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Molecole e cellule a colori22-24 Settembre 2010 - Milano

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Image courtesy of Julien Colombelli

Indice

Composizione e Layout: Rossana De Lorenzi I Tommaso Nastasi

Molecole e cellule a colori22-24 Settembre 2010 - Milano

Introduzione all‘ELLS ................................................................................................................................ 3

Introduzione al CusMiBio ................................................................................................................ 4

Participanti e Programma .......................................................................................................................... 5-8

Seminario 1 La citofluorimetria a flusso ......................................................................................................................... 9

Paolo Plevani, Università degli Studi di Milano

Attività 1 Proteggere un cuore malato ....................................................................................................................... 10-12

Tommaso Nastasi e Rossana De Lorenzi , EMBL Monterotondo

Seminario 2 ....................................................................................................................................................................... 13

Sara Buonomo, EMBL Monterotondo

Attività 2 Alla ricerca del tempo perduto ................................................................................................................... 14-15

Paolo Plevani, Università degli Studi di Milano

Seminario 3 Il cervello in technicolor .............................................................................................................................. 16-17

Silvia De Biasi, Università degli Studi di Milano

Attività 3 Il cervello in technicolor .............................................................................................................................. 18-19

Silvia De Biasi, Università degli Studi di Milano

Seminario 4 Microscopia in fluorescenza e confocale ................................................................................................. 20-21

Umberto Fascio e Silvia De Biasi, Università degli Studi di Milano

Seminario 5 ....................................................................................................................................................................... 22

Martin Kater e Lucia Colombo, Università degli Studi di Milano

Attività 4 Come produrre un fiore .............................................................................................................................. 23

Lucia Colombo, Monica Colombo e Martin Kater Università degli Studi di Milano

in classeLegende e-learning protocollo dettagliato etàlaboratorio

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Introduzione all‘ ELLSELLS – European Learning Laboratory for the Life Sciences

l’European Learning Laboratory for the Life Sciences (ELLS) è una struttura educativa creata allo

scopo di avvicinare insegnanti e studenti delle scuole superiori al mondo della ricerca attraverso

entusiasmanti attività pratiche basate sulle più sofisticate tecniche di biologia molecolare. La

struttura è situata nell’esclusivo contesto di uno dei più rinomati istituti di ricerca al mondo,

il Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare (EMBL), che vanta uno staff internazionale di

scienziati giovani e dinamici.

Gruppi composti da 15-30 insegnanti raggiungono l’EMBL per partecipare ad attività pratiche

chiamate LearningLABs, che affrontano temi attuali di biologia molecolare associati a semplici

esperimenti facilmente riproducibili nelle classi. Nel corso di tre giorni gli insegnanti hanno

l’opportunità di affiancare autorevoli ricercatori in attività sperimentali, seminari, visite alle strutture

dell’EMBL, corsi di bioinformatica, giochi educativi e forum di discussione su scienza e società.

Il materiale didattico sviluppato durante i LearningLABs è disponibile sul sito dell’ELLS nella

sezione TeachingBASE.

L’ELLS invita anche ricercatori europei esterni a visitare la struttura ed a lavorare con lo staff

ELLS al fine di elaborare materiale didattico e di esplorare la possibilità di applicare analoghi

programmi educativi ai rispettivi istituti di provenienza.

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Introduzione al CusMiBioCusMiBio - Centro Universita‘ di Milano - Scuola per le Bioscienze e le Biotecnologie

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Partecipanti

Albanese Nicola Caiazzo (CE)

Antonietti Franca Bolzano

Barone Antonina Avola (SR)

Bifulco Laura Cagliari

Caronia Daniela Milano

De Meo Raffaella Imperia

Di Battista Emilia Roma

Forgelli Antonella Roma

Gazzoldi Maria Verolanuova (BS)

Lucchetti Paola Latina

Mantegazza Rosalia Limbiate (MB)

Marinoni Silvia Rovetta (BG)

Menesini Monica Lucca

Oliveira Maria Teresa Lecco

Paolini Maria Paola Sassari

Parisi Elisabetta Milano

Pettolino Piarosa Maddaloni (CE)

Silvaggio Giovanna Assisi

Torri Maria Cecilia Bergamo

Vannini Maria Gabriella Sassari

Insegnanti

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Organizzatori

Tommaso Nastasi ELLS - EMBL Monterotondo

Rossana De Lorenzi ELLS - EMBL Monterotondo

Paolo Plevani Università degli Studi di Milano, Cus-Mi-Bio

Giovanna Viale Università degli Studi di Milano, Cus-Mi-Bio

Cristina Gritti Cus-Mi-Bio

Cinzia Grazioli Cus-Mi-Bio

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Relatori e collaboratori

Relatori:

Paolo Plevani Università degli Studi di Milano

Sara Buonomo EMBL Monterotondo

Silvia De Biasi Università degli Studi di Milano

Umberto Fascio Università degli Studi di Milano

Martin Kater Università degli Studi di Milano

Lucia Colombo Università degli Studi di Milano

Collaboratori per le attività pratiche:

