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FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DE BIOTECHNOLOGIE

THESE

Présentée par

Melle MEKDADE LOUBNA

Pour l’obtention du diplôme de

DOCTORAT

Spécialité : Biotechnologie

Thème :

ETUDE D’EXTRAITS MOLECULAIRES DE MICROALGUES :

EFFETS SUR LES CELLULES CANCEREUSES

Devant le jury composé de :

Président : Mr. ABI AYAD Sidi Mohammed El-Amine Professeur Université d’Oran 1 Ahmed Benbella

Rapporteurs: Mr. BABA HAMED Mohamed Bey Professeur Université d’Oran 1 Ahmed Benbella

Mme El-KEBIR Fatima Zohra Professeur Université d’Oran 1 Ahmed Benbella

Examinateurs: Mme MERZOUK Hafida Professeur Université Aboubekr Belkaïd, Tlemcen

Mr. SLIMANI Miloud Professeur Université Moulay Tahar, Saïda

Mr. SAHRAOUI Toufik Professeur Université d’Oran 1 Ahmed Benbella

Année universitaire 2016/2017

Soutenue le : 19 / 01 / 2017

Je dédie ce travail et l’adresse avec ma profonde gratitude à mon père, ma mère et ma

sœur et ce :

Pour m'avoir inculqué de vraies valeurs.

Pour m'avoir accompagnée, aidée, et encouragée.

Pour leur présence et leur soutien inconditionnel.

Pour leur patience et leur compréhension.

Pour m'avoir toujours offert le meilleur.

Puisse Dieu vous prêter une longue vie et vous accorder santé et sérénité.

Remerciements

Pour m’avoir proposé et fait apprécier la biotechnologie.

Pour m’avoir soutenue, encadrée et formée durant tout mon cursus.

Pour m’avoir permis d’activer dans leurs services et laboratoires.

Pour leurs pertinentes suggestions et leurs précieux conseils.

Pour leur patience, leur écoute et leur disponibilité.

Pour leur diligence.

Pour m’avoir mis le pied à l’étrier de la recherche scientifique.

Pour m’avoir fait l’honneur de faire partie du jury et pour avoir accordé de l’intérêt à mon

travail de recherche.

Mes plus sincères remerciements et ma gratitude vont, à chacun pour ce qui le concerne à:

Mr. Baba Hamed Mohamed Bey, professeur à l’université d’Oran 1 Ahmed Benbella.

Mme El-Kébir Fatima Zohra, professeur à l’université d’Oran 1 Ahmed Benbella.

Mr. Abi Ayad Sidi Mohamed El-Amine, professeur à l’université d’Oran 1 Ahmed Benbella.

Mme Merzouk Hafida, professeur à l’université Aboubekr Belkaïd de Tlemcen.

Mr. Slimani Miloud, professeur à l’université Dr Moulay Tahar de Saïda.

Mr. Sahraoui Toufik, professeur à l’université d’Oran 1 Ahmed Benbella.

Mr. Krallafa Mohamed Abdelghani, professeur à l’université d’Oran 1 Ahmed Benbella.

Mr. Toumi Houari, professeur à l’université d’Oran, chef de service de Pharmacologie et

directeur des activités médicales de l'établissement hospitalo-universitaire 1er Novembre

1954 (EHU) d’Oran.

Mr. Chader Henni, professeur à l’université d’Alger et chef de service de

Pharmacotoxicologie du Laboratoire National de Contrôle des Produits

Pharmaceutiques(LNCPP) d’Alger.

Mr. Mansouri Mohamed, professeur et directeur général de l'établissement hospitalo-

universitaire 1er Novembre 1954 (EHU) d’Oran.

Mr. Mansouri Mohamed Bensilimane, professeur à l’université d’Alger et Directeur général

du Laboratoire National de Contrôle des Produits Pharmaceutiques (LNCPP) d’Alger.

