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2019-09-16 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1

2장. 미생물의 분자육종

1. 돌연변이

2. 재조합

3. 대사제어발효

4. 유전자 조작

경북대학교 미생물공학연구실KNUmbl

발효공학 2장 : 미생물의 분자육종


균주육종의 목적

생명현상은 유전자에 의해 결정--유전자 변화로 균주 육종 또는 개량 가능

-돌연변이, 유전적 재조합, 대사제어(조절)의 해제, 유전자 조작(유전공학)

균주 육종의 목적: 경제성, 관리 용이성

1) 산물의 수율 증대: 원료에 대한 수율 및 생산성 고--경제성

2) 값싼 기질 이용--경제성

3) 고농도 배지 성분에 대한 내성 증가--고농도발효법--시설 감소

: 내당성이 가장 중요

4) 발효시간의 단축--시설의 감소

5) 부산물 생산 감소--정제공정의 단순화--정제 및 제품화 용이

6) 점도 증가 및 거품 발생 감소--통기 목적

7) Phage에 대한 내성 증가

8) 새로운 대사산물의 생산

9) 기타 :

발효설비 및 공정에 적합

내열성 강(높은 발효온도에 내성)

생리적 성질의 안정성


2-1. 돌연변이(mutation)

: DNA 구조 변화 -- 단백질의 변화 -- 세포 형질 변화 : 물질 합성, 분해 등 대사

* 표현형(phenotype) : 세포의 형질이 발현되는 형 -- Ura-, Trp-, Xyl-,

- 합성유전자의 변이로 합성효소 실활 : 합성불가

- 분해유전자의 변이로 분해효소 실활 : 분해불가

* 유전자형(genotype) : 유전자의 형태 표시

- 세균의 경우 : Xyl [WT] – xyl [mt]

- 효모의 경우 : XYL [WT] – xyl [mt]***유전자가 여러 개인 경우 번호 또는 알파벳 붙임 - URA3,




1. 돌연변이와 수복기구

가. 돌연변이 기작

1) 유전자 변화: 유전자 염기서열의 변화염기치환(substitution)-점(point)변이 *GAT(Asp) - CAT(His), GCT(Ala) 염기부가(addition)/결실(deletion): 1개 이상 염기 첨가/결실: 구조이동변이

2) 유전자군 변화(chromosome mutation): 유전자의 순서가 변화유전자 중복(duplication): " 중복 a b c a b c d e유전자 전좌(translocation): " 위치 이동 a b d e c유전자 역위(inversion): " 위치 뒤바뀜 a b d c e

3) genome 변화(genome mutation) : chromosome의 수가 변화-개체에서 중요: 염색체의 이상으로 유전병 발생

(효모 2n=32, 사람 2n=46, 잉어 2n=104)-단수체 세균, 집단으로 존재하는 배수체 경우 - 무관 또는 특정 세포 문제



나. 변이의 수복(repair) : 염기 변화 회복-- 원래의 유전형질 회복* UV에 의한 변이 : thymine dimer 형성 –복제 방해

1) Photoreactivation (광재부활)

2) Excision repair (제거수복)

3) Recombinational (재조합수복)

4) SOS 수복 : DNA polymerase에 이상



다. 변이원(변이제, Mutagen): 변이를 유발시키는 물질--변이제가 수소결합 특성변화--염기쌍의 변화

1) HNO2(아질산): 염기 deamination(탈아미노반응) 촉매: base-NH2 + H2O -- base-OH + NH3

A(6-amino-Pu) to H, C(2-oxy-4-amino-Py) to U의 deamination--변이G(2-amino-6-oxy Pu) to X(C와 base pair) : 변이 X

2) Alkylating agent(알킬화제): 염기를 alkylation-주로 ethylation or methylation--주로 G의 7 위치-염기의 수소결합 특성 변화 - 복제 시 GC to AT-UV외에 가장 강력--모든 생물에 적용예) sulfate 계: DMS, DES(sulfate),

sulfonate 계: EMS, MMS, EES(sulfonate)