Fabio Puddu

Mariarosa Gioria

Laura Cornaghi

Monica Colombo

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22 settembre Stanza

9:00-9:30 Presentazione del corso CusMiBio-EMBL Aula seminari

9:30-10:30 SEMINARIO 1: Paolo Plevani Aula seminari

10:30-10:45 Coffee break Aula seminari

10:45-12:15 ATTIVITÀ I: Proteggere un cuore malato – parte I Laboratorio

12:15-13:15 SEMINARIO 2: Sara Buonomo Aula seminari

13:15-14:30 Pausa pranzo Mensa

14:30-15:30 ATTIVITÀ I: Proteggere un cuore malato – parte II Laboratorio

15:30-15:45 Coffee break Aula seminari

15:45-18:00 ATTIVITÀ II: Alla ricerca del tempo perduto Laboratorio

23 settembre

9:00-10:00 SEMINARIO 3: Silvia De Biasi Aula seminari

10:00-11:30 ATTIVITÀ III: Il cervello in technicolor – parte I Laboratorio

11:30-11:45 Coffee break Aula seminari

11:45-12:45 SEMINARIO 4: Umberto Fascio e Silvia De Biasi Aula seminari

12:45-14:00 Pausa Pranzo Mensa

14:00-15:00 ATTIVITÀ III: Il cervello in technicolor – parte II Laboratorio

15:00-16.00Gruppo 1: microscopio confocale Gruppo 2: osservazione e commento dei preparati realizzati (ATTIVITÀ III)Gruppo 3: analisi citofluorimetrica (ATTIVITÀ II)

Laboratorio

16:00-17:00Gruppo 1: analisi citofluorimetrica (ATTIVITÀ II)Gruppo 2: microscopio confocaleGruppo 3: osservazione e commento dei preparati realizzati (ATTIVITÀ III)

Laboratorio

17:00-18:00Gruppo 1: osservazione e commento dei preparati realizzati (ATTIVITÀ III)Gruppo 2: analisi citofluorimetrica (ATTIVITÀ II)Gruppo 3: microscopio confocale

Laboratorio

24 settembre

9:00-10:00 SEMINARIO 5: Martin Kater – Lucia Colombo Aula seminari

10:00-11:15 ATTIVITÀ IV: Come produrre un fiore – Analisi morfologica Laboratorio

11:15-11:30 Coffee break Aula seminari

11:30-12:15DEMO: Gruppo 1: microdissezione Gruppo 2: ibridazione in situ

Laboratorio

12:15-13:00DEMO: Gruppo 1: ibridazione in situ Gruppo 2: microdissezione Laboratorio

13:00-14:00 Pausa pranzo Mensa

14:00-16:30 ATTIVITÀ IV: Come produrre un fiore Laboratorio

16:30-17:00 QUESTIONARIO: Valutazione del Corso Aula seminari

Programma

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Paolo PlevaniUniversita‘ degli Studi di Milano

Seminario 1 La citofluorimetria a flusso

La citofluorimetria a flusso (CFM) è una tecnica che permette la caratterizzazione ed, eventualmente, raccolta di cellule sospese in un mezzo liquido in base alle loro dimensioni, forma, quantità di particolari proteine o acidi nucleici. Rende possibile la misurazione rapida di proprietà multiple di singole cellule permettendo una dettagliata analisi qualitativa e quantitativa.

Inizialmente la CFM era limitata alla misura di 1 o 2 parametri, uno che valutava le proprietà fisiche delle cellule e l’altro la fluorescenza emessa da molecole (DNA o proteine) coniugate con una sostanza fluorescente. L’utilizzo di svariati fluorocromi e la possibilità di utilizzare laser con spettri d’emissione diversi ha permesso lo sviluppo di analisi multiparametriche che si basano sull’utilizzo e visualizzazione di numerosi colori.

Le applicazioni sono multiple:

• studio della ploidia e della proliferazione cellulare;• analisi immunofenotipica multiparametrica; • analisi del sistema immunitario;• valutazione dell’apoptosi cellulare

Verranno discussi i principi di funzionamento del citofluirimetro e verranno portati alcuni esempi, soprattutto riguardanti lo studio ed il controllo del ciclo cellulare.

La citofluorimetria a flusso: principi ed applicazioni

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10Attività 1 Proteggere un cuore malato15-18abc

Riparare un cuore infrantoTommaso Nastasi, Rossana De Lorenzi

Introduzione

Architettura e funzione del muscolo cardiacoIl cuore gioca un ruolo fondamentale pre il

funzionamento del nostro organismo:• Fa circolare il sangue attraverso il sistema

polmonare, consentendo in esso lo scambio di anidride carbonica con l‘ossigeno

• Trasporta il sangue ossigenato a tutti i distretti periferici del corpo, permettendone la sopravvivenza rendendo possibile la produzione di energia metabolica

• Distribuendo il sangue a tutti i distretti tissutali, permette a nutrienti, ormoni e altre molecole segnale, nonchè a cellule del sistema immunitario e di difesa, di raggiungere tutte le cellule della periferia del corpo

La funzione di „pompa“ del cuore, che garantisce una efficiente ossigenazione e alimentazione di tutte le cellule, ha un‘origine evolutiva antica. Non è quindi affatto una sorpresa trovare organi con funzione cardiaca nella maggior parte degli organismi multicellulari.

Il cuore esercita le sue fiunzione grazie ad un tessuto specializzato, composto da cellule mononucleate (dette cardiomiociti) accoppiate elettricamente grazie alla presenza di canali intramembrana (gap-junctions) giustapposti tra

cellule adiacenti. Questa organizzazione permette ai cardiomiociti di attuare contrazioni rimiche e coordinate, attraverso un complesso sistema che regola il rilascio di Ca2+ dai compartimenti intracellulari dove esso è contenuto.

Un fattore critico per il funzionamento cardiaco è ovviamente che il suo stesso tessuto sia efficacemente alimentato/ossigenato, una funzione espletata dal sistema circolatorio coronoarico. La contrazione del cuore è controllata dall‘attività pacemaker di strutture nervose specializzate (le cellule del Purkinje), che sono componenti essenziali di quello che viene definito sistema di conduzione cardiaco.

