11. Analisis Microbiologico de Alimentos

7/24/2019 11. Analisis Microbiologico de Alimentos

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ANDALUCIA POLIVALENTES CETECALAuxiliar de Laboratorio de Industrias Alimentarias

CONTROLES ANALITICOS DE ALIMENTOS Y SUPERICIES

PARAMETRO VALOR O!TENIDO VALOR REENCIA

Re"uento de "oloniasaerobias mes#$ilas % x %&xu$"'(r

Enteroba"terias % x %&xu$"'(r

Coli$ormes totales % x %&xu$"'(r

Es")eri")ia "oli % x %& u$"'(r

Sta*)+lo"o""us aureus % , %& u$"'(r

Salmonella - S)i(ella Ausen"ia' ./(r

Mo)os + Le0aduras % x %&xu$"'(r

!a"illus "ereus % x %& u$"'(r

Listeria mono"+to(enes % , %& u$"'(r

AN1LISIS DE SUPERICIE

PARAMETRO VALOR O!TENIDO VALOR REENCIA

Control desin$e""i#n2aerobios mes#$ilos3 &-%& u$"' "m.

Control enteroba"terias &-% u$"' "m.

!I!LIO4RA5A

- Enviromental sampling for the detection of microorganisms. Laboratory procedure MFLP-41A. ealth Protection !ranch. "tta#a. $anad%. &ep. 1''(.

-M) del *osario Pascual Anderson+ ,icente $aldern Pascual. Microbiolog/a Anal/tica paraalimentos y bebidas0. Ediciones /a2 de &antos. () Edicin+ (333.

- Manual !%sico de microbiolog/a $ultimed. Panreac u/mica &.A. () Edicin+ 1''5.

%


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RECO4IDA DE MUESTRAS EN ESTA!LECIMIENTOS ALIMENTARIOS

% O!6ETIVOS

El ob6etivo de este protocolo es proporcionar+ a las personas 7ue vayan a reali2ar la recogida

de muestras en establecimientos alimentarios+ las directrices 7ue deben seguir para 7ue estase realice en las condiciones higi8nico-sanitarias adecuadas y sean representativas del estadohigi8nico del establecimiento y de las condiciones de produccin.

. MATERIAL NECESARIO

.7%7- Material est8ril

- !olsas de pl%stico con cierre herm8tico- Envase est8ril 133 ml- Envase est8ril 1933 ml para toma de muestras de agua- Placas de contacto con el medio de cultivo: Agar biliado ro6o violeta glucosa ;,iolet

*ed !ile


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El vestuario se compondr% b%sicamente de:

- !ata blanca- o comer ni beber en la 2ona de traba6o- >o sonarse la nari2+ toser o estornudar+ cerca de los alimentos- >o fumar en las %reas alimentarias- >o llevar 6oyas+ ni perfumes fuertes- >o podr%n recoger las muestras a7uellas personas 7ue pade2can alguna enfermedad

infecciosa ;respiratoria+ d8rmica+ gastrointestinal+ etc= o sean portadoresasintom%ticos.

97. Toma de muestras de su*er$i"ie

undamento;

El m8todo de toma de muestras de superficies empleado es el "onta"to de la superficieelegida con un medio de cultivo espec/fico 7ue permita el crecimiento de los microorganismosdeseados y comprobar as/+ el estado higienico-sanitario del establecimiento visitado y verificarel correcto empleo de las t8cnicas de limpie2a y desinfeccin. Bambi8n se podr% utili2artorundaspara esta recogida de muestras cultivando luego la muestra recogida por la torundahumedecida en los medios de cultivo descritos.

Para la toma de muestras de superficies+ se utili2ar%n placas de contacto con medio de cultivoP$A ;Plate $ount Agar= ,*!< ;,iolet *ed !ile


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&uperficies de muestreo:

- suelos+ paredes y techos de las %reas de produccin ;salas de elaboracin+ c%maras+almacenes+ muelles+ etc=

- Ctensilios de traba6o: cuchillos+ tablas de corte+ espumaderas+ etc- Ma7uinaria 7ue interviene en el proceso productivo: picadoras+ envasadoras+ etc

-E7uipos de limpie2a-desinfeccin: lavamanos+ lavava6illas+ desinfectadores+ etc

- $ual7uier superficie con humedad+ temperatura y nutrientes 7ue permita elcrecimiento de microorganismos.

Nota: Es importante cuando se tomen muestras de superficiesrugosas+ apretar bien la placa sobre la superficie y aumentar el tiempo en contacto con 8sta.

