)1392 پاييز، 3، شماره 5دوره (مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

19

سنج گازي توأم با طيف يريزاستخراج فاز جامد در كروماتوگرافبا روش تركيبات عطري برنجشناسايي

نشانگر ريزماهواره بكارگيريبا آنها كنندههاي ژني كنترليابي جايگاهمكان و جرمي

3، عليرضا غياثوند2، محمود خدامباشي1∗∗∗∗فهليانيرضا اميري

دانشكده كشاورزي، دانشگاه ياسوج و دانشجوي دكتري سابق دانشگاه شهركردنباتات، استاديار گروه زراعت و اصالح 1 دانشكده كشاورزي، دانشگاه شهركرددانشيار گروه زراعت و اصالح نباتات، 2 ي، دانشكده علوم، دانشگاه لرستاناستاد گروه شيم 3

24/08/1391: ، تاريخ پذيرش10/09/1390: تاريخ دريافت

چكيده

به را گياهي نژادگرانتوجه به داشته وهاي عطري، قيمت باالتر آنها را درپي ي بيشتر براي برنجتقاضا

كننده كنترلهاي مهم پيوسته با ژنشديداً نشانگرهاي . است هكردجلب برنج كننده عطر كنترلهاي ژنشناسايي

نژاديهاي معمول بهاز روش ترادياقتصتر و را سودمندتر، مؤثرتر، واقعي فنوتيپي زراعي، عمل گزينشصفات

با آنها كنندهكنترلهاي يابي ژنمكان و شناسايي تركيبات فرّار در برنج به منظور اين تحقيق. دننمايمي گياهي

- 87در سال 2Fتك بوته 139، 304طارم و از تالقي رقم موسي. انجام شداستفاده از نشانگرهاي ريزماهواره

جداسازي و شناسايي تركيبات استخراج، . و براي كشت مورد استفاده قرار گرفتند يريبصورت مجزا بذرگ 1386

درريزاستخراج فاز جامد از روش حساس و كارآمد با استفاده F2:3 هاي خانوادههاي بذري فرّار نمونه

هگزادكان و دكان، هاي آلكاني تترادكان، پنتاتركيب. انجام شد سنج جرميگازي توأم با طيف يكروماتوگراف

كننده هاي كنترلحامل جايگاه 12و 11، 6، 4، 1هاي كروموزوم. از تركيبات عمده شناسايي شده بودندهپتادكان

جايگاه 12جايگاه شناسايي شده، 14از . بر داشت بيشترين جايگاه را در 4 كروموزوم .ندهاي فرّار بودتركيب

پذيري و هپتادكان كمترين توارث تركيب. ق غالبيت را نشان دادندحاالتي از غالبيت نسبي، غالبيت كامل و يا فو

در اين تحقيق چندين جايگاه كنترل كننده تركيبات در پايان، . نشان داد پذيريتوارث% 50تترادكان بيش از تركيب

؛ ينشگز، براي QTLمورگان با نشانگر؛ فاصله مطلوب پيشنهاد شده بين نشانگر و سانتي 5/4فاصله عطري با

.شناسايي شد

.SPME- GC- MS، روش ژن يابيمكان، QTL، يعطرتركيبات ،برنج :كليدي هايواژه

∗

Email: amiri720@yahoo.com 0741 -2214840: تلفن فهلياني رضا اميري: نويسنده مسئول

1392، فهلياني و همكاراناميري

20

مقدمه

بعد از عملكرد، كيفيت دانه دومين هدف مهم

در نظر گرفته ) .Oryza sativa L( نژادي برنجبه

هاي عطر نه تنها يكي از مهمترين ويژگي. شودمي

- ، بلكه برنجباشدميخوب براي تعيين كيفيت برنج

هاي عطري ارزش غذايي بهتر و اسيدهاي آمينه

آالنين، لوسين و متيونين بيشتري در ليزين، فنيل

,.Sun et al(مقايسه با انواع بدون عطر دارند

كه استطوالني مدتي ،هاي عطريبرنج). 2008

آنقيمت باالتر ، تقاضاي بيشترو پيدا كردهعموميت

-توجه به ،اين وضعيت .داشته استپي را در

- كنترل هايژن ساييشنا جهتنژادگران برنج را

Bounphanousay et( كننده عطر برانگيخته است

al., 2008(.

و گزينش با استفاده از ارزيابي واقعي عطر

، به نژادگرانبراي به هاي سنتي بهبود كيفيتروش

، هاي فنوتيپي مجزا در نتاجدليل نبود گروه

كننده بودن و خسته رارپذيري پايينحساسيت و تك

& Bullard(هاي آزمون كيفيت، مشكل است روش

Holguin, 1977 .( فنون متفاوتي براي ارزيابي و

و جويدن نيمه يك دانه منفرد: شناخت عطر شامل

ها، حرارت دادن بافت يا تعدادي دانه از تك بوته

برگي در آب و بررسي عطر حاصل از حل كردن

Garland et(هيدروكسيد پتاسيم ول برگ در محل

al., 2000; Wilkie et al., 2004(هاي ، واكنش

، روش )Nadaf et al., 2006(شيميايي -بافتي

هاي پخته ارزيابي بويايي عطر متصاعد شده از دانه

Jezussek et al., 2002; Wilkie et(يا خام برنج

al., 2004( از ، و ارزيابي تركيبات فرّار با استفاده

و يا كروماتوگرافي گازي 1كروماتوگرافي گازي

)GC- MS( 2سنج جرميجفت شده با طيف

)Mahatheeranont et al., 2001; Ghiasvand et

al., 2007(، اندمعرفي و استفاده شده .