Nel tessuto cardiaco i cardiomiociti, componenti il miocardio, sono associati ad altri tipi cellulari, responsabili di funzioni accessorie quali la protezione da patogeni, la riparazione tissutale e lo smaltimento di sostanze di rifiuto.

Infarto al Miocardio

Una porzione di tessuto cardiaco che dovesse mancare di apporto sanguigno va inevitabilmente incontro ad un processo degenerativo comunemente noto con il termine di Infarto del Miocardio (IM). L‘IM è talvolta anche l‘evento terminale della sindrome

Excitation propagation in a model of the heart of the Visible Man: 3D views of the excitation process at different times for the ventricles.

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11Attività 1 Proteggere un cuore malato15-18abc

Insufficienza Cardiaca Cronica (ICC), uno stato patologico caratterizzato dall‘incapacità del cuore a mantenere le sue funzioni vitali.

L‘IM costituisce in tutti i suoi aspetti e fasi una lesione del tessuto, e nei diversi organismi si sono evolute strategie per garantire protezione e guarigione dai danni associati all‘IM.

Nella fase acuta dell‘IM, le cellule dell‘area infartuata vanno incontro a stress e morte, rilasciando nel tessuto calcio e altre sostanze tossiche. La produzione di citochine (piccole molecole seganle) pro-infiammatorie facilita il reclutamento di cellule che partecipano al processo di riparazione del danno.

Idealmente, la gaurigione dovrebbe portare ad una completa ricostituzione di tessuto cardiaco funzionale. In questo senso, la possibilità che esistano cellule staminali nel cuore, in grado, se opportunamente attivate, di riconstitutire integralmente il tessuto danneggiato suscita grande interesse nella comunità scientifica.

I pesci, per esempio, sembrano mantenere, anche in età adulta, un certo numero di cellule staminali cardiache che rispondon al danno tissutale migrando nell‘area infartuata dove differenziano ricostituendo le cellule cardiache perse. Tuttavia, non tutti gli organismi hanno mantenuto questa formidabile capacità rigenerativa, e le diverse teorie sui meccanismi che sottostanno la guarigione di un IM sono ancora oggetto di intenso dibattito fra gli scienziati. Sono presenti cellule staminali cardiache nel cuore umano? Sono esse in grado di riattivarsi e riparare il tessuto danneggiato da un IM?

L‘obiettivo di questa attività è quello di esplorare il processo dell‘IM nei mammiferi e riflettere sulle strategie naturali di guarigione dall‘IM e sulle loro implicazioni potenzialmente rilevanti per la terapia medica.

L‘approccio istologico

L‘uso di sostanze chimiche per colorare specifiche strutture tissutali e cellulari occupa una posizione consolidata nella tradizione della microscopia. Questi protocoli tradizionali

hanno ancora oggi un‘importanza fondamentale per la valutazione iniziale di anormalità e danni dlle cellule e dei tessuti, e forniscono indicazioni importanti per l‘approfondimento diasgnostico.

Molto spesso, questo approccio consente agli scienziati di formulare ipotesi specificatamente a difetti funzionali.

L‘approccio istochimico trae vantaggio dall‘abilità di certe molecole (d‘ora in poi chiamate coloranti) di legare componenti cellulari o presenti nel compartimento extra-cellulare del tessuto, dando. grazie alle loro proprietà specifiche, contrasto a tali strutture. Alcune di queste molecole esibiscono

particolari proprietà metacromatiche, sono cioè in grado di cambiare colore a secondo

Rabbit Aorta, PicroSirius Red (polarized) -

Changes in ECG tracks during Myocardial infar-ction. Adapted from 3DScience.com

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12Attività 1 Proteggere un cuore malato15-18abc

del loro stato chimico influenzato dall‘ambiente circostante.Informazioni più dettagliate possono essere acquisite anche tramite l‘esecuzione

di protocolo immuno-enzimatici, ossia di quei protocolli che misurano la presenza ed abbondanza di certi enzimi o substrati presenti nei compartimenti intracellulari.

Attività

I partecipanti avranno la possibilità di analizzare diversi campioni di tessuto cardiaco fissati su vetrino (tessuto di controllo, tessuto a diversi stadi successivi a IM, e tessuto a diversi stadi dopo IM associato a terapia). Basandosi su quali aspetti dell‘IM si vuole osservare, i partecipanti dovranno:

- determinare quali campioni sono necessari per l‘analisi- identificare lo stadio specifico idoneo a fornire le risposte richieste- selezionare i controlli appropriati da includere nell‘analisi per una corretta

intepretazione dei risultati- scegliere quale tecnica di colorazione applicare per svelare i meccanismi cellulari

oggetto dell‘ipotesi- eseguire la tecnica di colorazione scelta - confrontare e discutere i risultati che emergono dall‘analisi delle strategie adottate

dai diversi gruppi

Lo scopo principale di questa attività è quello di incoraggiare i partecipanti a sviluppare strategie sperimentali basate sull‘inchiesta e di formulare teorie sulla base dei risultati ottenuti. Inoltre, le evidenze emergenti dall‘approccio sperimentale, serviranno da base ad una fase generale di discussione sule capacità rigenerative dei diversi organismi, cercando di rompere il luogo comune che il processo rigenerativo in natura è sempre operato nel miglior modo possibile.