O∥

R-O-S-O-R'∥Osulfate

O∥R-S-O-R'∥Osulfonate

Cytosine

Adenine

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/06/Adenine_numbered.svg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8b/Cytosine_chemical_structure.svg



3) 염기유사물질(Base analog)

: 5-Bromouracil(A or G 와 염기쌍), 2-Aminopurine(T or C와 염기쌍)

* 5-BU (bromouracil)

-복제 시 T 대신 삽입하여 A와 base pair--tautomerization 후 G와 pair

4) NTG(MNNG, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)

G 를 7-methyl G로 변화(T와 base pair로 GC to AT)

--세균, 방선균, 효모, 곰팡이, 동식물

NH2NH=C

NH2guanidine

CH3N

NH=C NONH-NO2 MNNG

keto form: A와 수소결합 enol form: G와 수소결합

CH3이면 thymine

Tautom eri zationH

OH

N

N

BrN

N

H

H

O

O

H

Br

H

O1



5) acridine 유도체: intercalating reagent

: DNA 1bp와 길이 유사

- acriflavine, proflavine, acridine orange 등

- G와 결합하여 인접 bp 사이에 intercalation

- 복제 시 염기 결실 및 첨가: frame shift

6) 자외선(UV radiation): 15W, 10-40㎝, 10-70sec

가) 단파장 UV(200-300nM): pyrimidine dimer 또는 GC to AT

- 암실이나 600㎚ 이상에서 또는 repair inhibitor(ex. caffeine)처리

나) 장파장 UV(300-400nM): 변이력 약

- 상보적 가닥과 cross-link되어 변이

- photoreactivation X

7) NH2OH(hydroxylamine)

Cytosine + NH2OH -- 2-oxy-4-hydroxylamine Py + NH3

A와 염기 쌍 형성

8) Transposable elements : DNA의 임의부위에 삽입

- 다른 유전자의 중간에 삽입되어 그 유전자를 변이

- 어떤 것은 전사종지 신호 함유

NHOH

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8b/Cytosine_chemical_structure.svg


* Transposable element의 특성


1) Transposition-증식 중 genome의 임의의 부위에 삽입-B에 transposon이 생겨남

2) Transposable element의 duplication: 동일 DNA상에 transposon이 하나 더 생겨남

3) Transposable element의 insertion: 여러 부위에 insertion 가능

TnpA(transposase)

B+A A

B

cointegrate:transposon이 duplicate

A + BTnpR(resolvase)

WT DNA Tn

or or



2. 변이주의 종류-대사산물의 생산량 감소, 대사산물의 다량생산 (주목적) : 생화학적 변이주

가. 변이주의 종류

1) 영양요구성 변이주 (auxotrophic mutant) : 생육에 특정 영양물질 요구

: Ura-, His-, Ade- (phenotype)

2) 대사조절 변이주 (regulatory mutant): 대사조절 단백질 변이 –조절현상 변화

: gal80, xylR, arg80 (argRI), arg81 (argRII), car80 (cargRI) 등

3) 내성 변이주 (resistant mutant) : drug, analog에 대한 내성이 변화

– 저항성, 감수성 : Apr, 5-FTr, Mets

4) 치사변이주 (lethal mutant) : 생명현상에 중요한 유전자의 변이–변이주 사멸

5) 조건 치사변이주 (conditionally lethal mutant)

: 특정조건에서 생육이 불가능한 변이주

* 온도 감수성 변이주--30, 42oC --DNA polymerase I 조건치사 변이 경우



나. 변이의 종류

1) 변이제 사용 유무에 따라

가) 자연변이(spontaneous mutation) : 변이제 사용 무---10-6-10-7/generation

나) 인공변이(artificial mutation=induced mutation) : 변이제 사용하여 변이

2) 변화부위에 따라

가) Point mutation : 한 개의 염기쌍이 변화한 것

나) Multiple mutation : 두 개 이상의 염기쌍이 변화

3) 아미노산의 변화에 따라 ***유전암호 : ..\유전암호.ppt

가) Same sense mutation : 변화 무 – GCG, GCA, GCT, GCC 모두 Ala 암호화

나) Missense mutation : 다른 아미노산으로 변화

다) Nonsense mutation : 중간에 stop codon 생성

4) 기타

가) Temperature sensitive mutation (ts mutation, 온도감수성 변이)