979 Pro"edimiento de toma de muestras de alimentos

Para la toma de muestras del alimento+ una ve2 seleccionado este+ con guantes y mascarilla+coger el utensilio est8ril adecuado+ tomar as8pticamente una muestra representativa del totaldel alimento e introducirla en el envase o bolsa de pl%stico est8ril. *otular con el nombre del

alimento y n lote ;en su ausencia fecha de elaboracin+ recepcin+ sacrificio+ despiece+ etc=.

97< Cum*limenta"i#n de la )o=a de toma de muestras

Cna ve2 finali2ada la toma de muestras+ y fuera del %rea de produccin+ se proceder% a lacumplimentacin y firma por ambas partes ;laboratorio y empresa= de dos ho6as de toma demuestras+ 7uedando una ho6a en poder de la empresa y la otra se llevar% al laboratorio.

97/ Trans*orte de muestras al laboratorio

El transporte de las muestras al laboratorio+ se reali2ar% siempre en el interior de la neveraport%til+ para 7ue se mantengan refrigeradas+ y se llevar% lo m%s r%pido posible de vuelta al

laboratorio.


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RECEPCI>N DE MUESTRAS EN EL LA!ORATORIO

% O!6ETIVO

El ob6etivo 7ue se persigue con este protocolo+ es 7ue cual7uier traba6ador del laboratorio+

cono2ca los pasos 7ue tiene 7ue seguir en el momento 7ue se reciba una muestra en ellaboratorio.

. MATERIAL NECESARIO

- Libro de registros- *otulador- !ol/grafo- Frigor/fico- $ongelador- "rdenador con programa de procesado de te?tos

9 PROCEDIMIENTO DE REERENCIA;

Paso %7- Codi$i"a"i#n de las muestras

$uando se reciben las muestras en laboratorio+ se procede al registro y codificacin de lasmismas. Para ello+ se toma el Libro de re(istros? y en la primera fila 7ue est8 en blanco+ seinscribe una de las muestras recepcionada+ destinando una fila completa a cada muestra. Paracada muestra se rellenan todas las casillas 7ue aparecen en la fila:

- Fecha de entrada

- $digo de la muestra: el cual est% comprendido por @ nDmeros+ de los cuales los (Dltimos estan separados por una barra del resto+ y corresponden a las dos Dltimas

cifras del ao. e los cinco numeros 7ue preceden a la barra+ los G primeros soncorrelativos al nDmero de referencia de la muestra anterior+ de modo 7ue si los tresprimeros nDmeros del cdigo anterior son 1(G+ en esta muestra ser%n 1(4. Los (nDmeros siguientes corresponder%n al mes del ao en 7ue nos encontremos. As/ sila muestra se recepciona en febrero de (331+ el cdigo completo de la muestra ser%1(43(H31.

- En el caso de la recepcin de muestras de superficie+ se intercalar% una &0 entre eltercer y cuarto nDmero.

- Procedencia. ireccin. $iudad. Bel8fono

-Bipo de muestra

- "bservaciones: esta casilla se destinar% a poner el tipo de an%lisis 7ue se le va ahacer a la muestra+ fisico-7u/mico+ microbiolgico+ algDn par%metro en concreto.

- Las casillas nDmero de informe y fecha de salida se rellenar%n cuando se termine elan%lisis de la muestra y se elabore el informe. El > informe: ser% el mismo 7ue elcdigo de la muestra+ pero intercalando una I0 entre el tercer y cuarto numero.

En la ho6a de toma de muestras se anotar% el cdigo de laHs muestraHs 7ue esteHn detalladaHsen ella+ y se guardar% en la carpeta destinada a tal efecto.

En la bolsa o envase de pl%stico+ si es una muestra de alimento+ o en la tapa de placa decontacto si es una muestra de superficie+ con el rotulador+ se pondr% el n de referenciaasignado a la muestraHs.

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Paso .7- Conser0a"i#n de las muestras )asta el an@lisis

Cna ve2 codificada la muestra se conservar% en el frigor/fico si se trata de una muestrarefrigerada+ o en el congelador si se trata de una muestra congelada+ hasta el momento delan%lisis+ siendo 8ste tiempo de conservacin lo m%s corto posible. En el caso de muestrasrefrigeradas el tiempo de conservacin ser% siempre inferior a (4 horas.

En el caso de las muestras de superficie+ ver paso n 4.