Mr. Le Général Naim Malek, professeur à l’université d’Alger, et chef de service de

microbiologie à l’Hôpital Central de l’Armé (HCA), Alger.

Mr. Le Colonel Miloudi Noui, professeur en pneumo-phtisiologie.

Mr. Le Colonel Maazouzi Benameur, professeur médecin-chef et directeur des activités

médicales de l’Hôpital Militaire Régional et Universitaire d’Oran (HMRUO).

Mr. Tizraoui Mahmoud, PDG de SET (Société d'Etudes & de Travaux) Alger.

Mr. Laaraba Rachid et Mme Kesraoui Nassima du Centre de Recherche et d’Analyses

Physicochimiques (CRAPC) de Tipasa.

Mr El kaoua Mimoun et Mme Bouamama Hafida, professeurs à l’université Cadi Ayyad de

Marrakech.

La police scientifique et technique d’Oran.

Et aux nombreuses personnalités et cadres de différentes spécialités, services et régions qui

ont bien voulu accorder une attention particulière à mes sollicitations.

RESUMÉ

Les organismes marins, dont les microalgues, constituent un champ d’investigation majeur

pour la recherche de nouvelles molécules thérapeutiques susceptibles d’améliorer les réponses

aux traitements anticancéreux. Dans ce contexte, et afin d’identifier des molécules naturelles

ayant un effet antioxydant et antiprolifératif sur les cellules cancéreuses, nous avons évalué la

teneur en composés phénoliques de cinq extraits issus de la microalgue Nannochloropsis

gaditana, à savoir des extraits de type: acétonique, méthanolique, dichlorométhanique,

hexanique et aqueux. Par ailleurs, l’activité antioxydante de ces extraits a été étudiée par deux

méthodes: la réduction du fer et le piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl). Ces extraits ont de surcroit fait l’objet d’une évaluation de l’activité

antiproliférative sur une lignée du cancer du poumon (A549) par le test MTT (3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Une caractérisation de l’extrait

présentant le meilleur effet sur la lignée A549 a été réalisée par CCM, spectrométrie

infrarouge et HPLC. Les résultats révèlent que l’extrait aqueux, le plus riche en phénols, fait

preuve de la meilleure activité antioxydante. L’extrait acétonique qui a présenté la plus faible

concentration en phénols révèle une bonne activité antioxydante et l’activité antiproliférative

la plus élevée. Nos résultats suggèrent que l'activité antioxydante des extraits de N.gaditana

n’est pas seulement due à la présence de composés phénoliques, mais aussi à d'autres

molécules à effet antioxydant qui restent à caractériser. Par ailleurs, des molécules dotées

d’un effet potentiellement anticancéreux doivent certainement être présentes dans l'extrait

acétonique, ce qui lui confère l’effet antiprolifératif sur la lignée A549. La caractérisation de

cet extrait a mis en évidence la présence de pigments, principalement des xanthophylles qui

seraient à l’origine de son activité antiproliférative. Nos résultats témoignent du potentiel de

N.gaditana comme source de molécules à activités antioxydante et antiproliférative. Des

investigations plus approfondis permettront la mise en valeur de ces résultats préliminaires et

la caractérisation d’éventuelles molécules thérapeutiques à grande valeur ajoutée.

Mots clés: Nannochloropsis gaditana, cancer, phénols, DPPH, réduction du fer, MTT,

pigments.

ABSTRACT

Marine organisms, including microalgae, are among major fields of investigation for the

research of novel therapeutic molecules that may improve responses to cancer treatment.