: 특정온도에서만 변이 발현(high or low temperature)

나) 구조이동변이 (frame shift mutation) : 변이부위 이하의 모든 코돈이 변화

../유전암호.ppt



다. 복귀 돌연변이 (reversion) : back mutation, reverse mutation

: 2차 변이에 의해 원래의 표현형을 회복하는 현상

-- 원래 유전자형을 회복하는 경우 및 회복 못하는 경우 두 가지 모두

1) 원래 유전자형을 회복하는 경우

: 변이 부위가 원래의 염기서열로 변화하여 유전자형 회복

- 치환된 염기쌍이 변이에 의해 원래로 되돌아 감

삽입된 염기쌍의 deletion

결실된 염기쌍이 insertion

- 실제로는 거의 무

2) 원래 유전자형을 회복 못하는 경우 : 대부분

: 동일부위 및 다른 부위의 재변이로 원래의 표현형을 회복

- 변이 유전자 내부(intragenic reversion), 외부(intergenic reversion) 재변이

표현형질

wild type mutant typemutation

reversion



가) Intragenic reversion: 동일 유전자내 재변이에 의해 원래 표현형을 회복

(1) Charged amino acid의 경우

* 아미노산의 전하

- pH의 변화에 따라 하전 변화

* 산성 및 염기성아미노산 – 단백질 구조에 중요- Asp. Glu. : 산성아미노산

- His. Arg. Lys. : 염기성 아미노산

* 변이: 아미노산이 반대 하전의 아미노산으로 변화: 단백질 3차구조 변화

- 변이 아미노산이 원래 동일 아미노산으로 변화 - 염기서열 다를 수 있음

- 변이 아미노산이 원래 하전의 다른 아미노산으로 변화

- 변이부위 원래 아미노산과의 결합부위가 반대 하전의 아미노산으로 변화

+

-

-

+

+

-or+ +mutation reversion


(2) Hydrophobic region의 경우

: 변이 아미노산과의 결합부위가 비공유결합 가능 아미노산으로 변이

(3) 구조이동변이(frame shift 변이)의 경우

: 변이 하류의 재변이에 의해 reading frame이 회복

-- 재변이는 변이에 인접하는 부위에서 발생

-- 몇 개의 아미노산은 변화할 수 있음




나) intergenic reversion : 다른 유전자의 재변이에 의해 원래 표현형을 회복

(1) protein-protein interaction : 한 단백질이 두개 이상의 subunit로 구성된 경우

- 변이 : protein A의 변화로 protein B와 interaction 불가능: 표현형이 변화

- reversion : protein B가 변이된 단배질 A와 interaction 가능하게 변화

(2) chain termination mutation : 번역 stop codon의 생성

: GAG, AAG, CAG, TGG, TTG, TCG, TAT, TAC--- 1bp의 변화로 TAG 생성

- 아미노산을 연결하는 경우 가끔 있음 : suppression

(3) missense mutation의 경우

Val(nonpolar) - 변이로 Asp(polar) - suppression에 의해 Ala(nonpolar)로 번역

- mutant tRNA : anticodon의 변화로 두개의 코돈 동일하게 인식 가능

* missense suppressor tRNA



Reversion(=back mutation)을 이용한 발암물질의 검색

- Ames test – Bruce Ames 개발

: 미생물을 이용한 특정 물질의 돌연변이원성의 조사

His-

생육에 histidine 요구최소 배지에 생육불가능

His+

최소 배지에서 생육가능Mutagen(possible carcinogen)