هاي جويدن، حرارت دادن اگرچه روش

بافت برگي در آب و بررسي عطر حاصل از حل

- هيدروكسيد ، واكنشپتاسيم كردن برگ در محلول

مفيد بويايي شيميايي، و روش ارزيابي - هاي بافتي

توانند عاري از اشتباه باشند و باشند، ولي نميمي

اساس عطر تعيين بدون ابهام ژنوتيپ گياه را بر

بنابراين استفاده از ). Yanjun et al., 2001(كنند

روشي مناسب براي ارزيابي و ،GC- MSروش

باشد رّار و عطري ميسنجش تركيبات ف

)Ghiasvand et al., 2006 .(هاي از طرفي روش

قديمي استخراج و جداسازي عطر، طعم و بو مانند

گير، چند وقت) LLE(مايع –استخراج مايع

اي و گرانقيمت بوده و عالوه بر استفاده از مرحله

هاي سمي خطرناك و مضر براي محيط حالل

. كنندگر ايجاد ميزيست، خطراتي نيز براي آزمايش

-بهترين جايگزين اين شيوه هاي كالسيك، روش

ريز . هستند 4و عاري از حالل 3هاي كم حالل

، يك روش كارآمد، حساس و 5استخراج فاز جامد

1 Gas chromatography

2 Mass spectrometry

3 Solvent- Less

4 Solvent- Free

5 Solid phase micro- extraction (SPME)

)1392 پاييز، 3، شماره 5دوره (مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