Paso 97- Elabora"i#n de las $i")as de an@lisis;

Mediante el ordenador se elaborar% la i")a de an@lisis de cada muestra+ con los siguientesdatos: n referencia de la muestra+ fecha de entrada+ tipo de muestra+ fecha de salida+par%metro investigado+ valor obtenido+ valor de referencia segDn la legislacin vigentecorrespondiente al alimento anali2ado+ nombre de la reglamentacin seguida y casilla para lafirma del t8cnico de laboratorio 7ue reali2a el an%lisis y del director t8cnico.

E=em*lo;

Paso


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PREPARACION DE MUESTRAS

% O!6ETIVO

$on esta t8cnica se persigue una correcta homogenei2acin y representatividad de la muestra.

Es decir 7ue la fraccin de alimento destinada al an%lisis microbiolgico+ sea representativa dela totalidad de la misma y su posterior procesado permita su buena homogenei2acin.

. MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO

- Material est8ril ;cuchillo+ esp%tula+ pin2as=- Probeta est8ril- !olsas stomacher- &tomacher- iluyentes: Agua de triptona+ &olucin de *inger J+ Agua de peptona tamponada

;segDn determinaciones posteriores=- Pipetas est8riles de 1ml con divisiones de 3.1 ml.

9 UNDAMENTO DEL METODO

La caracter/stica principal del diluyente+ es 7ue no produce modificaciones cualitativas nicuantitativas en la flora de los alimentos 7ue van a ser anali2ados+ es decir 7ue la mantiene sinsuprimirla ni favorecer su desarrollo.

< PROCEDIMIENTO DE REERENCIA

Paso %7- Toma de muestra

La muestra anal/tica debe estar constituida+ apro?imadamente por (33 g de la misma. Para lapuesta en marcha de las distintas determinaciones se tomar%n de (9 a 133 g de muestra+

dependiendo de la naturale2a de la misma. Lo 7ue sobre+ servir% de reserva por si es necesariauna repeticin.

El tamao de la muestra ser% todo lo voluminosa 7ue permita una buena trituracin yhomogenei2acin.

&i el alimento est% integrado por distintos componentes+ se tomar%n fracciones representativasde cada uno de ellos en superficie y profundidad.

La toma de muestra se har% ba6o condiciones estrictamente est8riles+ para lo 7ue se utili2ar%material previamente esterili2ado en autoclave y c%mara de flu6o laminar. Esta operacin sereali2ar% siempre en las pro?imidades de la llama del mechero bunsen.

Paso .7- Pesada de la muestra

- Barar el recipiente est8ril donde vaya a pesarse la muestra y posteriormente triturarse.- Introducir+ asepticamente+ una porcin adecuada y homogenea de la muestra en dicho

recipiente.- Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento.- $on una probeta graduada est8ril+ se aadir% la cantidad de diluyente correspondiente

al peso neto de la muestra multiplicado por '. e esta manera obtenemos una Dilu"i#nMadre de %;%&? a partir de la cual iremos preparando el resto de las diluciones.

Nota; si se sospecha una contaminacin alta del alimento a anali2ar+ deberemos hacerdiluciones como m/nimo de 13-9


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Paso 97- Tritura"i#n de la muestra

urante el triturado es importante evitar la destruccin de los microorganismos por rotura desu membrana o por un calentamiento e?cesivo.

$on esta etapa+ se persigue obtener una me2cla homog8nea para lograr la distribucinadecuada de los microorganismos y sus to?inas.

El procedimiento utili2ado es el triturador de paletas o &tomacher+ el cual actDa golpeandoritmicamente la me2cla de alimento y diluyente 7ue ha sido introducida previamente en unabolsa de pl%stico est8ril. Los cho7ues producidos por las paletas dislacer%n el alimento y ponena las bacterias en suspensin.

Paso


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RECUENTO DE MICROOR4ANISMOS AERO!IOS MESOILOS 29%F'-%C3

% O!6ETIVOS

&e persigue la estimacin de la calidad sanitaria de los productos anali2ados indicando+

adem%s de las condiciones higi8nicas de la materia prima+ la forma de manipulacin 7uesufrieron durante su manipulacin.

En general+ el recuento de la flora aerobio mesfila es una prueba para conocer las condicionesde salubridad de algunos alimentos.

. MATERIAL MEDIOS DE CULTIVO

- Pipetas est8riles de 1 ml+ con divisiones de 3.1 ml.- Placas petri est8riles de '3 mm de di%metro.- Estufa de incubacin+ G3 KH - 1 $- Agar nutritivo de recuento ;M8todos Est%ndar Agar+ APA=

9 UNDAMENTO DEL METODOLa composicin del medio basada en la peptona de caseina como aportacin nutritiva+ ele?tracto de levadura como sustrato vitam/nico y la glucosa como fuente energ8tica+ favorece elcrecimiento de la mayor parte de los microorganismos+ sin precisar de otros aditivos.

