2011_5 Transformacion Vegetal

5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal

1/106

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

AgrobiotecnologaCurso 2011

Sistemas de transformacin vegetal

Alejandro Mentaberry


2/106

Sistemas de transferencia gentica en plantas

Referencias

Biologa deAgrobacterium tumefaciens

Vectores basados en el plsmidos T

Protocolos de transformacin medianteA. tumefaciens yA. rhizogenes

Sumario

Genes reporteros

Agrobiotecnologa

Sistemasde transformacinvegetal

Transformacin por biobalstica

Transformacin con whiskersde carburo de silicio

Transformacin por microinyeccin

Sistemas de transformacin gentica de plantas portransferencia directa de ADN

Transformacin mediante electroporacin y/omtodos qumicos


3/106

Sistemas de transferencia gentica

en plantas

Agrobiotecnologa



4/106

Cultivo

de tejidos ytransformacin

gentica

No

satisfactorio

No

satis

factorio

Agrobiotecnologa


Adaptado de: Birch, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1997.


5/106

Tipos

de explantosusados para latransformacinde diferentes

especies

Especie Tipo de explanto

Tabaco Cotiledn, hoja, tallo

Petunia Hoja

Tomate Cotiledn, hoja

Lechuga Cotiledn, hoja

Arabidopsis Hoja, raz

Lino Hoja, hipoctilo, cotiledn

Brassica napus Tallo, hipoctilo, cotiledn

Girasol Hipoctilo

Algodn Hipoctilo, cotiledn

Papa Tallo, hoja

Soja cotiledn

Agrobiotecnologa

Sistemas detransformacinvegetal


6/106

Sistemas de transferencia de ADN basadosen vectores biolgicos

- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciensy Agrobacterium rhizogenes

- Sistemas basados en virus vegetales

Sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia por biobalstica

- Transferencia mediada por cationes divalentes

y/o electroporacin

- Transferencia con whiskersde carburo de silicio

- Transferencia por microinyeccin

Sistemas de

transformacingenticaen plantas

Agrobiotecnologa



7/106

Biologa de Agrobacterium tumefaciens

Agrobiotecnologa



8/106

Agrobacterium

tumefaciens

Tumor de tallo provocado

por Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Agrobiotecnologa



9/106

Ciclo de la enfermedad de la agalla de corona

causada por Agrobacterium tumefaciens

Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.


10/106

Procesos

celularesinvolucradosen las etapasde interaccin

entre la bacteriay la planta

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

Procesos celulares Etapas de infeccin

Agrobacteriumse une ala clula hesped

A: Reconocimiento clula-clula

B: Procesamiento del ADN

C: Empaquetamiento del ADN

D: Transporte intercelular

E: Importacin al ncleo

F: Integracin del ADNy expresin de los genes

BI

Hebra T

Formacin del complejo Tinmaduro, compuesto porVirD2 y la hebra T

Formacin del pilus para eltransporte del complejo Tdentro de la clula hesped

Importacin de la hebra T al

ncleo de la clula hesped

Integracin de la hebra T y laformacin del tumor

Formacin del complejo Tmaduro, compuesto porVirD2 y la hebra T cubiertapor VirE2

BD

Agrobiotecnologa



11/106

Mapa gentico

del plsmido Tide octopina

BI BD

Agrobiotecnologa



12/106

Regiones homlogas en los plsmidos Ti de octopina

(pTi Ach5) y de nopalina (pTi C58)


13/106

La regin T est

definida por dosrepeticionesdirectas de

25 pb altamente

homlogas

Agrobiotecnologa



14/106

Estructura de la regin T de un plsmido Ti de octopina


15/106

Mecanismos moleculares implicados enla transformacin por Agrobacterium tumefaciens

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

2


16/106

Agrobacteriumtumefaciensposeeun sistemaregulatorio de doscomponentes parareconocer las

clulas vegetalessusceptibles

Agrobiotecnologa



17/106

El complejo T esta compuesto de una cadenasimple de ADN-T cubierta por protena VirE2. Una

nica molcula de protena VirD2 se halla unidacovalentemente al extremo 5 del DNA. Se estimaque se requieren 600 molculas de VirE2 para

recubrir los 20 Kbp del ADN-T.

Procesamiento de la hebra T y formacin del complejo T maduro


18/106

Ensamblaje

de las protenasde Agrobacteriuminvolucradasen el transportedel complejo T

Tomado de: Zupan et al., Plant J., 2000.

VirB2

Agrobiotecnologa



19/106

(1) y (3): digestin de las cadenas desplazadas de ADN de la plantapor endonucleasas. (2): digestin del extremo no apareado

del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes en la cadenadesapareada del ADN de la planta

La integracindel ADN-T algenoma de la clulavegetal involucrael apareamientono homlogo entre

ste y el ADNcromosmico

Agrobiotecnologa



20/106

Vectores basados en plsmidos Ti

Agrobiotecnologa



21/106

La capacidadde Agrobacteriumtumefaciensde introducir ADNen el genomade la planta permiti

desarrollar vectoresplasmdicosbasadosen el plsmido Ti

Agrobiotecnologa



22/106

Ejemplo

de vectorcointegrado:pAP2034

Agrobiotecnologa



23/106

Ejemplos de vectores binarios

Mapa de restriccinde los plsmidospBIN19; pPZP111;pMON10098;pGreen0029.

Abreviaturas:BI: borde izquierdo;ori: origen dereplicacin;BD: borde derecho.

Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.


24/106

Optimizacin del diseo de los vectores binarios

Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.

SiColE1pVS1BICloranfenicolSi98909pPZP111

Si

No

Si

No

No

No

Si

LacZ

Kanamicina

Tetraciclina

Gentamicina

Ampicilina

Tetraciclina

Ampicilina,

estreptomicina y

espectinomicina

Kanamicina

Seleccinbacteriana

BI

BI

BI

BD

BD

BD

BD

Marcador

deseleccin

en:

pSa

pRK2

pRi

pRK2

pRK2

pRi

pRK2

Agrobacterium

Origen de replicacin

pUC

pRK2

ColE1

ColE1

ColE1

ColE1

pRK2

E. coli

Si69200pPCV001

Si713200pGA482

Si217500pC22

Si911777pBIN19

Si425700pJJ1881

Si514440pCGN1547

No184632pGreen0029

Mobilizacin

Sitios

nicos derestriccinen ADN-T

Tamao(kb)