21

ارزان عاري از حالل است كه با استفاده از كمترين

و باكمترين ) گرمدر حد چند ميلي(مقدار نمونه

ر بافت نمونه دستكاري فيزيكي و شيميايي د

استخراج ) افزودن كمي آب به چند دانه برنج سالم(

. دهدي تركيبات عطري را انجام ميگيرهو انداز

با ( GC- MSبا SPMEجفت شدن تكنيك جديد

، كارآيي )گيري بسيار باالحساسيت و دقت اندازه

گيري تركيبات اين روش را در جداسازي و اندازه

در سالهاي اخير، روش نموده و فرّار چندين برابر

SPME- GC- MS اي در كاربردهاي گسترده

گيري انواع تركيبات غذايي، استخراج و اندازه

Ghiasvand et(است ها پيدا كردهداروئي و آالينده

al., 2007.(

- در عطر برنج با مقادير كم تركيبات متعددي

هاي اين گياه و يا حتي در برگ هاي خام يا نپخته

دخالت دارنداياني رشد، در مراحل پ

)Bounphanousay et al., 2008; Srivong et al.,

- 1 - استيل -2 تركيبات فرّاري چون. )2008

ليمونين، پنتادكان، هگزادكان، ،)AP( 1پيرولين

هپتادكان، دودكان و هگزانول در برنج پخته شده

سفيد اثر. )Singh et al., 2000(اند گزارش شده

و مشخص شده ارزيابي آن عطر نيز بربرنج كردن

هاي سطح بيروني برنج نقش اليهكه شده است

& Bullard(كنند مهمي را در تشكيل عطر ايفا مي

Holguin, 1977.(

1Acetyl Pyrroline

كمي، مانند بسياري از صفاتتنوع ژنتيكي

مهم زراعي از قبيل عملكرد، كيفيت و خصوصيات

Collard et(هاي مقاومت به بيماري برخي از شكل

al., 2005(به وسيله تعداد زيادي ژن كنترل مي ، -

، كه هركدام QTLشوند كه از تفكيك تعداد زيادي

كنند و تظاهر آنها بخشي از تنوع كلي را توجيه مي

ها و محيط تغيير توسط اثرات متقابل با ديگر ژن

- منطقه). Mackay, 2001(شود كند، حاصل ميمي

يك صفت هاي مربوط به اي از ژنوم كه شامل ژن

- ژني كنترل باشد، به عنوان مكانكمي خاص مي

ايجاد . شودشناخته مي) QTL(صفت كمي كننده

براي QTLهاي پيوستگي و انجام تجزيه نقشه

يابي مرتبط با صفات، مكانشناسايي نواحي ژنومي

& McCouch(شود گفته مي QTL يابييا نقشه

Doerge, 1995; Paterson, 1996.( از افتناطالع ي

تواند در تشخيص آثار مي ،ها در كروموزوممكان ژن

مورد توجه خاص آنها كه پيوستگي و پليوتروپي

تعيين . ، كمك مؤثري داشته باشدباشدنژادگران ميبه

QTLسازد كه به بررسي ها اين امكان را فراهم مي

هاي ژني به صورت آثار افزايشي و غالبيت مكان

ها پرداخته و متقابل ژناثرات همچنين و ،منفرد

در بعضي احتماالً نوع عمل ژن و نوع اثر متقابل را

).Kearsey, 1998(از موارد شناسايي نمود

) صفات(كننده صفت هاي كنترلتعداد ژن

هدف و موقعيت ژنومي آنها، توزيع اثرات ژنتيكي و

پذيري صفت، وجود اثرات متقابل ژنتيكي، توارث

تفرق در جمعيت مورد هاي در حال تعداد ژن

1392، فهلياني و همكاراناميري

22

بررسي، نوع و اندازة جمعيت مورد بررسي، تراكم و

هاي پوشش نشانگرها در نقشه پيوستگي، روش

-داري مورد استفاده براي نقشهآماري و سطح معني

-مكان، ازجمله عوامل اثرگذار بر قدرت QTLيابي

,.Liu, 2002; Collard et al(باشند مي QTLيابي

2005.(

پيشرفت قابل ،DNAشانگرهاي با توسعه ن

اي در توصيف صفات كمي و گزينش مالحظه

QTL ها آغاز شد)Collard et al., 2005.(

هاي مهم نشانگرهاي مولكولي كه شديداً با ژن

زراعي پيوستگي دارند، ممكن است به عنوان

نژادي بهدر 1ابزاري براي گزينش به كمك نشانگر

;Kearsey & Pooni, 1996(استفاده شوند گياهان

Ribaut & Hoisington, 1998( به نحوي كه در ،

، فنوتيپي هاي معمول گزينشمقايسه با روش

تر باشند تر و اقتصاديسودمندتر، مؤثرتر، مطمئن

)Collard et al., 2005.(

- اي پلينشانگرهاي مبتني بر واكنش زنجيره

,.McCouch et al( 3هااز قبيل ريزماهواره 2مراز

و ها ژنيابي در مكان مؤثري، نقش مهم و )2002

ها يا ريزماهواره. كمك نشانگرها دارند بهگزينش

شديداً ) هاSSR( 4هاي ساده تكراريتوالي

بارز دهند و عالوه بر اين، همچندشكلي نشان مي

بودن و قابليت تكرار آنها، اين نشانگرها را براي

عات ترسيم نقشه ژنومي و به همين نحو براي مطال

1 Marker assisted selection

2 Polymerase chain reaction (PCR)

3 Microsatellite

4 Simple sequence repeats

McCouch(ژنتيكي جمعيت، مناسب ساخته است

et al., 1997; Dayanandan et al., 1998.(

با استفاده از مطالعه ژنتيك كيفيت برنج

هاي ژنوتيپي ، در مجموعهنشانگرهاي مولكولي

;Ahn et al., 1992( متفاوتي صورت گرفته است

Lorieux et al., 1996; Sun et al., 2008 .( يك

كننده عطر، بر روي اثر كنترلبزرگ ژن مغلوب

Ahn( آمريكايي به نام دّلاعطري برنج 8كروموزوم

et al., 1992(خي، رقم بنگالدشي به نام سرجارم

)Yano et al., 1992 (رقم فيليپيني به نام آزوسنا و

)Lorieux et al., 1996 (با استفاده از تكنولوژي

يابي كانم، )RAPD( رپيد و )RFLP( پيالافآر

دو ژن مغلوب كنترل كنندة عطر در رقم . شده است

گزارش 9و 5هاي ، بر روي كروموزوم3تي هندي

عطر، براي صفت. )Yanjun et al., 2001(اند شده

8نزديك ناحيه سانترومري كروموزوم fgrژن

;Ahn et al., 1992( شده استيابي مكان

Bradbury et al., 2005; Lang & Buu, 2008 (

,.Lorieux et al( كندرا تعيين مي APكه سطح

سانتي مورگان، با نشانگر 5/4و با فاصله ) 1996

-كامالً پيوستگي نشان مي 28RGبه نام پي الافآر

يكي از مهمترين تركيبات عطري برنج AP .دهد

QTLهمچنين دو . )Grimm et al., 2001(باشد مي

ري بر و ديگ 4يكي بر كروموزوم ،براي عطر

,.Garland et al( استگزارش شده 12كروموزوم

در ناحيه كدكننده را داريچند شكلي معني). 2000

)fgr( هاي عطري برنج نسبت به انواع بدون ژنوتيپ

)1392 پاييز، 3، شماره 5دوره (مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

23

گزارش badh2با وضعيت مشابهي براي ژن و عطر

كد ( badh2ژن . )Bradbury et al., 2005( اندكرده

كننده عطر،كنترل ،)2ژنازكننده بتائين آلدهايد هيدرو

برنج قرار دارد 8بر روي بازوي بلند كروموزوم

)Srivong et al., 2008; Kovach et al., 2009( .