< PROCEDIMIENTO DE REERENCIA: METODO DE RECUENTO EN PLACA

&e utili2a para determinar el nDmero de microorganismos por gramo o mililitro del alimento enestudio+ partiendo de la serie de diluciones decimales+ mediante el empleo de t8cnicas enplacas de agar.

BE$>I$A:

Paso %.- A partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado+ depositar con pipetaest8ril+ 1 ml de cada dilucin en otras tantas placas de Petri est8riles de '3 mm de di%metro.

Paso ..- Aadir a cada placa unos 19 ml de agar de APA previamente licuado y atemperadoa 4@ $.

El tiempo transcurrido entre depositar las distintas diluciones en la placa y el posterior vertidodel medio de cultivo sobre las mismas+ no debe de e?ceder de 13 minutos. As/ mismo+ eltiempo total transcurrido entre la elaboracin de las diluciones decimales y el vertido del mediosobre la Dltima placa+ no deber% ser superior a (3 minutos.

Paso 97- Me2clar perfectamente medio e inculo+ lo cual se consigue moviendo la placa sobrela superficie de la mesa en c/rculos y en forma de cru2+ evitando 7ue el medio llegue aimpregnar la tapa de la placa. e6ar solidificar el agar en las placas sobre una superficiehori2ontal.

Cna ve2 solidificado el agar+ las placas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a unaTG de 9% F' - % C? durante . )7

Paso


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INVESTI4ACION Y RECUENTO DE ENTERO!ACTERIACEAE TOTALES ENMEDIO S>LIDO CON REVIVIICACI>N

% O!6ETIVOS

Los miembros de la familia Enterobacteriaceaeson g8rmenes de forma bacilar+ gramnegativos+aerobios y anaerobios facultativos+ no esporulados+ mviles o inmviles+ 7ue fermentan laglucosa+ reducen nitratos a nitritos+ son citocromo-o?idasa negativos y crecen en medios 7uecontienen sales biliares.

Las Enterobacteriaceae son indicadoras de contaminacin fecal+ y su uso como /ndice haad7uirido gran aceptacin en Europa. &e utili2an preferentemente+ para sealar la calidadsanitaria de alimentos procesados. &u presencia a niveles altos en estos productos indicaelaboracin poco higi8nica+ contaminacin posterior a su fabricacin o ambas cosas.


- Pipetas est8riles de 1 ml con divisiones de 3.1 ml.- Placas de Petri est8riles de '3 mm de di%metro.- Estufa de incubacin a G@ KH - 1 $- Asas de siembra- $aldo triptona-so6a ;Brytone &oy !roth: B&!=- $aldo EE de Mossel simple- Agar biliado ro6o violeta glucosa ;,iolet *ed !ile


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Los microorganismos 7ue slo fermentan glucosa como &almonella y &higella+ 7ue seencuentra en una concentracin 13 veces inferior a la lactosa+ aun7ue aparece el coloramarillo+ slo lo hace en la columna vertical del medio ;base del tubo=+ mientras 7ue en lasuperficie inclinada se restablece el color ro6o por o?idacin del %cido. $uando el color amarilloobtenido en la acidificacin del medio+ es producido por la fermentacin de la lactosa+ espersistente de manera 7ue la superficie inclinada se mantiene amarilla. Los cultivos 7uecontienen microorganismos capaces de formar ierro III &ulfuro+ presentan el caracter/sticoprecipitado negro. La produccin de gas se observa por la aparicin de burbu6as de aire eincluso por rotura del propio gel.


Paso %7- Preenriue"imiento en medio lJuido no sele"ti0o

En esta etapa se logra la revivificacin de las Enterobacteriaceae+ se incrementa su vitalidad yse ad7uieren las condiciones fisiolgicas adecuadas para su perfecto desarrollo.

&e pesan as8pticamente+ 13 gr de muestra y se aaden '3 ml de medio B&!+ homogenei2ar en

&tomacher y de6ar a temperatura ambiente durante ( horas+ agitando de ve2 en cuando.

Paso .7- Enriue"imiento en medio lJuido sele"ti0o

En esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de las Enterobacteriaceae y se restringe laproliferacin de la flora competitiva.

A partir del cultivo de preenri7uecimiento ;dilucin 1:13= se hacen diluciones al 1:133 y 1:1333+ utili2ando como diluyente caldo B&!.

&e preparan G series de G tubos+ conteniendo cada uno de ellos 13 ml de caldo deenri7uecimiento EE de Mossel simple.