Vector

SiColE1pVS1BICloranfenicolSi98909pPZP111

Si

No

Si

No

No

No

Si

LacZ

Kanamicina

Tetraciclina

Gentamicina

Ampicilina

Tetraciclina

Ampicilina,

estreptomicina y

espectinomicina

Kanamicina

Seleccinbacteriana

BI

BI

BI

BD

BD

BD

BD

Marcador

deseleccin

en:

pSa

pRK2

pRi

pRK2

pRK2

pRi

pRK2

Agrobacterium

Origen de replicacin

pUC

pRK2

ColE1

ColE1

ColE1

ColE1

pRK2

E. coli

Si69200pPCV001

Si713200pGA482

Si217500pC22

Si911777pBIN19

Si425700pJJ1881

Si514440pCGN1547

No184632pGreen0029

Movilizacin

Sitios

nicos derestriccinen ADN-T

Tamao(kb)

Vector


25/106

Genes selectores para transformacin de plantas

MetotrexatoPlsmido R67Dihidrofolato reductasadhfr

Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichushindustanus

Resistencia a bleomicinaBle

Kanamicina, G418,paromomicina, neomicina

Tn5Neomicina fosfotransferasanptII

EstreptomicinaTn5Estreptomicinafosfotransferasa

SPT

Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV

CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetiltransferasa

cat

GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa

EPSP

Fosfinotricina, bialofosStreptomiceshygroscopicus

Fosfinotricin acetiltransferasa

bar

GentamicinaSerratia marcescens;Klebsiella pneumoniaeGentamicin-3-N-acetiltransferasaaacC3, aacC4

SeleccinFuenteProducto genticoGen de seleccin

MetotrexatoPlsmido R67Dihidrofolato reductasadhfr

Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichushindustanus

Resistencia a bleomicinaBle

Kanamicina, G418,paromomicina, neomicina

Tn5Neomicina fosfotransferasanptII

EstreptomicinaTn5Estreptomicinafosfotransferasa

SPT

Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV

CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetiltransferasa

cat

GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa

EPSP

Fosfinotricina, bialofosStreptomiceshygroscopicus

Fosfinotricin acetiltransferasa

bar

GentamicinaSerratia marcescens;Klebsiella pneumoniaeGentamicin-3-N-acetiltransferasaaacC3, aacC4

SeleccinFuenteProducto genticoGen de seleccin


26/106

4-metil triptofanoCatharanthus roseusTriptofano decarboxilasatdc

Acido 2,4diclorofenoxiactico

Alcaligenes eutrophus2,4-D monooxigenasatfdA

AtrazinaAmaranthus hybridusProtena QnpsbA

BromoxinilKlebsiella ozaenaeBromoxinil nitrilasabxn

SulfonamidaPlsmido R46Dihidropteroato sintasasul

Alta concentracin de

lisina y treonina

E. coliAspartato kinasaAK

S-aminoetil L-cistenaE. coliDihidroxipicolinato sintasaDHPS

Manosa 6PE. coliManosa 6P-isomerasamanA

Herbicida sulfonilureaArabidopsis thalianaAcetolactato sintasaCsrl-l

SeleccinFuenteProducto genticoGen selector

Genes selectores para transformacin de plantas


27/106

manosa-6P

fructosa-6P

manosa6Pisomerasa

Gen manA de Escherichia coli

Cultivos transformados:Arabidopsis, cebada, meln,tomate, calabaza, girasol,remolacha, nabo, cassava.

Ejemplo de seleccin positiva: manosa-6P isomerasa

Comparacin de frecuencias de transformacin entre manosaisomerasa y gen de resistencia a kanamicina (remolacha)

Comparacin entre mtodos de seleccin basados en manosaisomerasa y resistencia a kanamicina (remolacha)


28/106

Eliminacin de los genes marcadores:

vectores basados en elementos transponibles

Vector de Tipo 1, contiene tanto el gen que codifica para la transposasacomo el gen de seleccin en el mismo vector. En el vector de Tipo 2,

la transposasa es aportada en transpor un vector helper.

Tipo 1

Tipo 2

BI Ds Gen de inters Ds Transposasa Marcador deseleccin

BD

BI Ds Gen marcador Ds Gen de inters BD

Tipo 1

Tipo 2

BI Ds Gen de inters Ds Transposasa Marcador deseleccin

BD

BI Ds Gen marcador Ds Gen de inters BD


29/106

Este sistema permite la delecin de ADN por recombinacin homloga de regionesintracromosmicas (ICR) entre dos secuencias homlogas. El gen tmscodifica la cido

indolcetico hidrolasa que permite convertir naftaleno acetamida (NAM) en cido naftalenactico (ANA), una auxina que evita la formacin de races y promueve la formacin de callos.

Ejemplo 1: Eliminacin de los genes marcadores en

plantas transgnicas por recombinacin gentica

Tomado de: Zubko et al., Nature Biotechnology, 2000.

attP: secuencia del bacteriofago 1

TBS: Transformation booster sequence

Efector: gen de inters

Tms2: cido indolactico hidrolasa (IAAH)


30/106

Seleccin

de plantasde tabacotransgnicaslibres de genes

selectores

A

B

Tomado de: Zubko et al., Nature Biotechnology, 2000.

A: seleccin en kanamicina; B: seleccin en NAM

+ tms2 - tms2

Despus de 3 a 5 meses se observ que varios brotes que sehaban desarrollado mostraban una coloracin blanca debido aque haban perdido el gen de resistencia a NTPII. Debido a que

tambin perdieron el gen tms2, este tejido pudo desarrollar races

Agrobiotecnologa



31/106

loxP

XVECre-int

HYG

Pr G10-20

loxPloxP Pr Nos Pr OlexA-46

XVE HYG Gen de inters TnosCre-intPr G10-20

loxPloxP Pr Nos Pr OlexA-46

XVE HYG Gen de inters TnosCre-int

Pr G10-20

loxP

Gen de inters Tnos

8 (LexA RE) Pr 35S (-46)

estradiolDUDLexA

DAVP16

DULRE

Ejemplo 2: Eliminacin de genes selectores

mediante el sistema Cre-lox

Adaptado de: Zuo et al., Nature Biotechnology, 2001.

XVE: activador transcripcionalquimrico constituido por los dominios

DUD LexA, DA VP16, y DUL RE.DUD LexA: dominio de unin al ADN

de la protena LexADA VP16: dominio activador de la

transcripcin VP16 delHuman Herpes Virus;

DUL RE: dominio de unin al ligandodel receptor de estrgenos.

prOlexA-46: promotor constituido por8 copias del operador LexA (LexARE)

fusionadas al promotor mnimo de 35S[pr35S(-46)]


32/106

Protocolos de transformacin mediante

Agrobacterium tumefaciens

Agrobiotecnologa



33/106

Transformacin mediante co-cultivo deAgrobacterium tumefaciens y discos de hojas de tabaco

Explante inicial

(hoja)

Disco foliar

Co-cultivo con unabacteria desarmada

en medio lquido

Co-cultivo en medioslido sin antibiticos

Medio de induccin debrotes con antibitico y

agente de seleccinMedio de enraizamiento con o

sin agente de seleccin

Planta transgnicaaclimatada en

invernadero

A B

C D

E F

A B

C D

E F


34/106

Transformacin

de cotiledonesde sojamedianteco-cultivo con

Agrobacteriumtumefaciens

Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003.