2nd mutation


균주 및 방법

1) 균주: Salmonella enterica serovar. Typhimurium TA98과 TA100

: His- : histidine 요구주 - 염기치환 또는 구조이동 변이주

- histidine이 없는 최소배지에서 생육 불가

- 일부 복귀돌연변이는 가능

- histidine이 없는 최소배지에서 소수의 콜로니 형성

2) 배지: 고체 최소배지 - 미량의 histidine을 함유

: 변이주 약간의 균체가 증식 가능, 그러나 콜로니 형성 불가능 정도의 양

3) 방법

: 위의 고체 배지에 His- 균체 (조사물질 혼합 및 미혼합) 도말 배양

: 각각의 경우의 형성한 콜로니 수 조사

: 조사물질 첨가 경우 무첨가보다 콜로니 수 증가 : 돌연변이원성 유

: 콜로니 수의 차이에 따라 변이원성 강도 추정


-식품 추출물 첨가하여 최소배지에 생육하면 식품이 돌연변이원성 여부 결정-변이제와 식품추출물 첨가 시 최소배지에 생육 안하면 식품이 항돌연변이원성



3. 돌연변이주의 유도와 분리

가. 미생물의 성상

1) 세균, 효모 : 단수체(haploid, 1배체, n체) 세포 사용

-배수체 열성의 경우 변이 발현 X --상동염색체

-초기 대수증식기의 세포가 유리: 원심분리 후 세척하여 사용

2) 방선균, 곰팡이: 포자 이용(포자분리 설명) - 염색체 간단, 높은 변이빈도

나. 처리방법

: 변이 처리시의 세포농도: 10 8 cfu/ml가 적당--99% 사멸 시 10 6 cfu/ml

: 온도, pH, mutagen 농도, exposure time, growth phase

* 변이율 : 변이의 빈도 - 사멸율과 직접 관련

- 적당한 사멸율 조건에서 처리하는 것이 중요

사멸율% = (처리 전 생세포 수 - 처리후 생세포 수)/ 처리전 생세포 수 × 100

생존율% = 처리후의 생세포 수 / 처리전 생세포 수 × 100

* 사멸곡선(death curve, dose response curve) = 생존곡선(survival curve)

: 변이제 처리량 또는 처리시간에 따른 미생물 사멸율(생존율) 관계

- UV: 사멸율 99% - 99.9%, MNNG: 사멸율 50%에서 변이 최대

처리량 또는 처리시간

생존율%

사멸율%



C. 변이주의 분리 및 선별

1) 직접선별법: 내성변이주(resistant mutant)--특정 조건에서 생육가능 변이주

-항생제 내성 변이주: 변이제 처리 후 항생제 첨가배지에서 분리

--내성이 없는 친주 세포 사멸

-Analog 내성 변이주: 대부분이 대사조절 변이주

2) 간접선별법: 특정 조건에서 생육이 불가능한 변이주

-친주만 생육하게 배양--증식하는 세포를 제거

-변이주 빈도 10-100배 농축(농축법)

-후에 복사법으로 변이주 생육 가능 및 불가능 조건에서 분별

가) 페니실린 농축법(penicillin screening) : 세균

-변이제 처리 후 친주만 자라게 배양—Pen처리나) 여과 농축법(filteration enrichment): 포자

-변이제 처리 후 친주만 자라게 배양 여과(균사만 제거)

약제첨가배지, 일반배지



2-2. 재조합

* 재조합(genetic recombination)—세포 내 유전자 재조합을 유도

: 새로운 형질을 가진 개체의 생성 --유리한 형질을 가진 세포가 목적

1. 교배(mating) : 세포와 세포 접촉에 의한 DNA의 이동

- 2n체 세포의 경우 : 배우자간의 교잡에 의한 재조합

- 다른 유전자도 동시에 이동--몇 세대에 걸쳐 선별--근연의 종에 한정

2. 접합(conjugation) : 세균의 경우

: F 플라스미드가 성선모를 통하여 일부의 유전자 이동—conjugation

***접합 : ..\접합.ppt

AAbb ----- Ab

diploid gamete mating ----- AaBb

aaBB ----- aB

../접합.ppt



3. 형질전환(transformation)