A partir de las diluciones decimales+ tomar 1ml de cada una de ellas+ y aadirlo a los tubos con13 ml de medio EE de Mossel simple. e esta manera tendremos una serie de ' tubosdispuestos de tres en tres en una gradilla+ de manera 7ue a los tres primeros le aadimos 1 mlde la dilucin 1H13+ a los tres segundos 1 ml de la 1H133 y a los tres Dltimos 1ml de la1H1333.

Agitar para me2clar e incubar todas las series a G@ $ durante (4 horas.

Paso 97- Identi$i"a"i#n de "olonias tJ*i"as en medio s#lido

A partir del medio l/7uido selectivo+ agit%ndolo bien para me2clar bien el contenido de los tubos

7ue presenten crecimiento bacteriano+ sembrar con asa sin recargarla demasiado+ sobresuperficie bien seca del medio ,*!< contenido en placas de Petri.

Incubar en estufa a G@ $ todas las placas sembradas+ durante (4 h.

Las colonias de color ro6o violeta rodeadas de un halo de precipitacin+ tambi8n violeta+ seconsideran Enterobacteriaceae.

Paso


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Prueba de la citocromo-o?idasa:

Para la deteccin de esta en2ima+ se coloca un tro2o de papel hatman de unos 9 cm( en unaplaca de Petri vac/a. En el centro del papel se depositan G gotas del reactivo. $on una pipetaPasteur con la punta cerrada+ se toma una porcin del cultivo obtenido sobre agar nutritivo yse e?tiende sobre el papel impregnado de reactivo+ en una 2ona de 4-9 mm. En la reaccinpositiva aparece un color violeta oscuro en la e?tensin del cultivo.

Las Enterobacteriaceae son "ito"romo-oxidasa ne(ati0as7

&iembra de colonias en medio ligler:

Bomar una colonia bien diferenciada de cada placa y sembrarla en picadura sobre el medio+ demanera 7ue tambi8n se siembre el pico de flauta.

Bodas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa+ por lo tanto el crecimiento en medio liglerser%:

Su*er$i"ie in"linada; ro=a ' amarilla!ase; amarilla4as; F'-B.S; - ' F

Lectura de resultados: &e calcula el nDmero de Enterobacteriaceaetotales por gramo o mililitrode alimento consultando la Babla del >MP de tres series de tres tubos+ en los tubos 7uemuestren crecimiento en caldo EE de Mossel simple+ los g8rmenes sean $itocromo-o?idasanegativos y el crecimiento sobre agar ligler corresponda al de las Enterobacteriaceae.

%.


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INVESTI4ACION Y RECUENTO DE ESCBERICBIA COLI

% O!6ETIVOS

La determinacin de E. coli en los alimentos+ tiene como finalidad servir de ndice decontaminacin fecal

de los mismos.

E. coli es huesped constante del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente.ebido a su especificidad+ es considerado un buen /ndice de contaminacin fecal. Por elcontrario+ vive poco tiempo en un ambiente e?traent8rico+ por lo 7ue su presencia en losalimentos es indicativa de una contaminacin reciente.

&e destruye a temperatura de pasteuri2acin y tambi8n durante su almacenamiento en fr/o+sobre todo a temperatura de congelacin.

&u escasa resistencia hace 7ue no sea un buen indicador de flora patgena+ ya 7ue en algunoscasos como la &almonella+ es mucho menos resistente a las condiciones ambientales y a laaccin del fr/o.

Pertenecen a la familia de las enterobacteriaceae y dentro de ellas al grupo de los coliformesya 7ue son capaces de fermentar la lactosa en presencia de sales biliares con formacin de gasy %cido a B) de G3 $ y hasta m%s de 44 $. "tra caracter/stica bio7u/mica de E. coli+ es sucapacidad para producir Indol en Agua de triptona incubada a 44.9$ durante 45h.

.7- MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO

- Pipetas est8riles de 1 ml con divisiones de 3.1 ml.- Placas de Petri est8riles de '3 mm de di%metro.- Estufa de incubacin de 44.9 KH - 1 $

-Asas de siembra

- Bubos de ensayo- $ampanas urham- Agua de Briptona- $aldo Lactosado biliado verde brillante ;!

97- UNDAMENTO DEL METODO;

$aldo Lactosado !iliado ,erde !rillante: el ob6etivo de este medio es el de poder inhibir elcrecimiento de los microorganismos distintos de los coliformes+ al tiempo 7ue 8stos puedancrecer sin restriccin. $on la presencia de la !ilis de !uey y del ,erde !rillante+ se consigue lainhibicin de casi la totalidad de los microorganismos gram-positivos y de los gram-negativosdistintos de los del grupo de los coliformes. Es importante conocer 7ue la concentracin de,erde !rillante es cr/tica para evitar el crecimiento de microorganismos anaerobios capaces defermentar la lactosa a 44 $+ lo cual podr/a falsear los resultados.