A B C

D E F

G H I

Agrobiotecnologa


A: explantos obtenidos a partir de plantas de soja de 5 d de edad. B: cotiledones incubados en un medioconteniendo Agrobacterium. C: explantos incubados en medio de induccin de tallos durante 28 d, losprimeros 14 d en ausencia de higromicina, y los segundos 14 d en presencia de higromicina. E, F, G:evolucin de los explantos en medio selectivo conteniendo higromicina durante 4 meses. H: plantas

seleccionadas in vitrode una altura de 4 cm. I: plantas transferidas a tierra en condiciones de invernculo.


35/106

Transformacin

de Arabidopsisthaliana porinfiltracin floralcon

Agrobacteriumtumefaciens

A B

DC

Tomado de: Bent, Plant physiology, 2001.

Las plantas florecidas se sumergen en un cultivode Agrobacterium tumefaciens. Luego se recogen las semillas

y se germinan en un medio con agente selector.

Agrobiotecnologa



36/106

Tiempos

estimadospara unprotocolo detransformacin

estndar

Co-cultivar discos de hojas con Agrobacterium

Lavar los discos de hojas

Tratar con antibitico para eliminar alAgrobacteriumy seleccionar las clulas

vegetales transformadas

Transpasar los discos de hojas sobrevivientesa medio fresco de seleccin / regeneracin

Enraizar las plntulas en seleccin

Rusticar las plantas transgnicas

1-2 das

2-4 semanas

6-10 semanas

4-6 semanas

Tiempo total en cultivo: 12-20 semanas

Agrobiotecnologa



37/106

Rpida: la protena recombinante puedeobtenerse en aproximadamente una semana.

Eficiente: alta eficiencia de transformacin;acumulacin de protena comparable con la deplantas transgnicas (hasta 40 mg/kg de hoja).

Simple: slo se requiere equipamiento bsico.

Flexible: puede utilizarse para producir protenasde membrana, enzimas o virus quimricos, o paraensayar promotores

Evaluacin de

construcciones genticaspor agroinfiltracin al vaco Hoja no infiltrada

Hoja infiltrada

Plantas tabaco

salvajes

Agrobacterium

recombinate

Agroinfiltracin en vaco

Purificacin

E xtraccin de protenas

Extracto

clarificado

Vaquero et al., FASEB J.16:408-410, 2002.

La tcnica es:

Hojas y flores agroinfiltrados con

construcciones del gen reportero uidAdirigidas por promotores tejido-especficos


38/106

Protocolo de transformacin mediante

Agrobacterium rhizogenes

Agrobiotecnologa



39/106

Agrobacterium

rhizogenes Tumor de races producido por Agrobacteriumrhizogenesen discos de remolacha

Gentileza del Dr. M. Tepfer

Agrobiotecnologa



40/106

Agrobacterium

rhizogenes

Gentileza del Dr. M. Tepfer

Cultivo de races de tabaco transformadasporAgrobacterium rhizogenes

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

Agrobiotecnologa



41/106

Transformacin va Agrobacterium rhizogenes


42/106

Algunos desafos de la transformacin va Agrobacterium

Uso de Agrobacteriumpara realizar recombinacin homloga. o sitio-especfica: frecuencia de integracin baja.

Expresin no predecible de los transgenes en la planta: efectos. de posicin, cromatnicos y de integracin del ADN-T sobre el. silenciamiento gnico.

Modificacin del genoma de Agrobacterium: alteracin del perfil. de expresin de acuerdo con distintos hospedadores vegetales.

Transformacin de hongos vegetales y animales mediante. Agrobacterium: transformacin de ms especies de hongos.


43/106

Genes reporteros

Agrobiotecnologa



44/106

Genes reporteros usados en transformacin de plantas

Genes reporteros-glucuronidasa

Protena de fluorescencia

verde

Cloranfenicolacetiltransferasa

Luciferasa

Luciferasa

Abreviaturagus/uidA

GFP

Cat

Luc

luxA, luxB

OrigenE. coli

Aequorea victoria

E. Coli

Photinus pyralis

Vibrio harveyi

DeteccinFluoromtrico (cuantitativo)

o histoqumico (in situ),no radiactivo

Fluorescencia,

no destructiva

Ensayo radiactivosensitivo, semi cuantitativo

Luminiscencia

Luminiscencia

Genes reporteros-glucuronidasa

Protena de fluorescencia

verde

Cloranfenicolacetiltransferasa

Luciferasa

Luciferasa

Abreviaturagus/uidA

GFP

Cat

Luc

luxA, luxB

OrigenE. coli

Aequorea victoria

E. Coli

Photinus pyralis

Vibrio harveyi

DeteccinFluoromtrico (cuantitativo)

o histoqumico (in situ),no radiactivo

Fluorescencia,

no destructiva

Ensayo radiactivosensitivo, semi cuantitativo

Luminiscencia

Luminiscencia


45/106

A B C D

Expresin

del gen uidAen Arabidopsisthaliana

www.plantphysiol.org

Tincin de vulos, sacos embrionarios y lculos enterosde Arabidopsis thalianamediante la reaccinhistoqumica de la enzima -glucuronidasa

luego de la infiltracin con Agrobacterium tumefaciens

A: fotografa de una flor completa donde se observan varios vulos teidos.B: Fotografa ampliada de un segmento floral donde se pueden ver vuloscompletamente teidos y vulos no teidos. C: Tincin del embrin o saco

embrionario, en vez del vulo entero. D: Cavidad del lculo completamente teido.

Agrobiotecnologa



46/106

Expresin

tejido-especfica

del gen uidAen Arabidopsis

thalianay Nicotianatabacum

Agrobiotecnologa

Sistemas detransformacinvegetal Panel Superior: 1) Expresin en flores, 2) Expresin confinada a la porcin entre

la silicua y el pecolo. 3 y 4): Cortes histolgicos del fruto. Panel inferior: (5) y (6):races completamente teidas. (7): Corte transversal de raz.

Tomadode:Karth

ikeyanetal.,PlantPhysiolog

y,2002.

