
2 02,00 700 50 50
Online SPE Valf Programı
Zaman (dak)
Pozisyon
1 00,00 Load
2 00,40 Inject
3 01,80 Load
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
12
MS Tarama Parametreleri
No Analit Alıkonma
Zamanı (dk)
Birincil Kütle (m/z)
İkincil Kütle (m/z)
Capillary (eV)
CE
1 25-OH
Vitamin D3 1,06 (+) 383,3 257,3 80 V 16 V
2 25-OH
Vitamin D2 1,11 (+) 395,3 269,2 80 V 18 V
3 IS 1,06 (+) 389,3 263,3 80 V 16 V
Multitasker Metot Parametreleri
Parametre Barkod Okuma
Numune Ekleme
Reaktif Ekleme (R1)
Reaktif Ekleme (R2)
Santrifüj Numune
Enjeksiyonu
İşlem Tipi Paralel Seri Paralel Paralel Paralel Seri
Nereden
Tabla Numune Tablası
Numune Tablası
LR LR Analiz Tablası
Analiz Tablası
Tüp 1 1 1 2 1 1
İğne Yüksekliği - 7 0 0 0 1,3 mm
Miktar - 500 650 µL 650 µL - 60 µL
Sıvı Bulma - Aktif Pasif Pasif - Aktif
Arama Limiti - 10 -
- - 0
Shake Pasif - Pasif Pasif - Pasif
Nereye
Tabla - Analiz Tablası
Analiz Tablası
Analiz Tablası
- -
Tüp - 1 1 1 - -
İğne Yüksekliği - 15 17 18 - -
Miktar - 400 450 µL 400 µL - -
Yıkama
Yıkama Yeri - 1. Yıkama C 2. Yıkama A
1. Yıkama B 2. Yıkama A
1. Yıkama B 2. Yıkama C 3. Yıkama A
-
1. Yıkama C 2. Enjeksiyon
Valfi 3. Yıkama A
Şırınga Pompası - Reaktif
Şırıngası Reaktif
Şırıngası Reaktif
Şırıngası -
Reaktif Şırıngası
Miktar x Tekrar - 1. 1000 x 2 2. 500 x 2
1. 10000 x 1 2. 500 x 1
1. 10000 x 1 2. 500 x 1 3. 500 x 1
- 1. 3000 x 1 2. 1000 x 1 3. 1000 x 1
Çekme Portu - I6 I6 I6 - I6
Basma Portu - 1. O4 2. O1
O1 1. O1 2. O4 3. O1
- 1. O4 2. O1 3. O1
Şırınga Hızları
Şırınga Pompası - Reaktif
Şırıngası Reaktif
Şırıngası Reaktif
Şırıngası -
Enjeksiyon Şırıngası
Çekme Hız / Bekleme / Port
- 18 / 1500 /
I1 13 / 3000 /
I2 13 / 3000 /
I5 - 16 / 1500
Basma Hız / Bekleme / Port
- 14 / 1500 /
O1 14 / 3000 /
O1 14 / 3000 /
O1 - 18 / 1500
Önce At
Miktar - - 10000 10000 - -
Nereye
- - Yıkama B Yıkama B - -
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
13
Hava Kabarcığı
Miktar - 20 20 20 - 20
Seçim - Başta Başta Başta - Başta ve Sonda
Santrifüj
Çalışma Süresi - - - - 1 dakika -
Hız - - - - 5000 RPM -
Vorteks - - - - Aktif -
V. Çalışma Süresi - - - - 1 dakika -
V. Hız - - - - 1000 RPM -
Önce Yıka
Yıkama Yeri
Şırınga P. Miktar Tekrar Çekme P. Basma P.
Yıkama A Reaktif
Şırıngası 1000 2 I6 O1
Grup
Parametre Değer Grup Aktif
Grup Sayısı 8
18. ANALİTİK PERFORMANS
No Analit Doğruluk
(%)
Gün içi Tekrarlanabilirlik
(%CV)
Günler arası Tekrarlanabilirlik
(%CV)
1 25-OH
Vitamin D3 94,7 2,16 2,74
2 25-OH
Vitamin D2 96,4 4,60 4,74
No Analit LOD
(µg/L) LOQ
(µg/L) Doğrusallık
(R2)
1 25-OH
Vitamin D3 1,48 4,90 0,993
2 25-OH
Vitamin D2 1,06 3,50 0,992
Analitik Seçicilik (Çapraz reaksiyon): Analitler arasında çapraz reaksiyon veya bir interferans etkisi gözlenmemiştir.
D. No: ZV-3046-KK-10.R14
14
19. ÖRNEK KROMATOGRAM