: 공여세포(donor)로부터 분리한 DNA를 직접 수용세포(recipient)에 이동

1) Competent cell : DNA 분자의 흡수능력이 있는 세포

--화학적처리: CaCl2 처리: E. coli, LiAc 처리: S. cerevisiae

2) 전기충격법(electroporation): 수만 볼트로 순간적 충격

4. 형질도입(transduction): 바이러스에 의한 유전자 이동 ***..\바이러스생활사.ppt

5. 세포융합(cell fusion)

: 세포벽을 제거한 원형질체(protoplast)의 융합(fusion)에 의한 DNA의 이동

--원래는 고등동식물에 처음 사용--미생물에도 이용 가능

1) 세포벽의 제거: 세포의 protoplast(원형질체) 화

* 세포벽 용해효소: Zymolyase, lysozyme, chitinase, cellulase

2) 원형질체 융합 : 두 개의 원형질체 혼합--융합촉진제 PEG 첨가

3) 융합체(fusant)의 재생(regeneration) : 재생용 최소배지

4) 융합체의 선별 및 분리

용균

용원화 유발

임의 부위염색체 DNA 함유

특정 부위염색체 DNA 함유

다른 수용세포에 감염:염색체 DNA도 동시 이동

파아지 감염

염색체 DNA

../바이러스생활사.ppt



2-3. 대사제어발효

1. 대사 조절

가. 대사조절 현상

1) 특정 기질이 증가

ㅇ 기질대사 효소들의 활성 증가: 효소 활성화, 활성촉진(enzyme activation)

ㅇ " 합성 증가: 효소의 유도(enzyme induction)

ㅇ 타 기질 대사효소의 합성 감소: 이화물 억제 (catabolite repression)

2) 특정 최종산물의 증가 : 최종산물조절--최종산물 저해, 최종산물 억제

ㅇ 최종산물 합성 효소들의 활성 감소: 최종산물 저해 (feedback inhibition)

ㅇ " 합성 감소: 최종산물 억제 (feedback repression)

* 단순조절(coordinate regulation)

: 단일경로에서 최종산물에 의해 효소의 합성 및 활성이 조절

-대부분의 경우 합성 조절의 경우 모든 효소의 합성을 조절,

활성 조절의 경우 key 효소의 활성만 조절

-위피드백 조절 (pseudo-feed back R.) : 최종산물 analogue에 의한 조절

A ── B ── C ── D ── E A ── B ── C ── D ── E



나. 대사조절기구

1) 효소활성의 조절 : allosteric 효소 - 효과물질에 의한 효소 자체의 구조변화

2) 효소합성의 조절--효과물질에 의한 조절단백의 구조변화--효소합성 조절

다. 분지 대사경로에 있어서 최종산물조절의 양상

1) 협조적 조절(concerted R.): 최종 산물들의 협조적 작용에 의해서만 조절

--E: 조절X, G: 조절 X, E+G: 조절 가능

2) 누적적 조절(cumulative R.): 각각의 최종산물이 일정비율로 조절

--E+G에 의한 조절 = E에 의한 조절 + G에 의한 조절

┌─ D ── E

A ── B ── C ─┤

└─ F ── G

┌─ D ── E

A ── B ── C ─┤

└─ F ── G



3) 공동적(협동적) 조절(cooperative R.)