$aldo E$: la presencia de sales biliares determina la inhibicin de las esporas y losestreptococos fecales. La me2cla de fosfatos regula el p del medio. La Briptosa es el elementonutritivo y el sodio cloruro aporta la salinidad necesaria para el buen crecimiento de los

g8rmenes. La Lactosa favorece el crecimiento de los coliformes+ y su consumo se manifiestacon la aparicin de gas en las campanas durham.

%9


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Agar de Levine: la Eosina y el A2ul de metileno+ son productos 7ue inhiben parcialmente elcrecimiento de microorganismos gram positivos+ entre ellos los Estreptococos fecales. Adem%sla combinacin de ambos componentes+ permite la diferenciacin entre los microorganismoslactosa N positivos de los lactosa N negativos. Los coliformes dan colonias violeta oscuro+ concentro m%s oscuro. E. coli+ presenta unas colonias muy caracter/sticas ya 7ue van del pDrpuraal verde+ con brillo met%lico.

ierro de liger+ Agar: a trav8s de este medio se diferencian los bacilos ent8ricos gram ;-=tanto por la capacidad de fermentar la lactosa yHo glucosa como por la de producir hidrgenosulfuro. La acidificacin del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto conun cambio de color del ro6o de fenol 7ue pasa de ro6i2o a amarillo.

Los microorganismos 7ue slo fermentan glucosa como &almonella y &higella+ 7ue seencuentra en una concentracin 13 veces inferior a la lactosa+ aun7ue aparece el coloramarillo+ slo lo hace en la columna vertical del medio ;base del tubo=+ mientras 7ue en lasuperficie inclinada se restablece el color ro6o por o?idacin del %cido. $uando el color amarilloobtenido en la acidificacin del medio+ es producido por la fermentacin de la lactosa+ espersistente de manera 7ue la superficie inclinada se mantiene amarilla. Los cultivos 7ue

contienen microorganismos capaces de formar ierro III &ulfuro+ presentan el caracter/sticoprecipitado negro. La produccin de gas se observa por la aparicin de burbu6as de aire eincluso por rotura del propio gel.

< PROCEDIMIENTO DE REERENCIA; METODO DE NUMERO MAS PRO!A!LE 2NMP3

Paso %7- Siembra en medio !4!L

A partir de las diluciones decimales+ tomar 1ml de cada una de ellas+ y aadirlo en tubos con13 ml de medio !


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Paso MP paraobtener el n de E. coli por gramo o ml de muestra.

Paso 7- Otras *ruebas "on$irmati0as;

&iembra de colonias en medio liger: tomar una colonia bien diferenciada de cada placa ysembrarla en picadura sobre el medio+ de manera 7ue tambi8n se siembre el pico de flauta. E.coli va a presentar las siguientes caracter/sticas:

Su*er$i"ie in"linada; amarilla!ase; amarilla4as; FB.S; -

&iembra en bateria API: bater/a proporcionada comercialmente+ en la 7ue se encuentran variaspruebas bio7u/micas a modo de pocillos donde se reali2a la siembra. Posteriormente losresultados se leen en tablas 7ue nos dar%n el nombre de la especie anali2ada.

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INVESTI4ACION DE SALMONELLA

% O!6ETIVOS

&on las principales productoras de to?iinfecciones alimentarias y su presencia en los alimentos

puede ocasionar graves trastornos gastrointestinales en el hombre+ 7ue incluso le lleven a lamuerte. Los alimentos en los 7ue pueden aparecer con mayor asiduidad son: carnes+ sobretodo picadas+ productos de charcuter/a+ huevos y ovoproductos+ helados+ cremas pasteleras+moluscos+ frutas.

La transmisin de la salmonelosis+ se hace a partir de los alimentos de origen animalcontaminados+ al hombre. Bambi8n es posible la transmisin directa de hombre a hombre y lade portadores asintom%ticos a alimentos y posteriormente a hombre.

La infeccin se produce por la ingestin 6unto con los alimentos contaminados+ de organismosvivos. Esta contaminacin llega hasta el alimento a trav8s de manipulaciones higi8nicasincorrectas 7ue incluyen el no aseo de manos o utensilios 7ue hayan estado en contacto conheces de animales o humanos.