1 2 3 4

5 6 7

Expresin del gen uidA en flores y frutos de Arabidopsis thaliana

Expresin del gen uidA en races de Nicotiana tabacum

Cortes histolgicos de raz

Flores Pecolos Cortes histolgicos de fruto

E i


47/106

Expresin

del gen uidAen plantasde maz

Tomado de: Frame et al., Plant physiology, 2002.

Seguimiento de la transformacin de embriones de maz

y regeneracin de una planta transgnica mediante

la reaccin histoqumica de la enzima -glucuronidasa.

B

DC

A

Agrobiotecnologa

Sistemas detransformacinvegetal A: expresin transitoria en embriones cigticos. B: expresin estable en callos obtenidos de un nico

embrin. C: hojas aisladas de plantas transgnicas y control. D: plantas transgnicas.

L t


48/106

Los puntosluminiscentes en la

medusa Aequoreavictoria se debena la presenciade la protena GFP

que emite energacomo luz verde

Aequorina

Ca2+-apo-aequorin-coelenteramida

Luz verde in vivomax = 509 nm

Luz azul in vitromax = 469 nm

+ Ca2+

+ GFP

Agrobiotecnologa


E i


49/106

A B

C D E

Expresin

del gen GFPen tejidosvegetales

Tomado de: Prof Chris Hawes, Research School of Biological & Molecular Sciences,OxfordBrookes University, Oxford, OX3 0BP, UK

Expresin del gen GFPen polen

de Nicotiana tabacum cv. Xanthi

Expresin del gen GFPen plantas transgnicas

de Arabidopsis thaliana y clulas BY2

Tomado de: Hudson et al., Molecular Ecology Note, 2001.

Agrobiotecnologa


La expresin del


50/106

A B C D E F

A B C

D E F

La expresin delgen gfppermite

identificar in vivolos patronesde crecimientodel floema en

hojas de tabacoen diferentesestadiosdel desarrollo

Tomado de: Wright et al., Mechanisms and Processes, 1999.

Desarrollo de la vena mayor en cotiledones

Desarrollo de la vena central y venas secundarias

en hojas inmaduras

Agrobiotecnologa


Expresin


51/106

Expresin

del gen GFPen plantastransgnicasde Nicotiana

benthamiana

A B

C

La expresin del gen GFP produce color verde o amarillo bajoiluminacin ultravioleta. En ausencia de GFP el tejido

se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila.

Agrobiotecnologa


Expresin


52/106

Expresin

del gen Lucen plantastransgnicasde Nicotiana

tabacum

Gen de luciferasa expresado en

plantas transgnicas de tabaco

Tomado de: Ow et al., Science, 1986.

Agrobiotecnologa



53/106

Sistemas de transferencia directa de ADN

Agrobiotecnologa


Sistemas de


54/106

Sistemas detransferenciadirectade ADN

Ventajas

- Son considerados sistemas universales porque, al no

depender de organismos vectores, pueden aplicarsea cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las clulas del organismo vectorde los tejidos o plantas transgnicas

- Requieren construcciones ms simples y pequeas

- Son apropiados para estudios de expresin transitoria

Desventajas

- Pueden resultar en un alto nmero de copias y/o copias

truncas del transgn y del vector en varios sitios delgenoma de las clulas transformadas

- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparicin dere-arreglos en los transgenes

Agrobiotecnologa



55/106

Transformacin por biobalstica o

bombardeo de micropartculas

Agrobiotecnologa


Las tcnicas


56/106

de biobalstica

fuerondesarrolladasen los aos 80

Bombardeo de micropartculas

1984. Sandford et al., describen la tcnica debombardeo de micropartculas para la transferenciadirecta de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).

Diseo del primer acelerador de micropartculasimpulsadas por explosin de plvora

Adaptado de: Morrishet al.,Transgenic Plants. Fundamentals and Applications, 1993.

Agrobiotecnologa


La biobalstica


57/106

es aplicadacon xitoen diferentestipos de

organismos

Bombardeo de micropartculas1987. Klein et al. demuestran la utilidaddel mtodo al observar expresintransitoria en clulas epidrmicas deAllium cepa usando un dispositivo deimpulsin a plvora y micropartculas

de tungsteno recubiertas de ADN.Microscopa de Normansky de clulasepidrmicas de Allium cepa luego de unbombardeo. Se observan 8 proyectiles(flecha) en el interior de una clula viva.

Barra: 20 m

1988. Christou et al. demuestran la utilidad del mtodo paratransferir ADN biolgicamente activo en clulas vivas y obtenertransformantes estables.

1988. Johnston et al. logran transformar por primera vezmicroorganismos y organelas.

1988. Wang et al., Mc Cabe et al., Christou et al. obtienen plantassuperiores transgnicas.

1991. Williams et al. demuestran la transformacin de animalesin vitroe in vivo.

Agrobiotecnologa


La


58/106

transformacinpor biobalsticadepende defactores fsicos,

qumicosy biolgicos

Parmetros fsicos y qumicos que influyen

en la transferencia del ADN- Mtodo de aceleracin de las micropartculas

- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumen

de las micropartculas

- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracindel ADN

- Vaco y distancias de bombardeo

- Dimetro de apertura de la placa de retencin

- Nmero de bombardeos

Parmetros relacionados con la construccin

gentica utilizada- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y

genes marcadores de seleccin

Agrobiotecnologa


La


59/106

transformacin

por biobalsticadepende defactores fsicos,

qumicosy biolgicos

Parmetros relacionados con el tejido o clulasblanco

- Tipo y capacidad de regeneracin in vitrode los explantos

- Preparacin y condiciones de cultivo de los explantos

pre- y post-bombardeo

- Requerimientos de temperatura, fotoperodo y humedad

de la planta donante de explantos y del tejido bombardeado

Agrobiotecnologa


Existen La aceleracin de las micropartculas puede


60/106

diferentes

sistemasde impulsinde micro-

partculas

La aceleracin de las micropartculas puedegenerarse por:

- Explosin qumica de plvora seca

- Descarga de helio a alta presin

- Descarga de aire, CO2 o N2 comprimido

- Descarga elctrica de alto voltaje y baja capacitanciao bajo voltaje y alta capacitancia

- Flujo de partculas o flujo de helio a baja presin por aspersin

- Flujo de helio con can de precisin

Acelerador de micropartculasideado por Sandfordet al.

(New York University, 1984)

Tomado de: http://www.smithsonianlegacies.si.edu/ objectdescription.cfm?ID=132

Agrobiotecnologa


Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas


61/106


Diagrama esquemtico del cana explosin de plvora PDS 1000

A: Antes de disparar

B: Despus de disparar

1: Ensamblaje del iniciador conun percutor activado por

solenoide.