Questo tema ha implicazioni importanti sulla nostra, sempre maggiore, capacità di osservare e comprendere i fenomeni biologici. Da un lato, la nostra conoscenza dei processi patologici e la nostra bilità di sviluppare strategie terapeutiche ha visto formidabili progressi; dall‘altro però, la consapevolezza che certi processi naturali non sono sempre perfetti da legittimità ad tentativi di interferire con quegli stessi processi, sottoponendo la comunità medico-scientifica e la società stessa a dilemmi più profondi rispetto quali scelte responsabili possiamo o vogliamo fare.

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13Seminario 2 Punti di Controllo del ciclo cellulare e loro funzione nel prevenire la trasformazione cellulare

Sara BuonomoEMBL Monterotondo

Le cellule, affinché possano sopravvivere e gli organismi a cui appartengono si pos-sano sviluppare, devono proliferare, dando vita a nuove cellule che abbiano il loro stesso corredo genetico.Il processo che permette la duplicazione del corredo genetico di una cellula, con-sentendo la trasmissione ad ogni nuova cellula dello stesso set cromosomico della cellula parentale, è chiamato replicazione del DNA. Questo processo avviene durante la cosiddetta fase di Sintesi (fase S) del ciclo cellulare.Il secondo passaggio findamentale è quello che consente la corretta distribuzione delle due copie di genoma ta le due cellule figlie. Questo processo avviene durante la Mitosi. Questi passaggi sono particolarmente delicati e dalla loro affidabilità di-pende la sopravvivenza stessa delle cellule.Per garantire che eventuali errori nel corredo genetico non vengano trasmessi tra le varie generazioni, le cellule possiedono dei punti di controllo (checkpoints) del ciclo cellulare durante i quali il ciclo può essere sospeso per permettere la correzione degli errori.Alternativamente, qualora gli errori siano non riparabili, la cellula attiva un programma di auto-eliminazione (cosidetta apoptosi, o morte cellulare programmata). La transizione da cellula normale a cancerosa è spesso associata con alterazioni nella funzione di componenti dei checkpoints e/o errori generati durante la replicazione del DNA. I checkpoints controllano tutte le transizioni da una fase del ciclo cellulare alla successiva.

Il checkpoint G1-SPrima che le cellule si impegnino a duplicare il genoma, il checkpoint G1-S garantisce che non siano presenti interruzioni nel filamento di DNA e che la cellula abbia suffi-cienti risorse per completare un processo ad costo energetico molto elevato come quello della replicazione del DNA.In presenza di qualunque anomalia, l‘inizio della replicazione viene ritardata fino a quando il problema non è risolto. In questa fase solo un processo di replicazione a „bassa fedeltà“, chiamato Non-Homologous End Joining (NHEJ), è in grado di ripa-rare il DNA. Infatti, prima che il DNA si replichi, ogni cromosoma è presente in singola copia e, pertanto, non sono disponibili altre copie stampo per la correzione di errori.

Il checkpoint della replicazione del DNAProblemi che avvengono durante la replicazione del DNA costituiscono la principale

Punti di controllo del ciclo cellulare e loro funzione nel prevenire la trasformazione cellulare

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sorgente endogena di danno al DNA. Il checkpoint della replicazione del DNA si attiva ogni qualvolta il complesso di replicazione incontra un ostacolo. La sua funzione pri-maria è sostanzialmente quella di attivare l‘apparato necessario a rimuovere o oltre-passare quell‘ostacolo. L‘obiettivo finale di questo checkpoint è quello di garantire che l‘intero genoma sia duplicato (preferibilmente senza errori) prima che esso sia effettivamente distribuito alle due cellule figlie.

Il checkpoint intra fase SSe le cellule che si trovano nella fase S sono soggette ad una fonte esogena di danno al DNA, come per esempio raggi g, le conseguenti rotture a doppio filamento del DNA (double stranded break, DSB) vengono registrate da questo checkpoint che blocca la progressione del ciclo cellulare ed l‘innesco della replicazione del DNA, ancora in fase di attesa, e attiva i meccanismi di riparazione del danno. Dato che questo tipo di danno è diverso da quello associato al blocco delle forche di replicazione, il comp-lesso molecolare che avverte la presenza del danno e la cascata di segnali coinvolta nella risposta ad esso sono distinti da quelli coinvolti nel checkpoint della replicazione del DNA.

Il checkpoint G2-M Il checkpoint G2-M costituisce l‘ultimo guardiano che assicuri l‘integrità del DNA pri-ma che la cellula entri in mitosi.Dopo che la replicazione del DNA si è completata, le cellule acquisiscono la capacità di riparare il danno del DNA attraverso un processo ad alta fedeltà, detto di ricom-binazione omologa (Homologous Recombination, HR). A questo stadio infatti ogni cromosoma è costituito da due copie identiche, dette cromatidi fratelli, che offrono vicendevolmente uno stampo da cui trarre informazione per la riparazione di eventuali errori.

Il checkpoint del fusoI cromatidi fratelli rimangono legati l‘uno all‘altro fino al momento in cui la cellula è pronta a dividersi, per garantire che entrambe le cellule figlie ricevano esattamente una delle due copie di ogni cromosoma. Questo meccanismo fa sì che i due cromatidi possano poi orientarsi in maniera coordinata verso i due poli opposti dell‘apparato del fuso, che si distribuiranno nelle due cellule figlie. Pertanto, solo un corretto e ordina-to attracco bipolare di ognuno dei cromatidi fratelli può assicurare una distribuzione corretta del materiale genetico duplicato nelle due cellule figlie.Le cellule possiedono sensori molecolari che sono in grado di attivarsi qualora uno dei cromosomi sia orientato in maniera anomala o non correttamente localizzato nella cellula. La loro funzione è quella di inibire il processo di distribuzione finchè ogni sin-golo cromosoma sia pronto a muoversi nella direzione corretta.