El g8nero &almonella+ pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae y est% integrado pormicroorganismos 7ue forman colonias t/picas sobre medios selectivos slidos y poseencaracter/sticas bio7u/micas y serolgicas definidas. Bienen la morfolog/a de enterobacterias+casi siempre mviles+ gram ;-=+ fermentan la glucosa con formacin de gas+ pero nofermentan la lactosa.

.7- MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO

- Estufa de incubacin a G@ KH - 1 $- Asas de siembra- $aldo B&!

-$aldo &elenito $istina

- Agar eOtoen- Agar &almonella-&higella- !ateria API- Medio liger

9 UNDAMENTO DEL METODO3

$aldo selenito $istina: el &odio idrgeno &elenito inhibe el crecimiento de $oliformes yEnterococos+ por el contrario &almonella+ Proteus y Pseudomonas no son inhibidos. La cistinaactDa como factor de crecimiento para la &almonella. El efecto inhibidor del &elenitodesaparece a partir de la 15-(4 h de incubacin y el crecimiento de la flora acompaante

puede dificultar el de &almonella.

Agar eOtoen: por la presencia de los dos indicadores se diferencian los microorganismoslactosa ;K= de los ;-=. Las positivas toman un color amarillo anaran6ado y las segundas un a2ulverdoso. La presencia de sacarosa y salicilina evita la formacin de patgenos falsamentepositivos.$on el &odio Biosulfato y el Amonio ierro III $itrato+ se detectan los productores deidrgeno &ulfuro por el precipitado negro de ierro &ulfuro 7ue presentan en el centro de lascolonias. La presencia de sales biliares inhibe el crecimiento de una gran parte de floraacompaante. Las "olonias de Salmonella *resentan un "olor 0erde aKulado "on "entrone(ro o sin 8l7

Agar &almonella-&higella: por la presencia de las sales biliares+ verde brillante y citrato+ se

consigue la inhibicin de las bacterias gram ;K=. Por el mismo citrato con6untamente con eltiosulfato se frena notablemente el desarrollo de $oliformes y Proteus 7ue podr/an acabarcubriendo todo el cultivo.

%


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Las bacterias 7ue no fermentan la lactosa dan colonias incoloras+ mientras 7ue las 7uefermentan hacen virar el ro6o neutro por la produccin de %cido y 7uedan claramentediferenciadas. Bambi8n se diferencian los microorganismos productores de idrgeno &ulfuro7ue dan un precipitado negro de ierro II &ulfuro+ observ%ndose en el centro de la colonia.

Las "olonias de Salmonella son in"oloras + "on un *unto ne(ro en el "entro7


Paso %7- Preenriue"imiento en medio lJuido no sele"ti0o

En esta etapa se logra la revivificacin de las &almonellas lesionadas+ se incrementa suvitalidad y se ad7uieren las condiciones fisiolgicas adecuadas para su perfecto desarrollo.

&e pesan asepticamente+ (9 gr de muestra y se aaden ((9 ml de medio B&! o de agua depeptona+ homogenei2ar en &tomacher e incubar a G@ $ durante 1 N (3 h+ agitando de ve2 encuando.

Paso .7- Enriue"imiento en medio lJuido sele"ti0o

En esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de las &almonella y se restringe laproliferacin de la flora competitiva.

Agitar el cultivo de preenri7uecimiento y aadir 13 ml del mismo a 133 ml de $aldo &elenito$istina. Incubar a G@ $ durante 15 N (4h.

Paso 97- Aislamiento di$eren"ial sobre medio s#lido sele"ti0o

En esta etapa se restringe aDn m%s el crecimiento de la flora competitiva y se estimula el de la&almonella.

A partir del medio l/7uido selectivo+ sembrar con asa sin recargarla demasiado+ en ( placas conmedio eOtoen y en ( placas con medio &almonella-&higella. Incubar en estufa a G@ $ todaslas placas sembradas+ durante (4 N 45 h.

Paso


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INVESTI4ACION Y RECUENTO DE STAPBYLOCOCCUS AUREUS

% O!6ETIVOS

Es una especie muy sensible a la accin del calor y de los desinfectantes. &u presencia o la de

sus to?inas en los alimentos es signo evidente de falta de higiene. Estas to?inas+ al seringeridas por el hombre+ pueden ser causa de into?icacin. &on anaerobios facultativos.

En general un n elevado de &. Aureus en un alimento+ refle6a una higiene defectuosa por malamanipulacin. &i adem%s los &.Aureus aislados son cepas enteroto?/genas+ suponen un riesgopara la salud.