2: Iniciador (carga de plvora).

3: Macroproyectil (bala de Nylon)portando microproyectiles.

4: Tubo de aceleracin (can).

5: Retn con placa de retencin.

6: Placa de retencin con el

macroproyectil deformado.7: Microproyectiles acelerados.

Adaptado de: Kleinet al., Bio/technology, 1992.



62/106

p

Modelo comercial actual

Medidor de presin de helio

Tubo de aceleracin de gas

Interruptores de control

Medidor de vaco

Portador del discode ruptura

Portador delmacroproyectil

Ensamblaje del propulsorde microproyectiles

Cmara debombardeo

Controles del flujode aire y de vaco

Clulas blanco

Soporte del blanco

Vlvula de medicinde helio

Modelo comercial actual




Medidor de vaco




Cmara debombardeo


Clulas blanco

Soporte del blanco





Medidor de vaco




Cmara debombardeo


Clulas blanco

Soporte del blanco


Acelerador de micropartculas PDS 1000/Hepor descarga de helio a alta presin

Soporte del tejido blanco

Acelerador

d l


63/106

de partculas

por descargade helio

a alta presin

PDS 1000/He

Preparacin de las muestras

1. Remocin del soporte e insercin del disco de ruptura

Agrobiotecnologa


Aceleradord l

Preparacin de las muestras


64/106

de partculas

por descargade helio

a alta presin

PDS 1000/He

p

2. Cargado de la muestra de micropartculas recubiertas de ADN

Micropartculasde oro

Micropartculasde tungsteno

3. Ensamblaje del lanzador de microproyectiles

0,6-3 m 0,2-3 m

Agrobiotecnologa


Mecanismo de disparo de un can impulsado S


65/106

por He a alta presin (PDS 1000/He)

Estado del disco de ruptura,macroproyectily malla de retencin luego del bombardeo

Distancias

d b b d


66/106

de bombardeocrticas en uncan de Hea alta presin

PDS 1000/He

A: Distancia entre la membrana de ruptura y la membrana transportadora (macroproyectil)B: Distancia entre la membrana transportadora (macroproyectil) y la malla de retencinC: Distancia entre la malla de retencin y el tejido blanco

Adaptado de: Hagio, JARQ,1994.

ControlPresin de ruptura

Distancia A

Distancia B

Distancia C

EfectoA > presin > velocidad

A < distancia > velocidad

A > distancia > velocidad

A > distancia < velocidad

ControlPresin de ruptura

Distancia A

Distancia B

Distancia C

EfectoA > presin > velocidad

A < distancia > velocidad

A > distancia > velocidad

A > distancia < velocidad

Agrobiotecnologa




67/106

p

Adaptado de: Rech y Aragao. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, Embrapa-SPI-Cenargen, 1998.

Acelerador de micropartculas

que utiliza helio a alta presin(EMBRAPA, 1998)



68/106

Acelerador de partculas Geneboosterimpulsado por alta presin de N2 comprimido

Pistola Gnica HeliosSistemasalternativos


69/106

alternativos

de aceleracinde

micropartculas

A

B

C

Agrobiotecnologa


Transformacin gentica de plantas in vivoLa pistolagnica Helios


70/106

g p

usando una pistola gnica Helios

gnica Helios

permite latransformacinde tejidos

in vivo

Agrobiotecnologa


Expresin transitoria del gen reportero uidAen explantos bombardeados con micropartculas


71/106

Expresin transitoria en hojas de Arabidopsis bombardeadas con unapistola Helios con y sin malla de difusin de micropartculas

Expresin transitoria en embriones inmaduros de centeno bombardeados con un can PDS1000 He usando diferentes concentraciones de micropartculas. A: 200 g, B: 100 g y C: 30 g

e e p a tos bo ba deados co c opa t cu as

Tomado de: Helenius et al., Plant Molecular Biology Reporter, 2000..

Tomado de: http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/2002/pub/agrar/02H059/prom.pdf

A B C

A B

Sistemas

alternativos deAcelerador de partculas impulsado


72/106

alternativos de

aceleracin delas partculas

por un arco voltaico (can elctrico Accell

)

Agrobiotecnologa


Tejidos blanco, genes reporteros y marcadores usadosen transformacin de monocotiledneas por biobalstica


73/106

en transformacin de monocotiledneas por biobalstica

Hordeum vulgareL. Suspensin celular uidA/cat nptII

Embriones/Callo uidA/cat nptII/barEmbriognico

Callos de microsporas uidA

Zea mays Suspensin celular uidA/cat nptII/bar

Suspensin celular cat/luc/uidA als/barCallo uidA barEmbriones uidA nptII/bar

Oryza sativa Suspensin celular cat/uidA nptII/csr-1

Callo uidA nptIIEmbriones nptII /hpt

Triticum aestivum Suspensin celular cat/uidA nptII /bar Base de hoja uidA nptII

Hoja uidA nptII

Callo uidA nptIIEmbriones/callo uidA nptII /bar

embriognico

Saccharum officinarum Suspensin celular uidA hpt/bar

Callo embriognico uidA nptII

Especie Tejido blanco Gen reportero Gen marcador

uid A:gen de -glucuronidasa de E. coli. cat:gen de cloranfenicol acetiltransferasa de E. coli. luc: gen deluciferasa de Photinus pyralis. bar: gen de fosfinotricina acetiltransferasa de S. hygroscopicus

csr-1/als: gen mutante de acetolactasa sintasa de Arabidopsis thaliana. hpt: gen de higromicina fosfotransferasade E. coli. npt II: gen de neomicina fosfotransferasa II de E. coli.

Promotores constitutivos usados en transformacinde inters agronmico por biobalstica


74/106

de inters agronmico por biobalstica

Uso en cerealestransgnicos

Actividad relativa enclulas de cereales

Ubi1-Ubi1intrn 1

TrigoCebada

Arroz

Caa deazcar

Arroz

MazAvenaTrigo

Arroz

MazPasturas

Alta

Moderada

Baja

Baja

Emu

35S-Adh1intrn 1

35S

ArrozModeradaAct1-Act1

intrn 1

Promotor

35S: Promotor de 35S de CaMV35S-Adh1 intron 1: Promotor de 35S

de CaMV e intrn de alcoholdeshidrogenasa de mazEmu: Promotor modificado de alcoholdeshidrogenasa de mazAct1-Act1 intrn1: Promotor e intron deactina de arrozUbi1-Ubi1 intrn: Promotor e intrn deubiquitina de maz

Tejidos blanco, genes reporteros y marcadores usados entransformacin de dicotiledneas por biobalstica