: 각각이 약하게 조절, 공동적으로는 각각 합보다 강하게 조절

--E+G에 의한 조절 ＞ E에 의한 조절 + G에 의한 조절

4) Isozyme의 조절: 각각의 최종산물이 isozyme 하나씩만 조절

5) 연쇄적 조절(sequential R) : 최종 산물이 중간산물의 합성 조절

-그 전 단계 대사산물이 축적되어 조절에 관여

┌─ D ── EA ── B ── C ─┤

└─ F ── G

┌─ D ── EA ==== B ── C ─┤

└─ F ── G

┌─ D ── EA ── B ── C ─┤

└─ F ── G



2. 대사제어발효 : 대사 조절기구 파괴--필요한 대사산물을 축적

가. 1차 대사산물 : 생명유지 필수적 대사산물

--aa, nucleotide, vitamin, 지방산, 당류 – 대부분이 단일경로로 합성1) 최종산물 조절의 해제 ..\대사연관성.ppt

가) 영양 요구성 변이주의 이용: 중간산물 생산 시

--C를 생산: P의 세포 내 농도를 감소시켜야 함

--E3를 변이: C 축적, P 생산 불가 - 배지에 P를 저농도로 첨가해 주어야 생육

나) Analog(ue) 내성변이주의 이용 : 최종산물 생산 시

--유사물질: 대사산물과 화학구조 유사하나 대사는 안됨

* 배지에 최종산물 analog 다량 첨가 – 세포가 최종산물 생산 X - 생육 불가- 생육하는 세포 analog에 의한 조절 해제 (analog 내성 변이주)

- 최종산물에 의한 조절 해제로 최종산물의 생산량 증가

A ── B ── C ── ── P : P는 최종산물로서 E1의 effector, 세포내 일정농도 유지E1 E2 E3

A ── B ── C ── ── PE1 E2 E3 P analog

../대사연관성.ppt



다) 복귀돌연변이주의 이용

: 결손된 효소가 다시 합성(효소의 변화)되어 산물 생성--조절 안됨

라) 세포막 투과성의 개량

- 세포막의 인위적 손상, 세포막 이상 변이주

- 산물을 세포 외 분비--조절해제--배지에 축적

예) 글리세롤 요구주에 글리세롤 제한농도 첨가

마) 대사의 bypass : 조절을 받지 않는 기질 또는 전구물질 첨가하여 생산 유도

2) 이화물억제의 해제

가) 탄소원 이화물 억제(CCR-carbon catabolite repression)

: 포도당이 다른 탄소원 이용 방해 (유도효소의 합성 방해) : 포도당 효과

- 이화물 억제 저항성 변이주: 포도당 존재 하에서도 효소가 유도되는 변이주

- 배양조건 개선: 포도당(0.05% 이하) 조금씩 첨가—유가배양 또는 연속배양

나) 질소원 이화물 억제(NCR-Nitrogen catabolite repression)

: 황산암모늄, Asn. 등 – 다른 질소원 이용 방해

- 저항성변이주, 배양조건 개선 등

A ── B ── C ── ── PE1 E2 E3 기질을 A' 또는 B, C 사용--- P 축적

A'



나. 2차대사산물: 생명유지에 비필수적인 대사산물

예) 항생물질, 색소, 독소 등--대부분 분지경로

1) 효소의 유도

--영양증식기(trophophase)와 생산기(idiophase) 다름

: 증식 말기에 key enzyme 유도되어 생산 - 변이주

2) 최종산물 조절의 해제

가) 영양요구 변이주: C--x---D--배지에 미량의 E 첨가

: C가 전부 X로 전환되어 Z 증가

나) 전구물질 첨가: 배지에 X 첨가--영양증식기에도 생산 가능

3) 이화물 억제의 해제: 1차대사산물의 경우와 동일

4) 무기인산에 의한 조절의 해제

--최적 인산 농도 유지, 인산조절기구 해제 변이주

* 인산: 1차대사 촉진(0.3-300mM), phosphatase의 억제 및 저해

가) 너무 적으면: 균의 생육 불량--균체량 감소

나) 너무 많으면: 2차산물 중간산물 인산화된 상태가 주

--인산 이탈반응 감소로 2차산물 생산 감소

A ── B ── C ── D ── E : 1차대사--- 영양증시기│X ── Y ── Z : 2차대사--- 생산기



2-4. 유전자 조작 (gene manipulation)

* 유전자 조작=재조합 DNA(recombinant DNA technology)=(분자) 클로닝

: 타종간의 형질 이동 가능--insulin, 성장 호르몬, interferon etc

1. 유전자 조작에 사용되는 효소들

1) 제한효소(restriction enzyme, restriction endonuclease)