Puede ocurrir 7ue no se detecte &. Aureus en un alimento+ pero si e?ista cantidad detectablede su enteroto?ina. En este caso los microorganismos han ido descendiendo en n e inclusodesapareciendo+ mientras 7ue la to?ina por su mayor resistencia+ pemanece en el alimento.


- Bubos de ensayo- Pipetas de 1 ml est8riles- Estufa de cultivo- Asa de siembra- Placas de Petri de '3 mm de di%metro- $aldo de enri7uecimiento


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Paso %7- Siembra sobre medio de enriue"imiento

&e parte de la suspensin madre del producto a anali2ar+ sembrando+ por duplicado+ 1 ml dedicha suspensin 7ue contengan 1' ml de caldo y se esperan unos minutos a 7ue se

produ2ca una 2ona transparente alrededor de la 2ona de crecimiento.

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RECUENTO DE MOBOS Y LEVADURAS

% O!6ETIVOS

Estudio de la presencia de mohos y levaduras 7ue est%n presentes en una muestra dealimento.

e la amplia dispersin de los hongos en todos los estratos biticos e inertes se desprende suf%cil y frecuente aparicin como contaminantes en productos alimentarios+ ya 7ue 8stos+constituidos por sustancias inorg%nicas y org%nicas m%s o menos comple6as+ constituyene?celentes medios para la sustentacin y reproduccin de un gran nDmero de especiesfDngicas.

El significado de la contaminacin fDngica de los alimentos+ especialmente por mohos+ viene nosolo del potencial de los hongos para deteriorarlos+ sino tambi8n del potencial de muchos deellos para producir una gran variedad de micoto?inas a las 7ue el hombre tiene susceptibilidad+as/ como su capacidad para provocar infecciones e incluso+ reacciones al8rgicas en personashipersensibles a ant/genos fDngicos.

E?iste un riesgo potencial en la contaminacin fDngica de los alimentos y+ por ello+ paraconocer la calidad microbiolgica de diversos productos+ se procede a la evaluacin de su tasade contaminacin por mohos y levaduras.

En cuanto a su significado para la salud del consumidor+ la accin de las levaduras esmeramente infectiva+ mientras 7ue el mayor problema originado por los mohos se refiere a sugran capacidad de elaboracin de micoto?inas. >o obstante+ ciertos mohos pueden ser tantoagentes de micosis como responsables de into?icaciones.


- Material est8ril

-Etanol ' vHv

- !olsas stomacher- &tomacher- Pipetas est8riles de 1ml con divisiones de 3.1 ml.- iluyentes: Agua de triptona+ &olucin de *inger J+ Agua de peptona tamponada

;segDn determinaciones posteriores=- Agar &aboreaud

9 UNDAMENTO DEL METODO

Agar &abouraud: la peptona es la fuente nitrogenada para el crecimiento de hongos ylevaduras+ el carbonato es la fuente energ8tica. El crecimiento selectivo de los medios 7ue no

contienen antibitico+ depende e?clusivamente del p %cido de estos medios.

< PROCEDIMIENTO DE REERENCIA; METODO DE RECUENTO EN PLACA

&e utili2a para determinar el nDmero de microorganismos por gramo o mililitro del alimento enestudio+ partiendo de la serie de diluciones decimales+ mediante el empleo de t8cnicas enplacas de agar &abouraud.

BE$>I$A:

Paso %.- A partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado+ depositar con pipetaest8ril+ 1 ml de cada dilucin en otras tantas placas de Petri est8riles de '3 mm de di%metro.

Paso ..- Aadir a cada placa unos 19 ml de agar &abouraud previamente licuado yatemperado a 4@ $.

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El tiempo transcurrido entre depositar las distintas diluciones en la placa y el posterior vertidodel medio de cultivo sobre las mismas+ no debe de e?ceder de 13 minutos. As/ mismo+ eltiempo total transcurrido entre la elaboracin de las diluciones decimales y el vertido del mediosobre la Dltima placa+ no deber% ser superior a (3 minutos.

Paso 97- Me2clar perfectamente medio e inculo+ lo cual se consigue moviendo la placa sobrela superficie de la mesa en c/rculos y en forma de cru2+ evitando 7ue el medio llegue aimpregnar la tapa de la placa. e6ar solidificar el agar en las placas sobre una superficiehori2ontal.

Cna ve2 solidificado el agar+ las placas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a unatG de ./C F' - % C? durante / dJas? realiKando un *rimer "onta(e de "olonias alter"ero ;se hace para observar el crecimiento de micelios a8reos invasores=

Paso

11. Analisis Microbiologico de Alimentos

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