Seminario 2 Punti di Controllo del ciclo cellulare e loro funzione nel prevenire la trasformazione cellulare

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“Alla ricerca del tempo perduto”: la citofluorometria nell’analisi del ciclo cellularePaolo Plevani, Fabio Puddu

Attività 2 Alla ricerca del tempo perduto

Premesse teoriche

Durante il ciclo di divisione cellulare la cellula duplica il suo patrimonio genetico (fase S) e lo divide fra le due cellule figlie (fase M). In questo processo la quantità totale di DNA presente nella cellula aploide (1C) cresce costantemente durante tutta la fase S (replicazione) fino a raggiungere, al termine della stessa il valore 2C. Durante la fase M (mitosi) si osserva invece il rapido dimezzamento della quantità di DNA presente nella cellula. Lo stesso processo si può osservare in cellule diploidi, dove la quantità di DNA oscilla fra 2C e 4C.

Per facilitare lo studio del ciclo cellulare sono state adottate diverse tecniche che permettono di ottenere colture cellulari sincronizzate, in cui tutte le cellule in coltura si trovano nella stessa fase del ciclo cellulare. Utilizzando come sistema modello il lievito Saccharomyces cerevisiae è possibile sincronizzare le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare. Le cellule aploidi di lievito possono essere sincronizzate in G1 attraverso l‘uso di un feromone sessuale, in fase S con un inibitore della replicazione e in M mediante un agente che depolimerizza il fuso mitotico.

Il processo di replicazione del DNA e di divisione cellulare può essere seguito con l‘analisi citofluorimetrica. Questa tecnica permette di misurare indirettamente la quantità di DNA presente in ogni singola cellula attraverso una misura della fluorescenza emessa da un fluoroforo che si intercala nella molecola di DNA. Misurando il contenuto totale di DNA, questa tecnica permette inoltre di avere informazioni sulla ploidia della popolazione in esame.

Obiettivi

Ai partecipanti verranno distribuite colture di S. cerevisiae asincrone o sincronizzate, aploidi oppure diploidi senza però che il partecipante sappia quale coltura gli è stata assegnata (da qui il titolo dell’esperienza di laboratorio!). Attraverso l‘analisi citofluorimetrica ogni partecipante misurerà il contenuto di DNA in un campione rappresentativo della popolazione da esaminare.

Una volta stabilito se la popolazione esaminata è sincronizzata o asincrona e qual è la distribuzione del suo contenuto di DNA, i partecipanti completeranno l‘analisi della coltura osservando al microscopio la morfologia cellulare della popolazione esaminata. Le cellule di S. cerevisiae, infatti, assumono una morfologia caratteristica nelle diversi fasi del ciclo cellulare.

Attraverso le informazioni ottenute ogni partecipante sarà in grado di identificare il tipo di coltura da cui proviene il suo campione.

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Misura del contenuto di DNA in una popola-zione di cellule proliferanti

attraverso l‘analisi citofluorimetrica. Fonte: Molecular Biology of the Cell

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Step principali

Dopo aver prelevato una aliquota di coltura per l‘osservazione al microscopio, le cellule restanti vengono fissate per almeno 30 minuti in etanolo 70%. Si procede quindi alla preparazione dei campioni per l‘analisi citofluorimetrica (FACS). I campioni vengono trattati con RNasi per un‘ora a 37°C, in modo da eliminare dalle cellule tutto l‘RNA che potrebbe influenzare l’analisi FACS; le cellule vengono quindi risospese in FACS buffer e conservate a 4°C.

Il giorno successivo i campioni vengono colorati con un fluoroforo che si intercala nel DNA, sonicati per separare eventuali aggregati cellulari ed analizzati al citofluorimetro. Verranno quindi discussi i risultati.

Attività 2 Alla ricerca del tempo perduto15-18

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Silvia De BiasiUniversita‘ degli Studi di Milano

Seminario 3 Il cervello in technicolor

Il cervello costituisce, assieme al midollo spinale, il nostro sistema nervoso centrale che è formato da un tessuto nervoso riccamente vascolarizzato e composto da due grandi categorie di cellule: i neuroni (specializzati per condurre segnali elettrici su lunghe distanze) e le cellule gliali (che non conducono segnali elettrici ma sono dotate di molteplici funzioni vitali per il corretto funzionamento dei neuroni stessi).

La caratteristica peculiare del tessuto nervoso è che i neuroni (e anche le cellule gliali) sono presenti in un’enorme varietà di tipi cellulari, distinti tra loro per morfologia, specificità molecolare, attività fisiologica. I nostri processi sensoriali, la percezione, il comportamento, la memoria e, in generale, tutte le attività svolte dal nostro cervello, dipendono strettamente da questa ricca diversità strutturale e funzionale e dalle specifiche interconessioni dei neuroni, realizzate mediante contatti altamente specializzati (le sinapsi) a formare insiemi intricati chiamati circuiti sinaptici.

Storicamente l’identificazione di tipi cellulari diversi nel sistema nervoso si deve a studi istologici del XIX secolo, realizzati con metodiche di colorazione che prendono il nome dai ricercatori che le hanno messe a punto: Nissl, Cajal, Golgi e altri. Tali metodiche hanno portato uno straordinario contributo sperimentale in campo neuro-anatomico e anatomo-patologico e si sono rivelate fondamentali per gli studi sullo sviluppo del sistema nervoso. E’ tuttavia importante ricordare che le colorazioni “classiche” continuano ancora oggi ad essere utilizzate, combinandole con approcci più moderni.