75/106

Especie

Carica papaya

Glycine max

Nicotiana tabacum

Helianthus annuus

Liriodendrontulipifera

Gosypiumhirsutum

Tejido blanco

Suspensin celular

Meristemas

Callos embriognicos

Polen

Suspensiones

Hoja / cloroplasto

Hoja

Meristemas

Suspensin celular

Suspensin celular

Gen reportero

uidA

uidA

uidA / gfp

uidAuidAuidA/gfpuidA/gfp

uidA

uidA

uidA

Gen marcador

nptII

nptII

hpt / nptIIbar

nptIIbarnptIInptII

nptII

nptII

nptII/bar

Especie

Carica papaya

Glycine max

Nicotiana tabacum

Helianthus annuus

Liriodendrontulipifera

Gosypiumhirsutum

Tejido blanco

Suspensin celular

Meristemas

Callos embriognicos

Polen

Suspensiones

Hoja / cloroplasto

Hoja

Meristemas

Suspensin celular

Suspensin celular

Gen reportero

uidA

uidA

uidA / gfp

uidAuidAuidA/gfpuidA/gfp

uidA

uidA

uidA

Gen marcador

nptII

nptII

hpt / nptIIbarcsr-1nptIIbarnptIInptII

nptII

nptII

nptII/bar

uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli; gfp: gen de la protena de fluorescencia verde de Aequorea victoria; bar:gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus; hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa deEscherichia coli; npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli; csr-1: gen de una forma alterada de la enzimasintasa del cido acetohidroxil, tambin conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.

Tipos de explantos utilizados paraParmetros

relacionados


76/106

A y B: callos de maz. C: brotes primordiales de maz.D y E: callos y brotes de soja. F: pice de una plntula de

algodn de 4 das (M: meristema apical y P: primordio foliar).

experimentos de transformacincon el tejidoo clulasblanco

Adaptado de: Hansen and Wright, Trends in Plant Science, 1999.

A B C

D E F

P

M

Agrobiotecnologa


Transformacin de Oryza sativaa partir de embriones inmaduros

Plantas

transgnicas


77/106

A, B, C: expresin transitoria del gen uidA en embriones inmaduros

24 h post-bombardeo. D y E: embriones inmaduros bajo seleccin enhigromicina. F: regeneracin de los callos transgnicos bajo seleccin.

Tomado de: Christou, Trends in Plant Science, 1996.

g

obtenidas porbombardeo demicropartculas

AA

DD

BB

EE

CC

FFFF

Agrobiotecnologa


Transformacin de Festuca arundinaceaa partir de suspensiones celulares

Plantas

transgnicas


78/106

A: suspensin de clulas de Festuca arundinaceasobre papel de filtro

antes del bombardeo. B: seleccin de clulas transformadas en mediode seleccin conteniendo higromicina. C y D: plntulas transgnicasde Festuca arundinacearegeneradas a partir de callos resistentes.

Tomado de: http://www.noble.org/ForgBiot/GeneticTransformation/

g

obtenidas porbombardeo demicropartculas

DC

A B

Agrobiotecnologa


Plantas transgnicas obtenidas por bombardeode micropartculas


79/106

p

A: tejido embriognico. B: expresin transitoria del gen uidA en tejido embriognico bombardeado. Cy D: tejido embriognico en seleccin post-bombardeo. E: germinacin de embriones somticos. F:

plantas transgnicas completas.

Transformacin de Glycine maxa partir de tejido embriognico

Adaptado de: http://www.cropsoil.uga.edu/homesoybean/somprot.htm

A B

ED

C

E F

AA BB

ED ED

C

EE F

Plantas transgnicas obtenidas por bombardeode micropartculas


80/106

A: Ensayo histoqumico de gusde cotiledones bombardeados. B y C: Formacin de yemas a partir

de cotiledones en medio de seleccin. D y E: Enraizamiento de yemas transgnicas en seleccincon higromicina. F: Ensayo histoqumico de gusen hojas de Cassava spp. no transgnicas y

transgnicas.

Transformacin de Cassavaspp. a partir de cotiledones

Tomado de: Zhang et al., Plant Cell Reports, 2000.

A B C

D E F

Expresin de GFP en hojas de petunia y embriones de trigo y sojabombardeados con acelerador de flujo de micropartculas

Expresin

transitoria


81/106

A y B: Embriones de soja. C,D y E: Embriones de trigo. F: Hoja de petunia.

Adaptado de: http:/ /www.oardc.ohio-state.edu/plantranslab/gfp.htm

en explantosbombardeados

conmicropartculas

A

B

C

E

F

D

Agrobiotecnologa


La biobalsticapuede utilizarse


82/106

- Transferencia de genes a clulas, tejidos. y rganos vegetales

- Transferencia de genes a microorganismos

y organelas (cloroplastos)

- Estudio de expresin transitoria

- Anlisis de promotores y de deleccin de genes

- Estudio de mecanismos de expresin. y regulacin de genes

- Transferencia de ARN viral

con diversosfines

experimentales

Agrobiotecnologa



83/106

Transferencia de ADN mediadapor electroporacin y/o mtodos qumicos

Agrobiotecnologa


Aislamientoy purificacin


84/106

de protoplastosde Nicotianatabacum

Adaptado de: Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, 1998.

Agrobiotecnologa


Electroporacin de protoplastos


85/106

Adaptado de Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, 1998.

Pulsador deelectroporacin

Cubetas deelectroporacin

Cultivo y regeneracin de protoplastos de tabaco

A B

Electroporaciny regeneracin


86/106

C D

E F

de plantasa partir deprotoplastos

Tomado de: Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, 1998.

Agrobiotecnologa


Protocolo detransformacin

d l


87/106

de protoplastosde Oryzasativaporelectroporacin

Agrobiotecnologa


Protocolo de co-transformacin de protoplastos de Oryza

ti d l id di ti t di t l t i


88/106

sativa con dos plsmidos distintos mediante electroporacin

Aislamiento y electroporacin de protoplastosde Citrus sinensis(naranjo dulce) con el gen gfp


89/106

Adaptado de: www.ushrl.saa.ars.usda.gov/hb/niedz/gfp/

Lnea celular embriognicausada como fuente

de protoplastos

Protoplasto fluorescentea las 24 h de la electroporacin

Protoplastos luego dela electroporacin

Callos embriognicos de 4semanas derivados de protoplastos

Callos embriognicos GFPpositivos a los 6meses de la transformacin

Planta regenerada a partir decallos en seleccin positiva

Lnea celular embriognicausada como fuente

de protoplastos

Protoplasto fluorescentea las 24 h de la electroporacin

Protoplastos luego dela electroporacin

Callos embriognicos de 4semanas derivados de protoplastos





Expresin estable de genes transferidos a protoplastosde plantas por mtodos qumicos y/o electroporacin