: 특정 염기서열을 인식하여 절단하는 endonuclease의 일종

예) EcoRI : GAATTC (접착말단 - cohesive end) - 같은 말단 DNA 연결 가능

예) SmaI : CCCGGG (평활말단 - blunt end) - 아무 평활말단 DNA와 연결 가능

2) Ligase : DNA 두 분자를 서로 연결하는 효소--주로 T4 DNA ligase 사용

3) DNA polymerase : Klenow fragment, T4 DNA polymerase – DNA 인위합성

GAATTCCTTAAG

AATTCG

GCTTAA

CCCGGGGGGCCC

GGGCCC

CCCGGG


2. 유전자 조작과정

1) 벡터의 절단

2) 외래 DNA 준비

3) 벡터와 외래 유전자의 연결

4) 수용세포 도입

5) 재조합유전자의 발현




3. 유전자 조작의 개요

가. 목적으로 하는 유전자의 추출, 정제 또는 화학합성

- 외래 DNA(foreign DNA= passenger DNA)

1) 목적 유전자 함유 DNA를 제한효소 절단 후 분리

2) DNA의 합성

가) cDNA : complimentary DNA (상보성 DNA)-mRNA로부터 만든 DNA

***..\DNA로부터 단백질 합성.ppt

../DNA로부터 단백질 합성.ppt



나) 화학합성 : 단백질의 아미노산 서열로부터 코돈에 따라 DNA 합성

* somatostatin : somatotropin release inhibiting hormone (SIH)

- somatotropin(growth hormone), insulin, gastrin 등 분비 저해 호르몬



다) PCR을 이용한 합성

: 염기서열을 기초로 합성한 프라이머로 특정 DNA 부분을 대량 증폭

반응혼합액 : 주형DNA, primer, dNTP, Taq DNA polymerase, buffer, Mg++ - denaturation(고온) – annealing (저온) – polymerization (72oC) 반복

***PCR : ..\zPCR.

주형 DNA

프라이머

../zPCR.flv



나. 운반체 DNA(vector, cloning vehicle)와 in vitro 연결 - 재조합 DNA

- 운반체 DNA : 주로 vector plasmid 사용

- 운반체 DNA의 특성: 복제기점, 선택 marker, 클로닝 부위 (절단하여 사용)

- 주로 플라스미드 DNA

pBR322

(4361bp)


KNU Microbial Biotechnology Laboratory 35

플라스미드

* 플라스미드 : small circular DNA elements

-대부분 세균 세포들이 함유, 일부 진핵미생물도 함유

-다른 세포로 비교적 쉽게 이동 가능

-염색체 DNA와 별개로 독자적 복제 가능

-고복제수(high copy number) 및 저복제수(low copy number) 플라스미드

-종류

1) 약제저항성 : Resistant plasmid

2) 물질의 분해 : Degradation plasmid

3) 성에 관여 : Fertility plasmid

4) 항균성물질 생산 : Col plasmid

세균세포

plasmid


플라스미드 DNA의 분리


SDS, NaOH 처리

고농도 염 중화

원심분리하여 상등액모아서 에탄올 침전


다. 수용세포 또는 숙주세포(host cell)내로 도입 --형질전환

- 화학적 방법 및 전기적 방법

라. 형질전환 세포 검출 및 개량 : 형질전환체의 검출

- 수많은 클론 중 목적 클론의 분리, 목적 유전자 분리 및 산물의 검정


M : DNA size marker1, 4 : 벡터 플라스미드2, 5 : DNA 단편3, 6 : 재조합 플라스미드


* Agarose gel 전기영동 – DNA 전기영동


◆ Agarose gel 전기영동 (electrophoresis)

: agarose gel 전기영동 - EtBr 염색 후 UV 하 관찰 – 크기에 따라 분리 확인

* agarose : 고온에서 용해, 저온에서 응고

전기영동장치


* Polyacrylamide gel 전기영동 – 단백질 전기영동



* 단백질의 대량생산 예


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