Il cervello in technicolor: Colorazioni classiche e nuove tecniche per visualizzare l’architettura e l’organizzazione sinaptica del cervello. Silvia De Biasi

Sezioni di cervelletto colorate con Tionina (A), reazione nera di Golgi (B) e con marcatura immunocitochimica multipla (C) per evidenziare i

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Nuove tecnologie, rese possibili dai progressi della biologia cellulare e molecolare, forniscono ora ai ricercatori gli strumenti per distinguere varie proprietà dei neuroni, non rilevabili con le metodiche convenzionali di colorazione.

I nuovi approcci sperimentali comprendono: a) l’utilizzo di anticorpi o sonde a mRNA, con cui è possibile apprezzare caratteristiche specifiche di neuroni e cellule gliali in diverse regioni del sistema nervoso, come pure la diversità dei tipi cellulari all’interno di queste regioni; b) nuovi metodi di marcatura con sostanze traccianti trasportate lungo i prolungamenti delle cellule nervose, che consentono di esaminare più a fondo le connessioni tra neuroni; c) le metodiche per determinare l’identità molecolare e la morfologia delle cellule nervose che possono essere combinate con misure della loro attività fisiologica, chiarendo quindi le relazioni tra struttura e funzione; d) la scoperta di geni che codificano per proteine fluorescenti in invertebrati marini, che ha permesso l’espressione di tali molecole in neuroni del cervello di mammiferi.

Il seminario fornirà una serie di esempi dell’ applicazione di metodiche classiche e più recenti utilizzate per cercare di chiarire la complessa organizzazione del sistema nervoso.

Seminario 3 Il cervello in technicolor

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19Attività 3 Il cervello in technicolor

Il cervello in technicolorSilvia De Biasi, Mariarosa Gioria, Laura Cornaghi

Strumento essenziale per visualizzare le cellule del tessuto nervoso (e di tutti i tessuti in generale) è il microscopio ottico. Affinché tale osservazione sia possibile, il tessuto deve essere preliminarmente trattato con opportune metodiche.

Verranno, quindi, illustrate le procedure classiche di fissazione, inclusione, taglio e colorazione di campioni di tessuto nervoso che permettono di ottenere preparati permanenti osservabili al microscopio ottico.

Ai partecipanti saranno distribuiti campioni di encefalo di animali da laboratorio, opportunamente preparati in precedenza secondo le modalità spiegate nella introduzione, che verranno sezionati, colorati e osservati al microscopio.

Materiale distribuito- campioni di encefalo fissati ed inclusi in paraffina, per il taglio al microtomo;- campioni di encefalo fissati ma non inclusi in paraffina, per il taglio al vibratomo;- sezioni al vibratomo o in paraffina già montate su vetrini per poterle colorare.

TAGLIO. I partecipanti avranno modo di utilizzare di persona due strumenti, microtomo e vibratomo, che consentono di ottenere sezioni con diverse caratteristiche.

COLORAZIONE. Alcune sezioni, raccolte su vetrini gelatinati, verranno colorate con a) Tionina e b) Ematossilina ed Eosina, due colorazioni classiche comunemente utilizzate in neuroanatomia.

Il protocollo prevede per entrambe i seguenti trattamenti: immersione in Xilolo, reidratazione in scala alcolica, immersione nel colorante,

differenziamento, disidratazione e montaggio delle sezioni con coprioggetto.

Su altre sezioni verrà iniziato il trattamento con una Lectina vegetale che consente, mediante una reazione citochimica, di visualizzare l’endotelio vascolare e la microglia (una particolare classe di cellule gliali).

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Immagini a piccolo (A) e medio (B) ingrandimento di sezioni di corteccia cerebrale colorate con tionina (blu) per evidenziare la disposizione dei neuroni in strati sovrapposti.

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20Attività 3 Il cervello in technicolor

L’ identificazione di componenti specifiche del tessuto nervoso (e di tutti i tessuti in generale) richiede tecniche di “colorazione” capaci di rendere selettivamente visibili singole molecole.

L’esperimento prevede l’impiego della lectina biotinilata LEA che consentirà, mediante una reazione citochimica, di visualizzare l’endotelio dei vasi sanguigni presenti nel tessuto nervoso e la microglia.

Le lectine sono proteine o glicoproteine di origine non immune, derivate da piante, animali o microrganismi, che riconoscono e legano specificamente carboidrati terminali o subterminali. Le lectine sono molto sensibili e stabili e rappresentano, quindi, uno strumento di facile impiego per rivelare, mediante metodiche citochimiche, l’espressione di specifici carboidrati in una grande varietà di tessuti e cellule sia animali che vegetali.

Tra le lectine impiegate per lo studio del tessuto nervoso la lectina di pomodoro LEA (Lycopersicon esculentum Agglutinin) viene ampiamente utilizzata per studiare la vascolarizzazione, sia in condizioni normali che patologiche, in quanto marca i residui di N-acetil-D-glucosammina presenti nel glicocalice dell’endotelio vascolare e per evidenziare la microglia, soprattutto in condizioni patologiche.

Nell’esperimento verrà utilizzata la lectina LEA “biotinilata”, cioè legata alla biotina, che ne consentirà la visualizzazione al microscopio ottico.