90/106

Adaptado de: Bilang et al. Plant Molecular Biology Manual, 1994.

nptII / kanamicinaPlantasMtodos qumicosPetunia hybrida

nptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosBrassica campestrisnptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosTriticum monococcum

hpt / higromicinaPlantas frtilesElectroporacinOryza sativa (Japonica)

dhfr/ metotrexatoCallosElectroporacinPanicum maximum

nptII / kanamicinaCallosElectroporacinBrassica napus

hpt / higromicinaPlantas frtilesMtodos qumicosArabidopsis thaliana

nptII/ kanamicina

hpt / higromicina

als / clorosulfuron

Plantas frtilesElectroporacinSolanum tuberosum

hpt / higromicinaPlantasMtodos qumicos / ElectroporacinDactylis glomerata

Zea mays

Festuca arundinacea

Oryza sativa (Indica)

Lolium multiflorum

Nicotiana tabacum

Especie

nptII / kanamicina

pat / fosfinotricina

Plantas frtilesMtodos qumicos

hpt / higromicina


hpt / higromicina

nptII / kanamicina

nptII / kanamicina

Gen marcador deseleccin / agente deseleccin

Plantas frtiles

Plantas frtiles

Callos

Plantas frtiles

Tipo detransgnico

Mtodos qumicos

Mtodos qumicos

Mtodos qumicos

Mtodos qumicos

Tcnica de transformacin

nptII / kanamicinaPlantasMtodos qumicosPetunia hybrida

nptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosBrassica campestrisnptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosTriticum monococcum

hpt / higromicinaPlantas frtilesElectroporacinOryza sativa (Japonica)

dhfr/ metotrexatoCallosElectroporacinPanicum maximum

nptII / kanamicinaCallosElectroporacinBrassica napus

hpt / higromicinaPlantas frtilesMtodos qumicosArabidopsis thaliana

nptII/ kanamicina

hpt / higromicina

als / clorosulfuron

Plantas frtilesElectroporacinSolanum tuberosum

hpt / higromicinaPlantasMtodos qumicos / ElectroporacinDactylis glomerata

Zea mays

Festuca arundinacea

Oryza sativa (Indica)

Lolium multiflorum

Nicotiana tabacum

Especie

nptII / kanamicina


Plantas frtilesMtodos qumicos

hpt / higromicina


hpt / higromicina

nptII / kanamicina

nptII / kanamicina

Gen marcador deseleccin / agente deseleccin

Plantas frtiles

Plantas frtiles

Callos

Plantas frtiles

Tipo detransgnico

Mtodos qumicos

Mtodos qumicos

Mtodos qumicos

Mtodos qumicos

Tcnica de transformacin

Electroporacin

de tejidos

organizados


91/106

A: diseo de la cmara de electroporacin B y C: preparacin de las muestras

para la electroporacin D: cmara dispuesta para la electroporacin

organizados

Adaptado de: Bilang et al. Plant Molecular Biology Manual, 1994.

Agrobiotecnologa


Electroporacin de tejidos intactos de caf


92/106

Expresin del gen uidA en tejidos de caf electroporados sin (A-B) y con (C-F) tratamiento enzimtico

A-B: clulas de callo embriognico C: callo embriognico. D: embrin en estado globular

E: embrin en estado de torpedo F: seccin de hoja de una planta in vitro

A B C

D E F

Adaptado de: Fernandez-Da Silva, Plant Biotechnology, 2003.

Produccin de plantas transgnicas por electroporacinde pro-embriones intactos de Nicotiana tabacum


93/106

A-E: expresin delgen uidA en clulasde pro-embrionesde Nicotianatabacum

electroporados

F: expresin del gengfpen pro-embrinelectroporado

A

DE

C

B

F

Tomado de: Shitao et al., Chinese Science Bulletin , 2000.


94/106

Transformacin con whiskersde carburo de silicio

Agrobiotecnologa


Transformacin de maz mediantewhiskersde carburo de silicio


95/106

A: suspensionescelulares de mazpenetradas por fibrasde carburo de silicio (0,3-

0,6 m por 10-100 m)

recubiertas de ADN(transformacin)

B: expresin transitoriadel gen uidA luego dela transformacin

C: callos resistentesa fosfinotricina

D y E: inflorescenciay fruto de una plantatransgnica R0

F: ensayos de resistenciaa fosfinotricina con plantasR1 dos semanas despusdel tratamiento

Adaptado de: Frame et al. The Plant Journal, 1994 y de Petolino et al. Plant Cell Reports, 2000.

A B C

D E F


96/106

Transferencia de ADN por microinyeccin

Agrobiotecnologa


Transformacin de clulas vegetales por microinyeccin

Se transformaron


97/106

Clula vegetal microinyectada

Micromanipulador

plantas deNicotiana tabacum,Petunia sp.,Brassica napusy Hordeum vulgare

A: Punta de un microelectrodo

Microinyeccin de ADN con microjeringa GEF

C


98/106

convencional (0.7 m).

B: Punta de un microinyector GEF(0.1 m).

C: Diagrama de la fentojeringade expansin por galistan (GEF).

1: DNA o fluorforo; 2: galistan(galio, indio y estao);3: aceite de silicona; 4: Tapade vidrio rellena con epoxi.

D: Diagrama del sosten/calentadorde la fentojeringa (GEF).1: Aire impulsado por una bomba;2: microjeringa GEF; 3: tubo

de plstico; 4: capilar; 5: resistenciade alambre; 6: fuente de poder

E: Inyeccin de Lucifer Yellowen una cianobacteria, F: en uncloroplasto simple de clula deparnquima de Vicia fava. G y H:

en ncleo de clulas de Xenopusdistal.

Adaptado de Knoblauch et al., Biotechnology, 1999.

A C

B

A

B

E

HG

F

D

C

Expresin de GFP

Microinyeccin de ADN con microjeringa GEF

A B C


99/106

pen cloroplastos luegode la inyeccin de ADN

A, D y G: Imagen

de cloroplastos pormicroscopia confocal.

B, E y H: Fluorescenciade GFP.

C, F e I: Fluorescenciacombinada de GFP y clorofila.

Adaptado de Knoblauch et al., Biotechnology, 1999

A-C:Fluorescencia de GFP en un cloroplasto a las 24 h de la inyeccin del ADNplasmdico.