Within this framework and in order to identify a natural antioxidants and antiproliferative

molecules, we focused most of our investigations towards the evaluation of phenolic

compounds in Nannochloropsis gaditana extracts namely: acetonic, methanolic,

dichloromethanic, hexanic and aqueous extracts. Otherwise, the antioxidant activity of these

extracts was evaluated by two methods: the scavenging of DPPH (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) free radical and the ferric reducing power. The antiproliferative activity is also

assessed on A549 (Human lung cancer cell line) by MTT assay. A characterization of the

extract having the best effect on the A549 cell line is carried out by a TLC, IR spectrometry

and HPLC. The results reveal that the aqueous extract, the richest in phenols, has

demonstrated best antioxidant activity. The acetonic extract which exhibits the lowest phenols

concentration reveals good antioxidant activity and the highest antiproliferative activity. Our

results suggest that the antioxidant activity of N.gaditana extracts is not only due to the

presence of phenolic compounds, but is also due to the presence of other molecules with an

antioxidant effect. In addition, molecules endowed with a potentially anti-cancer effect must

certainly be present in the acetonic extract, which gives it the antiproliferative effect on A549

cell line. The characterization of this extract showed the presence of pigments, mainly

xanthophylls, which could be the cause of the antiproliferative activity of the acetonic extract.

Our results demonstrate the potential of N.gaditana as a source of antioxidant and

antiproliferative molecules. More detailed investigations will allow the development of these

preliminary findings and the characterization of potential therapeutic molecules with high

added value.

Key words: Nannochloropsis gaditana, cancer, phenols, DPPH, ferric reducing power, MTT,

pigments.

Liste des abréviations

Ac : Acétonique

AGPI : Acides Gras Poly-Insaturés

AQ : Aqueux

ARA-A : Adenine-arabinoside

ARA-C : Cytosine-arabinoside, Cytarabine, Cytosar-U®

ATCC : American Type Culture Collection

BHA : ButylHydroxyAnisole

BHT : ButylHydroxyToluène

CAT : catalase

CCM : Chromatographie sur Couche Mince

CdK : Cyclin-dependent kinases

CKI : Cyclin-dependent kinase inhibitor

CI50 : Concentration Inhibant 50% de la croissance cellulaire

CRAPC : Centre de Recherche et d’Analyses Physico-Chimiques

DCM : DiChloroMéthanique

DMSO : Diméthylsulfoxyde

DPPH• : 2.2 diphenyl 1 picryl hydrazyl

EAG : Equivalents d’Acide Gallique

EC50 : Half Effective Concentration (concentration efficace médiane)

CI 50 : Concentration Inhibitrice médiane

ERO : Espèces Réactives de l’Oxygène

FASL : Apoptosis Stimulating Fragment Ligand

FGF : Fibroblast Growth Factor

GPX : glutathion peroxydase

GR : glutathion réductase

GSH : glutathion réduit

GSSG : glutathion oxydé

G6PD : glucose-6-phosphate déshydrogénase

HAT : Hydrogen Atom Transfer

Hex : Hexanique

HIF : Hypoxia Inducible Factors

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

IFN : Interférons

IL : Interleukines

LASER : Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

LNCPP : Laboratoire National de Contrôle des Produits Pharmaceutiques

Met : Méthanolique

MS : Matière Sèche

MTT : Bromure de 3-(4,5-diMethylThiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium)

NCI : National Cancer Institute

NF-κB : Nuclear factor kappa B

PBS : Phosphate Buffered Saline (tampon phosphate salin)

PDT : Photothérapie Dynamique des Tumeurs

PDA : Photodiode Detector Array (Détecteur à barrettes de diodes)

PDGF : Platelet-Derived Growth Factor

PG : Propyl Gallate

PKC : Protéines kinase C

PVDF : Fluorure de polyvinylidine

Rf : Rapport frontal

RPMI : Roswell Park Memorial Institute medium

SD : Standard Deviation (écart type)

SET Singel Electron Transfer

SOD : SuperOxyde Dismutase

SVF : Sérum de Veau Fœtal

TBHQ : TétraButylHydroQuinone

TNF : Tumor Necrosis Factor

TRAIL : Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing Ligand

VEGF : Vascular-Endothelial Growth Factor

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Les six altérations physiologiques de la cellule conduisant à la formation de

cellules cancéreuses…………………………………………………………………….....