هاي عطري در نتاج در اين ژن براي غربال ژنوتيپ

Bradbury( استبوده قابل استفادهحال تفرق برنج

et al., 2005; Srivong et al., 2008; Lang &

Buu, 2008; Kovach et al., 2009.(

تركيبات شناساييهدف از اجراي اين تحقيق

استخراج ريزروش جديد با استفاده از فرّار و عطري

كروماتوگرافي گازي با استفاده از دستگاهفاز جامد

-يابي ژنمكانو در برنج سنج جرميتوأم با طيف

تركيبات شناسايي كنترل كننده ) هايQTL( هاي

.اده از نشانگرهاي ريزماهواره بودبا استفشده

هامواد و روش

- حاصل از تالقي رقم موسي 2F هايتك بوته

به صورت مجزا 1386در سال 304طارم و

به همراه 2:3F هايبذرگيري و براي كشت فاميل

. مورد استفاده قرار گرفتند 1387والدين در سال

- در شرايط گلخانه 1387تهيه خزانه در ارديبهشت

ي و در ظروف پالستيكي در دانشگاه شهركرد ا

انتقال نشاءها برگي، 5در مرحله صورت گرفت و

به زمين اصلي واقع در دشت خانميرزا در فاصله

در مرحله .صورت گرفت كيلومتري لردگان 35

هاي موجود براي هر كرت از تمامي بوته ،زنيپنجه

هاي برگي گرفته شده نمونه) خانوادههر (آزمايشي

تغيير يافته با استفاده از روش DNAو استخراج

CTAB انجام شد )Amiri-Fahliani et al.,

استخراج شده با DNAكميت و كيفيت . )2011

و درصد8/0استفاده از الكتروفورز ژل آگارز

صورت )اپندورف، آلمان( دستگاه اسپكتروفتومتر

-هشتاد و يك جفت آغازگر بر اساس نقشه. گرفت

ائه شده در آدرس اينترنتيار SSRهاي

)www.gramene.org/microsat/RM_primers( و

چهار جفت آغازگر بر اساس گزارشات ارائه شده

-Amiri( براي تركيبات عطري انتخاب گرديدند

Fahlaini, 2010( . فاصله آغازگرهاي انتخاب شده

مورگان سانتي 20تا 15بر روي هر كروموزوم بين

مراز در اي پلييرهواكنش زنج. متغير بود

ميلي ليتري و با حجم واكنش 2/0هاي ميكروتيوب

.)Amiri et al., 2011( ميكروليتر انجام گرفت 20

با SPMEاز فيبرهاي فلزي سوپراالستيك

و يك PDMS/CAR/DVBپوشش سه تايي

Supelcoساخت شركت (دارنده دستي فيبر هنگ

اي سيالنه شده هاي شيشهو ظرف) آمريكا

هاي آلومينيومي و سپتوم با درب SPMEص مخصو

سيليكون، براي استخراج تركيبات -مركب تفلون

دستگاه . هاي برنج استفاده گرديد عطري از نمونه

-بيبا ستون دي 1آ17كروماتوگرافي شيمادزو مدل

)پلي داي متيل سيلوكسان% 5فنيل، و % 95( 52

-MSمجهز به آشكارساز جرمي شيمادزو

QP5050 ، جداسازي و شناسايي تركيبات جهت

1 Shimadzu 17A

2 DB-5

1392، فهلياني و همكاراناميري

24

هاي بذري برنج مورد استفاده قرار فرّار نمونه

تركيبات استخراج، جداسازي و شناسايي . گرفت

غياثوند و ارائه شده توسط با استفاده از روشار فرّ

در SPME- GC- MSو به روش )2007(همكاران

ها پس از آماده نمونه. انجام شددانشگاه لرستان

oدقيقه در دماي 15ت مدبه سازي C50 تحت ،

سپس فيبر . شدندامواج مافوق صوت قرار داده

دقيقه جهت جذب 30به مدت ،تجاري مورد نظر

عمل واجذب . در فضاي فوقاني ظرف قرار داده شد

oدقيقه در محل تزريق با دماي 2به مدت C260

شروع شده C40°برنامه دمايي ستون از . انجام شد

oو با سرعت C4 ر دقيقه به ب°C200 پس از . رسيد

oآن با سرعت C35 بر دقيقه بهo

C270 رسيد و در

دماي . داشته شددقيقه نگه 3اين دما به مدت

o ،آشكارساز در طول جداسازيC260 بود .

شناسايي تركيبات با استفاده از مقايسه دو پارامتر

و شاخص ) هاحاصل از كروماتوگرام(زمان بازداري

حاسبه شده از تزريق تركيبات آلكان م(بازداري

با مقادير ) نرمال همولوگ به ستون در شرايط نمونه

استاندارد موجود در متون علمي و همچنين بررسي

هاي جرمي هاي جرمي و مقايسه آنها با طيفطيف

افزاري استاندارد ذخيره شده در كتابخانه نرم

229Willey سيستمGC- MS صورت گرفت.