La biotina è una vitamina idrosolubile particolarmente utile in citochimica per due peculiari caratteristiche: a) le ridotte dimensioni consentono di coniugare molte molecole di biotina ad una stessa molecola di lectina senza alterarne le caratteristiche funzionali; b) ha un’elevata affinità per l’avidina, una glicoproteina contenuta nell’albume dell’uovo, importante per la sua visualizzazione. La biotina legata alla lectina LEA verrà infatti evidenziata con la miscela ABC (Avidin-Biotin Complex), costituito da avidina e da un enzima (perossidasi) biotinilato. Il complesso viene preparato circa 30 minuti prima dell’uso, miscelando i due componenti. La stechiometria della reazione di miscelazione è calcolata in modo che l’enzima biotinilato si leghi alla avidina e che quest’ultima conservi almeno un sito libero per legarsi, a sua volta, con la biotina presente sulla lectina.

Il protocollo prevede i seguenti passaggi:Xilolo, reidratazione in scala alcolica, incubazione con detergente, incubazione con

lectina (90’), lavaggi, incubazione con complesso ABC (90’ = pausa pranzo).Le sezioni vengono poi lavate in tampone ed incubate con la miscela di rivelazione

che contiene acqua ossigenata (substrato dell’enzima perossidasi) e diaminobenzidina (cromogeno che permette la formazione di un prodotto di reazione colorato a seguito della interazione enzima-substrato).

I partecipanti potranno seguire direttamente al microscopio la comparsa del prodotto di reazione.

Seguirà l’osservazione al microscopio ottico a luce trasmessa con il commento dei preparati realizzati nella giornata.

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Sezioni di corteccia cerebrale sottoposte a reazione citochimica con b-LEA.Il prodotto di reazione marrone evidenzia nelle immagini a piccolo (A) e medio (B) ingrandimento l’endotelio dei vasi sanguigni; a forte ingrandimento si identificano anche cellule della microglia (C).

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Umberto FascioUniversita‘ degli Studi di Milano

Seminario 4 Microscopia in fluorescenza e confocale

Microscopia in fluorescenza e confocale: Principi generali e applicazioni allo studio del sistema nervoso Umberto Fascio e Silvia De Biasi

La fluorescenza è la proprietà che alcune molecole hanno di assorbire luce ad una lunghezza d’onda e di emetterla ad un’altra più lunga. Le molecole fluorescenti si possono quindi visualizzare mediante un microscopio ottico “a fluorescenza” dotato di: a) una sorgente di luce (lampada a vapori di mercurio); b) un filtro di eccitazione (che seleziona la lunghezza d’onda che colpisce il preparato); c) uno specchio dicroico e d) un filtro di emissione (che seleziona la lunghezza d’onda emessa dal preparato), scelti in base alle caratteristiche di eccitazione ed emissione della specifica molecola fluorescente da rilevare. Il vantaggio di tale approccio è che se una molecola fluorescente viene illuminata alla lunghezza d’onda di assorbimento ed osservata attraverso un filtro che permette il passaggio della sola lunghezza d’onda di emissione, tale molecola si vede risplendere nettamente contro uno sfondo scuro, anche se presente nel campione in piccole quantità.

Dato che le molecole spontaneamente fluorescenti sono molto scarse nei tessuti, per questo tipo d’indagine vengono comunemente utilizzati dei “coloranti fluorescenti” (chiamati fluorocromi), capaci di evidenziare selettivamente specifici componenti tissutali. L’esistenza di fluorocromi con caratteristiche diverse permette inoltre di evidenziare contemporaneamente più molecole nello stesso campione. Uno svantaggio del microscopio a fluorescenza è che la luce di eccitazione illumina tutto lo spessore del campione, eccitando i fluorocromi presenti sul piano di fuoco ma anche quelli sopra e sotto il piano di fuoco. Ciò può rendere l’immagine confusa e dotata di basso contrasto, rendendone quindi difficile l’interpretazione.

Silvia De BiasiUniversita‘ degli Studi di Milano

Esempio di marcatura multipla ottenuta al microscopio confocale. L’immagine mostra un neurone del midollo spinale dopo: A, colorazione con Neurotrace (blu) per evidenziare il corpo cellulare; B, colorazione con Neurotrace (blu) e marcatura citochimica con la lectina WFA (verde) per evidenziare la rete perineuronale; C, colorazione con Neurotrace (blu) e marcatura immunocitochimica con anticorpi anti-sinaptofisina (rosso) per evidenziare i bottoni sinaptici. In D tutte le marcature sono state sovrapposte.

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Il microscopio confocale è uno strumento complesso che permette innanzitutto di ovviare a questo problema. Infatti, utilizzando un laser come fonte luminosa, tale microscopio consente di mettere a fuoco un singolo piano di spessore controllato (detto “sezione ottica”), selezionato in un campione spesso, rigettando la luce che proviene da regioni fuori fuoco sopra e sotto quel piano e creando quindi immagini molto nitide. Con la microscopia confocale è inoltre possibile acquisire una serie di sezioni ottiche nello spessore (asse “z”) del campione, assemblarle e farne una ricostruzione tridimensionale.

Nel seminario saranno illustrati i principi generali dei due tipi di microscopia e le principali applicazioni in campo neuroanatomico quali: la tecnica di “fluorescenza indotta”, messa a punto nella seconda metà del secolo scorso per evidenziare i neurotrasmettitori dopamina e serotonina; l’uso di anticorpi e traccianti fluorescenti, introdotti artificialmente nei tessuti; l’impiego di molecole reporter fluorescenti (quali la Green Fluorescent Protein, GFP) per monitorare l’espressione genica in specifiche sottopopolazioni neurali.