8

Figure 2 : Ordre d’apparition des différentes altérations physiologiques de la cellule

conduisant à la formation de cellules cancéreuses. A : les différentes caractéristiques du

cancer. B : chronologies d’apparition des caractéristiques de la cellule cancéreuse……...

9

Figure 3 : Les différentes étapes de la progression tumorale, en association avec les

altérations génétiques des cellules…………………………………………………………

11

Figure 4 : Représentation du principe de la photothérapie dynamique des tumeurs PDT.. 14

Figure 5 : Les cibles des agents antitumoraux..………………………………………..... 15

Figure 6 : Structure chimique du flavopiridol..………………………………………...… 18

Figure 7 : Structure chimique de l’ABT-737. ……………………………………..……. 20

Figure 8 : Structure chimique du taxotère® (Docétaxel) (A) et du taxol® (Pclitaxel) (B). 21

Figure 9 : Exemples de la diversité chimique du monde végétal terrestre ; formule

chimique de la camptothécine (A), la vinblastine (B) et de l’étoposide 5

(épipodophyllotoxine) (C)…………………………………………………………………

21

Figure 10 : Structure chimique de l’ixabepilone (Ixempra®)…………………………..... 22

Figure 11: Structure chimique du temsirolimus (Torisel®)………………………….….. 22

Figure 12 : Les pathologies associées aux espèces réactives de l’oxygène………….…... 28

Figure 13: Principales étapes de la défense enzymatique contre les espèces réactives de

l’oxygène…………………………………………………………………………………..

30

Figure 14 : Structure chimique de la 2-phénylbenzopyrane………………...…………… 31

Figure 15 : Mécanisme d’action antioxydante des composés phénoliques………………. 32

Figure 16 : Structure chimique de caroténoïdes : violaxanthine et β,β-carotène……..….. 33

Figure 17 : Oligoélements nécessaires aux activités des enzymes antioxydantes……..... 33

Figure 18 : Structures chimiques de quelques antioxydants de synthèse………………… 34

Figure 19 : Effets biologiques des polyphénols……………………………………...…... 35

Figure 20 : Effet des radicaux libres sur le processus de carcinogenèse………………… 37

Figure 21 : Structure chimique de la céphalosporine C (A) et de l’ARA C (B)………… 40

Figure 22 : Structure chimique de l’halomon, un monoterpène issu de l’algue rouge

Portiera hornemannii……………………………………………………………………...

41

Figure 23: Schéma représentatif des principales caractéristiques ultra-structurales de

Nannochloropsis gaditana………………………………………………………………...

46

Figure 24 : Structure chimique du jamaicamide A (A) et de la wewakpeptine A (B)…… 48

Figure 25 : Structure chimique de l’amphidinolide A (A) et du caribenolide I (B)…….... 49

Figure 26 : Forme libre et réduite du DPPH…………………………………………...… 55

Figure 27 : Action de la succinate déshydrogénase sur le MTT. Coupure du cycle

tetrazolium conduisant à des cristaux de formazan.………………………………………

58

Figure 28 : Observation microscopique (x200) de la lignée A549 en croissance normale,

dans son milieu de culture, fixée sur support solide. …………………………………….

58

Figure 29: (a) Courbe d’étalonnage de l’acide gallique et (b) teneur en composés

phénoliques dans les extraits de N.gaditana;(Ac): extrait acétonique, (Met): extrait

methanolique, (DCM): extrait dichloromethanique, (Hex): extrait hexanique et (AQ):

extrait aqueux. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3).