1كارتوگرافر استفاده از نرم افزار با QTLجزيه ت

)Wang et al., 2007 (بررسي . انجام شدQTL ها با

با 2اي مركبيابي فاصلهاستفاده از روش نقشه

1 Windows QTL Cartographer V 2.5

2 Composite interval mapping (CIM)

مورگان و اندازه پنجره سانتي 5/0سرعت پيمايش

3نشانگر به عنوان كنترل 5مورگان و تعداد سانتي 10

داري آستانه معني. صورت گرفت) عاملهم(

)LOD ( مورد استفاده براي انتخابQTL ها براي

. در نظر گرفته شد 3مقدار ،تمامي صفات

نتايج و بحث

هاي شناسايي شده با تركيب مقايسهبا

مشخص ،افزار مورد استفادهاطالعات كتابخانه نرم

دكان، هاي آلكاني تترادكان، پنتاشد كه تركيب

يايي هاي شيمهگزادكان و هپتادكان جزئي از تركيب

ها توسط ديگر اين تركيب. هستندموجود در برنج

,.Widjaja et al( محققين نيز گزارش شده است

1996; Singh et al., 2000( . نتايج حاصل از

در ي شيمياييهامربوط به تركيب QTLتجزيه

نشان دادند كه نتايج . گزارش شده است 1جدول

حامل جايگاه 12و 11، 6، 4، 1هاي كروموزوم

و شناسايي شده بودههاي فرّار كنترل كننده تركيب

- بيشترين جايگاه كنترل كننده تركيب 4 كروموزوم

وجود ديگر محققين. داشت بر در مذبور راهاي

يا آغازگرهاي مرتبط با ) fgr(يك ژن كنترل كننده

;Ahn et al., 1992( 8آن بر كروموزوم شماره

Lorieux et al., 1996; Cordeiro et al., 2002 ( و

4براي عطر، يكي بر كروموزوم QTLهمچنين دو

,.Garland et al(را 12و ديگري بر كروموزوم

هاي اگرچه بيشترين جايگاه. اندگزارش داده) 2000

3 Cofactor

)1392 پاييز، 3، شماره 5دوره (مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