Seminario 4 Microscopia in fluorescenza e confocale

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23Seminario 5 Come produrre un fiore

Nelle piante, diversamente da quanto avviene nelle specie animali nelle quali la gametogenesi inizia già durante la fase embrionale dell‘organismo, gli organi riproduttori dai quali si origineranno i gameti si formano nella fase post-embrionale, quando fattori ambientali quali la temperatura e la durata del giorno e fattori endogeni quali la statura della pianta sono favorevoli alla riproduzione. Nelle Angiosperme gli organi riproduttori maschili e femminili si trovano riuniti nel fiore, una struttura complessa composta da diversi organi, che sono foglie modificate. Nel fiore ci sono anche organi colorati aventi funzione vessillare, cioè in grado di attrarre gli insetti impollinatori. Il fiore riveste un ruolo di importanza primaria in ambito agricolo. Dai fiori si originano infatti, in seguito a fecondazione, i frutti e i semi, la cui importanza e’ innegabile per l‘alimentazione umana e animale.

Nel corso del seminario verrà fornita una visione d’insieme di quelli che sono i principali meccanismi regolanti la formazione del fiore nella specie modello Arabidopsis thaliana. Verranno successivamente presentate le tecniche utilizzate per lo studio di tali meccanismi. Enfasi particolare verrà assegnata alle tecniche di microscopia.

Le moderne tecniche di microscopia, abbinate a colorazioni e marcature fluorescenti, sono infatti di enorme aiuto agli scienziati per indagare ed elucidare i processi di sviluppo delle piante.

Lucia ColomboUniv. di Milano

Come produrre un fioreLucia Colombo, Monica Colombo, Martin Kater

Monica ColomboUniv. di Milano

Martin KaterUniv. di Milano

Fiore di Arabidopsis

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Come produrre un fioreLucia Colombo, Monica Colombo, Martin Kater

Attività 4 Come produrre un fiore15-18

Lo sviluppo del fiore è stato molto studiato nella pianta modello Arabidopsis thaliana. Il fiore si origina a partire da un gruppo di cellule meristematiche che prende il nome di meristema fiorale. I differenti organi fiorali sono posizionati in verticilli concentrici, per cui si avrà, dall’esterno verso l’interno, sepali, petali, stami e pistillo (o gineceo). Lo studio di mutanti fiorali in Arabidopsis e in Antirrhinum majus (bocca di leone) ha portato alla scoperta che l’identità degli organi fiorali è controllata da tre classi di geni omeotici (classe A, B e C).

All’interno del pistillo, l’organo riproduttore femminile, si sviluppano gli ovuli, dai quali dopo la fecondazione si origineranno i semi. L’ovulo contiene il megagametofito o gametofito femminile, che si origina a partire da una cellula dell’ovulo che va incontro a divisione meiotica. La megaspora funzionale così originatasi effettua tre divisioni mitotiche successive senza citodieresi e forma perciò un sacco embrionale cenocitico contenente otto nuclei aploidi. In seguito a migrazione dei nuclei aploidi

e successiva cellularizzazione si origina il gametofito femminile maturo che è costituito da sette cellule: tre cellule antipodali, due cellule sinergidi, la cellula uovo (il gamete femminile) e la cellula centrale, binucleata. La fusione tra gameti femminili e maschili (fecondazione) porta alla formazione della successiva generazione sporofitica.

Il nostro laboratorio studia i processi molecolari che sono alla base della formazione del meristema fiorale e della differenziazione degli organi fiorali nonché i processi che portano alla formazione dell’ovulo e del sacco embrionale. Nei nostri studi ci avvaliamo

dell’utilizzo di mutanti che vengono caratterizzati morfologicamente mediante tecniche sia di microscopia ottica sia di microscopia elettronica a scansione (SEM), che consente una analisi molto più dettagliata delle strutture.

Una domanda che si presenta di frequente è capire se le strutture mutanti che osserviamo hanno modificato oppure mantenuto la loro identità originaria. Per far questo ci avvaliamo di geni marcatori che presentano una espressione specifica per una determinata popolazione cellulare. L’espressione di questi geni può essere monitorata o mediante tecniche di ibridazione in situ o mediante geni reporter.

Schema ABC adattato da Kanno, A., Nakada, M., Akita, Y., and Hirai, M. (2007). Class B gene expression and the modified ABC model in nongrass monocots. ScientificWorldJournal 7, 268-279.

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Nella ibridazione in situ si utilizza una sonda specifica per identificare il profilo di espressione di un gene in un tessuto. I geni reporter sono invece geni la cui espressione nei tessuti è facilmente monitorabile, ad esempio mediante microscopia a fluorescenza (nel caso si usino proteine quali la GFP) o mediante colorazioni istochimiche quali il saggio GUS (saggio di attività beta-glucuronidasica).

Esempio di saggio GUS su un fiore maturo di Arabidopsis

Attività 4 Come produrre un fiore15-18

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Furthermore, the author of the derivative work may not imply that the derivative work is endorsed or approved by the

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Annex

da rivedere

1.

2.

3.

4. Detailed protocol of Activity 3: Tricks to protect a broken heart

5. Science in School Article: A bright future for light microscopy

6. CBE - Life Sciences Education Article: Using a Replica of Leeuwenhoek’s Microscope to Teach the History of Science and to Motivate Students to Discover the Vision and the Contributions of the First Microscopists

7. Selection of teaching resources