67

Figure 30: Activité de piégeage du radical DPPH• (%): (A) par les extraits de

N.gaditana, (B) par l’acide ascorbique et le BHT. Chaque valeur est exprimée sous

forme de moyenne ± écart-type (n = 3)..…………….……………………………………

69

Figure 31: Pouvoir de reduction du fer: (A) par les extraits de N.gaditana, (B) par

l’acide ascorbique et le BHT. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ±

écart-type (n = 3).…………………………………………………………………………

72

Figure 32 : Viabilité de la ligné cellulaire A549 mise en culture avec les extraits de

N.gaditana pendant 72h. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ± écart-

type (n = 3). ………………………………………………………………………………

75

Figure 33 : Résultat de la séparation de l’extrait acétonique de N.gaditana sur plaque

CCM…………………………………………………………………………………….…

78

Figure 34 : Spectres infrarouge type ATR dans le moyen infrarouge (2,5 à 25 μm soit

4000-500 cm-1) des bandes n°1, 3, 5, 6, 7 et 9 obtenues à partir de la CCM de l’extrait

acétonique de N.gaditana…………………….……………………………………………

80

Figure 35 : Chromatogramme de l’extrait acétonique de Nannochloropsis gaditana, à

290nm (Channel 1) et 435 nm (Channel 2) en mode analytique………………………….

84

Figure 36 : Cycle des xanthophylles chez les Chlorophyceae………………………….... 85

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Molécules marines anticancéreuses identifiées et caractérisées entre 1998-

2006………………………………………………………………………………………..

40

Tableau 2: Quelques exemples d’anticancéreux marins et leurs mécanismes d’action…. 42

Tableau 3 : Diversité des microalgues marines et dulçaquicoles……………………..…. 45

Tableau 4: Proportions relatives des principaux pigments par cellule exprimées en (ng

[106 cellules]-1) chez trois espèces de Nannochloropsis après 10 et 20 jours de culture

47

Tableau 5 : Colonnes et Gradients de solvants utilisés en HPLC analytique……………. 63

Tableau 6: Données concernant la concentration, la masse et le rendement d’extraction

des cinq extraits de N.gaditana……………………………………………………..……..

65

Tableau 7: La teneur en composés phénoliques dans les extraits de N.gaditana. Chaque

valeur est exprimée sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3)……………………..….

67

Tableau 8: Valeurs des EC50 en mg.ml-1 des extraits de N.gaditana pour le piégeage du

radical DPPH…………………………………………………………...……………….…

70

Tableau 9: Valeurs des EC50 en mg.ml-1 des extraits de N.gaditana pour la reduction du

fer………………………………………………………………………..………………...

73

Tableau 10: Valeurs des IC50 (mg.ml-1) des extraits de N.gaditana pour le test MTT….. 75

Tableau 11 : Identification des pigments présents dans l’extrait acétonique de

Nannochloropsis gaditana selon le rapport frontal par comparaison aux résultats

d’analyse par CCM des pigments de microalgues selon Jeffrey (1981) et Jeffrey et coll.

(1997)……………………………………………………………………………….……..

79

Tableau 12 : Table des nombres d’onde des vibrations de référence et ceux obtenus par

analyse infrarouge de l’extrait acétonique de N.gaditana…………………………..……..

83


Nannochloropsis gaditana selon le temps de rétention par comparaison aux résultats

d’analyse par HPLC des pigments de microalgues selon Jeffrey et coll. (1997)………….

84

Tableau 14: Pigments de N. gaditana identifiés par CCM et HPLC……………….……. 86

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION GÉNÉRALE………………………………….... 1

CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE…………………... 5

Section 1 : Le cancer………………………………………………………….... 6

I. I. DEFINITION DU CANCER……………………………………………………………… 6

II. II. NOMENCLATURE DES CANCERS…………………………………………………… 6

III. III. BIOLOGIE DU CANCER………………………………………………………………. 7

IV. IV. GENESE DES CELLULES CANCEREUSES………………………………………… 9

IV.1. Inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs………………………………………… 10