25

هاي مورد بررسي بر روي كنترل كننده تركيب

پوشاني جايگاه بود، ولي هيچگونه هم 4 كروموزوم

هاي ها براي تركيببا در نظر گرفتن موقعيت آن

اطالعات ). 1جدول (شناسايي شده، مشاهده نشد

حاصله نشان دهنده اين مطلب است كه بخشي از

برنج 4هاي كنترل كننده عطر بر روي كروموزوم ژن

قرار داشته و از طرفي تركيبات عطري، از چند اثري

.انديك مكان ژني منشاء نشده

نده كنهاي كنترلنكته قابل توجه جايگاه

ها با توجه به نسبت ها، نحوه عمل جايگاهتركيب

12جايگاه شناسايي شده، 14از . غالبيت آنها بود

جايگاه داراي حاالتي از غالبيت نسبي، غالبيت

بنابراين با توجه به . كامل و يا فوق غالبيت بودند

- كننده تركيبهاي ژني كنترلعمل غالبيت جايگاه

-ها توارثن تركيبهاي عطري شناسايي شده، اي

علت عدم . پذير بوده ولي امكان تثبيت را ندارند

هايي به ماهيت خودگشن بودن تثبت چنين تركيب

يكي از داليل مشاهده اثرات . گرددگياه برنج برمي

هاي ژن 1فوق غالبيت ژني صفات كمي، پراكندگي

مورد بررسي در والدين هايويژگيكننده كنترل

- بر اساس اين نتايج مي. اشدبمربوط به تالقي مي

توان اميدوار بود كه با انتخاب درست والدين در

گيري، نتاج هيبريدي را ايجاد و معرفي كرد دورگ

كه داراي عطر بيشتري بوده و براي بروز عطر، هم

ها از اثرات افزايشي و هم از اثرات غالبيت ژن

اين اميدواري بخصوص با توجه به . استفاده كرد

1 Dispersion

ن استفاده از برنج هيبريد در بسياري از تجاري شد

.كشورها از بيشتر از پيش خواهد بود

و تكيه بر سهم 1با مراجعه به جدول

كننده، هاي كنترلواريانس توجيه شده توسط جايگاه

مشاهده شد كه تركيب هپتادكان داراي كمترين

مجموع سهم (پذيري شناسايي شده ميزان توارث

. بود) ترل كننده هپتادكانهاي كنواريانس جايگاه

. پذيري داشتتوارث% 50تركيب تترادكان بيشتر از

- هاي داراي اثرات افزايشي، نشان از توارثجايگاه

.ها را داردپذيري و قابليت تثبيت آن جايگاه

ترين تركيبي كه براي عطر برنج يكي از مهم

معرفي و مورد بررسي قرار گرفته است، تركيب

AP2 باشد مي)Grimm et al., 2001( كه در اين ،

و 4هاي كروموزوم. تحقيق مورد شناسايي واقع نشد

را بر QTLهاي كه در اين تحقيق برخي جايگاه 12

هاي خود جاي دادند، قبالً نيز به عنوان كروموزوم

هاي عطري و بدون معرفي حامل ژنهاي تركيب

Garland et(اند تركيب عطري خاص گزارش شده

al., 2000( .هاي شناسايي شده بر اساس جايگاه

گذاري و در نام) 1997(كوچ و همكاران روش مك

.ارائه شده است 2جدول

و يافتن QTLتجزيه : توان گفتدر پايان مي

هاي مورد بررسي نه هاي كنترل كنندة ويژگيجايگاه

هاي ويژگيكمي بلكه براي هاي ويژگيتنها براي

يابند نيز شد گياه تظاهر ميكيفي كه در مراحل پاياني ر

- هايي ميبا يافتن چنين جايگاه. باشدكامالَ مفيد مي

توان بدون نياز به انتظار كشيدن در بروز صفات مذبور

1392، فهلياني و همكاراناميري

26

در انتهاي دوره رشد، عمل گزينش را در مراحل

از طرفي تركيبات عطري كه . ابتدايي رشد انجام داد

هاي جهت شناسايي دقيق آنها الزم است از دستگاه

اي استفاده شود و بنابراين هزينه ارزيابي آنها زياد ويژه

. قرار گيرند QTLتوانند مورد تجزيه باشد نيز ميمي

در چنين وضعيتي و در صورت پيدا كردن

- مي QTLنشانگرهايي مرتبط با اين تركيبات، تجزيه

- هاي بههاي بعدي در برنامهتواند در كاهش هزينه

.اقع شودنژادي بسيار مؤثر و

هاي در حال تفرق با گزينش صفات در نسل

- كمك نشانگرهاي مولكولي در دستيابي هرچه سريع

نژادي، و احتماالً تسريع در تر به اهداف بهتر و دقيق

هاي مطلوب، هاي نامطلوب پيوسته با ژنحذف ژن

SSRدر اين آزمايش از نشانگر .شودميمؤثر واقع

اختصاصي بودن اين نشانگر استفاده شد كه با توجه به

و گستردگي يكنواخت آنها در طول كروموزوم از

. قابليت تكرار پذيري بسيار بااليي برخوردار است

براي QTLفاصله مطلوب بين نشانگر و

انتخاب به كمك نشانگر نيز بر اساس گزارشات

مورگان سانتي 5/4هاي كمتر از متفاوت، فاصله

آزمايش چندين جايگاه پيشنهاد شده است كه در اين

.اي با نشانگر، شناسايي شده استبا چنين فاصله

سپاسگزاري

نويسندگان مقاله از دانشگاه شهركرد بخاطر

تأمين بخشي از اعتبار الزم جهت اجراي اين تحقيق

نويسنده اول . دارندنهايت سپاسگزاري را تقديم مي

همچنين از خانم دكتر مريم حسيني عضو هيأت

ركز تحقيقات برنج كشور، آقاي محمد برزويي علمي م

كارشناس ارشد شيمي تجزيه دانشگاه لرستان، آقايان

آموخته و مهندس سيد صادق دكتر علي آرمينيان دانش

فرد دانشجوي دكتري دانشگاه شهركرد، بخاطر موسوي

.نمايددريغشان صميمانه قدرداني ميهاي بيهمياري

)1392 پاييز، 3، شماره 5دوره (مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

27

.اي مركبيابي فاصلههاي فرّار و معطر با استفاده از روش نقشهتركيب QTLزيه نتايج حاصل از تج - 1جدول Table 1- QTL results for volatile compounds using composite interval mapping method.

نام تركيبCompound

كروموزوم

دربرگيرندهCarrier

chromosome

آغازگر

نزديك

QTLبه Adjacent

primer to

QTL

موقعيت

آغازگرPrimer

position

QTLموقعيت

†بر كروموزومQTL position

on

chromosome

اثر افزايشيQTL QTL

additive

effect

اثر غالبيتQTL QTL

dominance

effect

نسبت

غالبيتDominanc

e ratio

††عمل

QTL QTL

Action

سهم

اريانسو

QTL (%) QTL

proporti

on (%)

مقدار LO

D LO

D

valu

e

تترادكانTetradecane

1 RM11347 99.5 101.61 0.1434 0.4121 2.87 OD 0.45 4.0 4 RM16355 7.4 9.01 -1.4194 0.3994 0.28 PD 18.20 4.5 12 RM27511 9.2 4.51 -1.4171 0.4738 0.33 PD 17.82 3.8 12 RM28097 62.9 61.81 -1.4171 0.4735 0.33 PD 17.82 11.8

كانپنتاد

Pentadecane

4 RM16355 7.4 10.01 -2.6732 0.7588 0.28 PD 17.78 8.8 6 RM19359 8.7 11.51 -0.6735 -0.3065 0.46 PD 2.24 7.5 11 RM26063 8.7 5.01 3.1375 -0.7844 0.25 PD 20.36 10.1

هگزادكان

Hexadecane

1 RM11109 82.1 78.71 -0.8452 -0.0338 0.04 A 5.89 4.9 4 RM16937 72.7 68.21 -1.5573 0.6865 0.44 PD 10.62 4.1 12 RM27782 26.7 34.01 -1.5556 0.6874 0.44 PD 10.60 4.2 12 RM28097 62.9 66.31 -1.8901 0.6686 0.35 PD 12.72 3.2

هپتادكان

Heptadecane

1 RM11347 99.5 99.11 -0.1992 0.5100 2.56 OD 0.43 4.7 4 RM16589 40.6 39.71 0.2918 0.0348 0.12 A 0.87 8.3 6 RM8270 26.5 26.31 -0.3248 -0.1131 0.35 PD 0.99 9.8

فوق غالبيت 1.2تر از ، و بيش)D(غالبيت كامل 1.2تا 0.81، )PD(غالبيت ناقص 0.8تا 0.21، )A(افزايشي 0.2نسبت كمتر از †† مورگان از ابتداي بازوي كوتاه كروموزم، وموقعيت بر حسب سانتي †

)OD.(

1392، فهلياني و همكاراناميري

28

.هاي شيمياييهاي شناسايي شده مربوط به تركيبنام پيشنهادي براي جايگاه - 2جدول Table 2- Proposed name for identified QTLs corresponding to chemical compounds.