D-F:Fluorescencia de GFP en tres cloroplastos a las 30 h de inyectar unode ellos con ADN

G-I:Fluorescencia de GFP en varios cloroplastos de la misma clula a los 3 dde inyectar uno de ellos con ADN

A B C

D E F

G H I

Transferenciadirecta de ADN

versus


100/106

versusAgrobacteriumtumefaciens?

A

vs.

Agrobiotecnologa


ReferenciasAgrobacterium

1. Tzfira, T. and Citovsky, V. Agrobacterium-mediated transformationof plants: biology and biotechnology.Current Opinion inBiotechnology, 17:147-154, 2006.

2. Gelvin, S.B. Improving plant genetic engineering by manipulatingthe host Trends in Biotechnology 21:95 98 2003


101/106

the host. Trends in Biotechnology, 21:95-98, 2003.

2. Gelvin, S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: thebiology behind the Gene-Jockeying tool. Microbiology andMolecular Biology Reviews, 67:16-37, 2003.

3. Tzfira, T. and Citovsky, V. Partners-in-infection: host proteinsinvolved in the transformation of plant cells by Agrobacterium.Trends in Cell Biology, 12: 121-129, 2002.

4. Bent, A.F. Arabidopsisin planta transformation. Uses, mechanisms,and prospects for transformation of other species. Plant Physiology,124:1540-1547, 2000.

5. Gelvin, S.B. Agrobacteriumand plant genes involved in T-DNAtransfer and integration. Annual Review of Plant Physiology andPlant Molecular Biology, 51:223-256, 2000.

6. Tzfira, T. and Citovsky, V. From host recognition to T-DNAintegration: the funtion of bacterial and plant genes in the

Agrobacterium-plant cell interaction. Molecular Plant Pathology,1:201-212, 2000.

7. Zupan, J., Muth, T.R., Draper, O. and Zambryski, P. The transfer ofDNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast offundamental insights. The Plant Journal, 23: 11-28. 2000.

Agrobiotecnologa


1. Christou, P. Genetic transformation of crop plants usingmicroprojectile development. The Plant Journal, 2:275-281, 1992.

2. Christou, P. Transformation technology. Trends in Plant Science,

1:423-431, 1996.

ReferenciasBiobalstica


102/106

3. Hunold, R., Bronner, R. and Hahne, G. Early events inmicroprojectile development: cell viability and particle location. ThePlant Journal, 5:593-604, 1994.

4. Klein, T.M, Wolf, E.D,, Wu, R, and Sandford J.C, High velocitymicroprojectiles for delivering nucleic acid into living cells. Nature,327:70-73, 1987.

5. McElroy, D. and Brettell, R.I.S. Foreign gene expression intransgenic cereals. Trends in Biotechnology, 12:62-68, 1994.

6. Potrykus, I., Bilang, R., Futterer, J., Sautter, C. and Schrott, M.Genetic engineering of crop plants. In: Agricultural Biotechnology.Altman, A. (ed.) pp. 119-159. Marcel Dekker, 1998.

7. Potrikus, I. Gene transfer methods. Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology, 42:205-225, 1991.

8. Taylor, N.J. and Fauquet, C.M. Microprojectile bombardment astool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and CellBiology, 21:963-977, 2002.

Agrobiotecnologa



103/106

Anexo. Biologa molecular de Agrobacterium

Agrobiotecnologa


Eventos que ocurren en el espacio extracelular

Los eventos moleculares mediados por Agrobacterium tumefacienspueden agruparse segn el espacio en donde ocurren


104/106

Eventos que ocurren en el espacio extracelular

Vector Control

Control CAX2Vector cnb

CAX2 cnb

Concentracin de Mn2+ (mM)

Densidadptica(6

50nm)

Vector

ControlControlCAX2Vector cnb

CAX2cnb

Densidadptica(650nm)

Sensores de Agrobacterium

CHvE

Seales de la planta

fenoles

P10 P21 VirA

Autofosforilacin de Vir A

VirG

Fosforilacin de VirG

Receptores de la

superficie celularde la planta

Protenas tipo vitronectina

Receptores de Agrobacterium

CHvA, CHvB, PscA, Att

Unin ala clulahesped

Genes de virulencia (vir) deAgrobacterium

1) Agrobacterium reconoce y se une a la clula husped.

azcares

2) El sistema de traduccin de seales de Agrobacterium reconoce seales especficas

de la planta.

3) La protena virG media la traduccin de seales y la activacin de los genes vir.

Eventos que ocurren dentro de Agrobacterium tumefaciens

4) Formacin de la cadena de ADN-T, complejo T inmaduro.5) Formacin del complejo T maduro.6) F i d l l j d t t t l t i B l t i D4


105/106

Induccin de la expresin de los genes vir

Genes de virulencia (vir) deAgrobacterium

Induccin de la expresin de los genes vir

VirB1, VirB3VirB4, VirB6VirB7, VirB8

VirB9, VirB10VirB11, VirD4

Ensamblajedel

complejo detrasporte

Ensamblajedel pilus

VirD1VirD2 VirC1

VirE2

VirE1

VirB2,VirB5

ComplejoVirE1/VirE2

Complejo endonucleasasVirD1/D2

Nicks enlos bordesdel ADN-T

Generacindel complejoT inmaduro

Hebra T/VirD2

Formacin del complejo Tmaduro

Hebra T/VirD2/VirE2

Disociacindel complejoVirE1/VirE2

Fosforilacin deVirG

Transporte del complejo Tmaduro dentro del citoplsma

de la planta

6) Formacin del complejo de transporte compuesto las protenas virB y la protena virD4.

Bordes del ADN-T

Canal entreclula vegetal yAgrobacterium

Eventos que ocurren dentro de la clula vegetal

7) El complejo T maduro es importado al ncleo.8) Integracin de la hebra de ADN-T al genoma de la planta


106/106

Agrobiotecnologa

Sistemas detransformacinvegetal:Agrobacteriumtumefaciens

Transporte del complejo T maduro

dentro delcitoplsma de la planta

VirD2/Hebra T/

VirE2

VIP1, VIP2AtKAPaPP2C

RocA, Roc4, CypA

Estabilizacin del complejo Te importacin al ncleoVirD2/Hebra T/VirE2

VIP1, VIP2AtKAPaPP2C

RocA, Roc4, CypA

Estabilizacin del complejo Te importacin al ncleo

VirD2/Hebra T/VirE2VIP1VIP2

Complejo TTransportedentro del

ncleo

VirD2

Hebra T

VirE2

=

Factoresnucleares

y ADNcromosmico

Integracin ytransformacin

gentica

8) Integracin de la hebra de ADN T al genoma de la planta.

NCLEO

CITOPLASMA

2011_5 Transformacion Vegetal

Documents

Transcript of 2011_5 Transformacion Vegetal