نام تركيب

compound

دربرگيرنده كروموزوم

Carrier chromosome

بر كروموزوم QTLموقعيت

QTL position on chromosome

QTLنام پيشنهادي

QTL proposed name

تترادكان

Tetradecane

1 101.61 qTTRDC-1 4 9.01 qTTRDC-4 12 4.51 qTTRDC-12-1 12 61.81 qTTRDC-12-2

پنتادكان

Pentadecane

4 10.01 qPNTDC-4 6 11.51 qPNTDC-6 11 5.01 qPNTDC-11

هگزادكان

Hexadecane

1 78.71 qHXDC-1 4 68.21 qHXDC-4 12 34.01 qHXDC-12-1 12 66.31 qHXDC-12-2

هپتادكان

Heptadecane

1 99.11 qHPTDC-1 4 39.71 qHPTDC-4 6 26.31 qHPTDC-6

)1392 پاييز، 3، شماره 5دوره (مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

29

منابعAhn SN, Bollich CN, Tanksley SD (1992). RFLP tagging of a gene for aroma in rice. Theoretical

and Applied Genetics 84: 825-828.

Amiri- Fahliani R (2010). Study of some agronomic traits and aromatic compounds in rice

(Oryza sativa L.) and mapping their controlling genes using microsatellite markers. Ph.D.

Thesis. Shar-e-Kord University, Shahr-e-Kord, Iran.

Amiri- Fahliani R, khodambashi M, Houshmand S, Arzani A, Sorkheh K (2011). Heritability for

some agronomic characters of rice (Oryza sativa L.) and their linked microsatellites

identification. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 35: 481-490.

Bounphanousay C, Jaisil P, Sanitchon J, Fitzgerald M, Sackville Hamilton NR (2008). Chemical

and molecular characterization of fragrance in black glutinous rice from Lao PDR. Asian

Journal of Plant Science 7: 1-7.

Bradbury LMT, Fitzgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE (2005). The gene for fragrance in

rice. Plant Biotechnology Journal 3: 363-370. Bullard RW, Holguin G (1977). Volatile components of unprocessed rice (Oryza sativa). Journal

of Agriculture and Food Chemistry 25: 99.

Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers,

quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement:

The basic concepts. Euphytica 142: 169-196. Cordeiro GM, Mandy JC, Robert JH, Russell FR (2002). Identification of microsatellite markers

for fragrance in rice by analysis of the rice genome sequence. Molecular Breeding 9:245-

250.

Dayanandan S, Rajora OP, Bawa KS (1998). Isolation and characterization of microsatellites in

trembling aspen (Populus tremuloides). Theoretical and Applied Genetics 96: 950-956. Garland S, Lewin L, Blakeney A, Reinke R, Henry R (2000). PCR-based molecular markers for

the fragrance gene in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 101: 364-

371. Ghiasvand AR, Hosseinzadeh S, Pawliszyn J (2006). New cold-fiber headspace solid-phase

microextraction device for quantitative extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in

sediment. Journal of Chromatography A 1124: 35–42.

Ghiasvand AR, Setkova L, Pawliszyn J (2007). Determination of flavour profile in Iranian

fragrant rice samples using cold-fiber SPME–GC–TOF–MS. Flavour and Fragrance Journal

22: 377-391.

Grimm CC, Bergman C, Delgado JT, Bryant R (2001). Screening for 2-acetyl-1-pyrroline in the

headspace of rice using SPME/GC–MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49:

245-249.

Jezussek MB, Juliano O, Schieberle P (2002). Comparison of Key Aroma Compounds in

Cooked Brown Rice Varieties Based on Aroma Extract Dilution Analyses. Journal of

Agricultural and Food Chemistry 50:1101-1105.

Kearsey MJ (1998). The principles of QTL analysis (a minimal mathematics approach). Journal

of Experimental botany 327:1619-1623.

Kearsey MJ, Pooni HS (1996). The Genetical Analysis of Quantitative Traits. 1st ed, Chapman &

Hall, Great Britain at the Alden Press, UK.

Kovach MJ, Calingacion MN, Fitzgerald MA, McCouch SR (2009). The origin and evaluation of

fragrance in rice (Oryza sativa L.). PNAS 106: 14444-14449.

1392، فهلياني و همكاراناميري

30

Liu BH (2002). Statistical Genomics: Linkage, Mapping and QTL Analysis. 2nd

ed. CRC Press,

Boca Raton, Florida. Lorieux M, Petrov M, Huang N, Guiderdoni E, Ghesquiere A (1996). Aroma in rice: genetic

analysis of a quantitative trait. Theoretical and Applied Genetics 93: 1145-1151.

Mackay TFC (2001). The genetic architecture of quantitative traits. Annual Review of Genetics

35: 303-39.

Mahatheeranont S, Keawsa-ard S, Dumri K (2001). Quantification of the Rice Aroma

Compound, 2-Acetyl-1-pyrroline, in Uncooked Khao Dawk Mali 105 Brown Rice. Journal

of Agricultural and Food Chemistry 49: 773-779.

McCouch SR, Doerge RW (1995). QTL mapping in rice. Trends in Genetics 11: 482-487.

McCouch SR, Chen X, Panaud O, Temnykh S, Xu Y, Cho YG, Huang N, Ishii T, Blair M

(1997). Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and

breeding. Plant Molecular Biology 35:89-99.

McCouch SR, Teytelman L, Xu Y, Lobos KB, Clare K, Walton M, Fu B, Maghirang R, Li Zh,

Xing Y, Zhang Q, Kono I, Yano M, Fjellstrom R, DeClerck G, Schneider D, Cartinhour S,

Ware D, Stein L (2002). Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice

(Oryza sativa L.). DNA Research 9: 199-207.

Nadaf AB, Krishnan S, Wakte KV (2006). Histochemical and biochemical analysis of major

aroma compound (2-acetyl-1-pyrroline) in basmati and other scented rice (Oryza sativa L.).

Current Science 91: 1533-1536.

Paterson AH (1996). Making genetic maps. In: Paterson AH (Ed.), Genome Mapping in Plants,

RG Landes Company, San Diego, California; Academic Press, Texas. pp. 23-39.

Ribaut JM, Hoisington D (1998). Marker-assisted selection: New tools and strategies. Trends in

Plant Science 3:236–239. Singh RK, Singh US, Khush GS (2000). Aromatic rice. Oxford and IBH publishing Co. PVT.

Ltd., New Delhi.

Srivong P, Wangsomnuk P, Pongdontri P (2008). Characterization of fragrant gene and

enzymatic activity of betaine aldehyde dehydrogease in aromatic and nonaromatic Thai rice

cultivars. KKU Science Journal 36: 290-301.

Sun SX, Gao FY, Lu XJ, Wu XJ, Wang XD, Ren GJ, Luo H (2008). Genetic analysis and gene

fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L. Cyperales, Poaceae). Genetics and

Molecular Biology 31: 532-538.

Lang NT, Buu BC (2008). Development of PCR-based markers for aroma (fgr) gene in rice

(Oryza sativa L.). Omonrice 16: 16-23. Wang S, Basten CJ, Gaffney P, Zeng ZB (2007). Windows QTL Cartographer. Department of

statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC. Widjaja RI, Craske JD, Wootton M (1996). Comparative studies on volatile components of non-

fragrant and fragrant rices. Journal of the Science of Food and Agriculture 70: 151-161.

Wilkie K, Wootton M, Paton JE (2004). Sensory testing of Australian fragrant, imported fragrant

and non-fragrant rice aroma. International Journal of Food Properties 7: 27-36.

Yanjun D, Tsuzuki E, Terao H (2001). Trisomic genetic analysis of aroma in three Japanese

native rice varieties (Oryza sativa L.). Euphytica 117: 191-196. Yano M, Shimosaka E, Saito A, Nakagahra M (1992). Linkage analysis of a gene for scent in

indica rice variety, Surjamkhi, using restriction fragment length polymorphism markers.

Japanese Journal of Breeding 41: 338-339.

)1392 پاييز، 3، شماره 5دوره (مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

31

Identification of Rice Aromatic Compounds by Solid Phase Micro-Extraction method in

GC-MS and Mapping their Controlling QTLs using Microsatellite Marker

Amiri-Fahliani R.∗∗∗∗1

, Khodambashi M.2, Ghiasvand A.R.

3

1 Assistant Prof. of Agronomy & Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Yasouj University,

and former PhD Student of ShahreKord University 2

Associate Prof. of Agronomy & Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, ShahreKord

University 3 Professor of Chemistry Department, Faculty of Science, Lorestan University

Abstract Increasing demand for aromatic rice causes their higher price and attracted plant breeder's

attention to recognize rice aroma-controlling genes. Highly linked markers with the genes

controlling important agronomic traits help to make phenotypic selection, more efficient,

effective, reliable and cost-effective compare to the more conventional plant breeding methods.

The aim of conducting this research was identification of volatile compounds in rice and mapping

their controlling QTLs using SSR markers. The harvested seed of 139 single F2 plants of cross

between Mousa-Tarom and 304 were grown in 2010. Volatile compounds extraction, separation

and identification of seed samples; harvested from each F2:3 families; was conducted using the

sensitive and efficient method of solid phase micro-extraction in gas chromatography coupled to

a mass spectrometry apparatus. Alkane compounds of tetradecane, pentadecane, hexadeane and

heptadecane were the general identified compounds. The identified QTLs controlling volatile

compounds were located on chromosomes 1, 4, 6, 11, and 12. The chromosome number 4

included most of the volatile controlling loci. Out of 14 identified loci, 12 showed different

situations of partial, complete or over dominance effects. Heptadecane compound showed the

lowest heritability and tetradecane showed more than 50% heritability. Ultimately, in this study,

several QTLs having less than 5.4 centiMorgan distances to the marker; the optimal

recommended distance between the marker and QTL for selection; were identified.

Keywords: Rice, Aromatic compounds, QTL, Gene mapping, SPME- GC- MS method.

∗

Corresponding Author: Amiri-Fahliani R. Tel: 0741-2224840 Email: amiri720@yahoo.com

1392، فهلياني و همكاراناميري

32