IV.2. Activation de proto-oncogènes………………………………………………………….. 10

IV.3. Défaut d’apoptose et tumorogenèse……………………………………………………... 11

IV.4.Accumulation des altérations génétiques……………………………………………….... 11

V. LES DIFFERENTS TRAITEMENTS DU CANCER …………………………….……. 12

V. 1. Les traitements locorégionaux …………………………………………………….…….. 12

V. 1.1. La chirurgie…………………………………………………………….….…… 12

V. 1.2. La radiothérapie ……………………………………………………….….…… 13

V.1.3. La photothérapie dynamique des tumeurs…………………………….….……. 13

V. 2. Les traitements systémiques ………………………………………………………….…. 14

V. 2.1. L’hormonothérapie…………………………………………………….….….…. 14

V. 2.2. L’immunothérapie. …………………………………………………….….….… 14

V. 2.3. La chimiothérapie...…………………………………………………….…….… 15

VI. LES CIBLES PHARMACOLOGIQUES DES AGENTS ANTICANCEREUX……. 15

VII. LES DIFFERENTES CLASSES D’AGENTS ANTICANCEREUX……………….. 16

VII.1. Les molécules cytotoxiques……………………………………………………………. 16

VII.1.1. Les molécules interagissant avec l’ADN……………………………………… 16

VII.1.2. Principes actifs interférant avec la tubuline et les microtubules……………… 17

VII.2. Les thérapies ciblées……………………………………………………………….……. 17

VII.2.1. Régulation des voies de signalisation………………………………………….. 17

VII.2.2. Régulation du cycle cellulaire…………………………………………….……. 18

VII.2.3. Molécules angiostatiques………………………………………………………. 18

VII.2.4. Induction de l’apoptose ………………………………………………...…..…. 19

VIII. IMPORTANCE DES PRODUITS NATURELS DANS LES TRAITEMENTS DU

CANCER………………………………………………………………………………………

20

VIII.1. Les anticancéreux issus de plantes…………………………………………………….. 20

VIII.2. Les anticancéreux issus de microorganismes………………………………….….…… 21

VIII.3. Les anticancéreux issus de microalgues……………………………………………….. 23

Section 2 : Antioxydants naturels et cancer……………………....………..…

24

I. LES RADICAUX LIBRES ET LE STRESS OXYDATIF…………………….…….... 24

I.1. Les radicaux libres………………………………………………………………………… 24

I.1.1. Production endogène………………………………………………………..…….… 25

I.1.2. Production exogène………………………………………………………..……….. 25

I.2. Le Stress oxydatif…………………………………………………………………………. 26

I.2.1. Définition du stress oxydatif……………………………………………….….…… 26

I.2.2. Implications pathologiques du stress oxydatif………………………………...…… 27

II. LES ANTIOXYDANTS..……………………………………………………………….… 28

II.1. Définition d’un antioxydant………………………………………………………………. 28

II.2. Mode d’action des antioxydants………………………………………………………..… 28

II.3. Les différentes classes d’antioxydants……………………………………………..…….. 29

II.3.1. Les antioxydants endogènes……………………………………………………… 29

II.3.2. Les antioxydants exogènes…………………………………………………….…. 30

III. LES ANTIOXYDANTS NATURELS POUR LA PREVENTION DU CANCER…… 35

IV. ANTIOXYDANTS ET PRO-OXYDANTS………………………………………......… 36

Section 3 : Biodiversité, chimiodiversité et pharmacodiversité du monde

marin …………………………………………………………………………...

39

I. LES PREMIERES DECOUVERTES EN PHARMACOLOGIE MARINE…………... 39

II.CHIMIODIVERSITE ET ORIGINALITE STRUCTURALE DES MOLECULES

ISSUES DU MONDE MARIN…………………………………………………………….....

41

III. POTENTIEL DES MICROALGUES MARINES……………………………………... 43

III.1. Les microalgues………………………………………………………………………… 43

III.2. Biodiversité des microalgues marines…………………………………………………… 44

III.3. La microalgue Nannochloropsis gaditana…………………….………………………… 46

III.4. Effets anticancéreux de microalgues.……………………………………………………. 48

III.4.1. Etudes menées sur les molécules naturelles antiprolifératives issues de

microalgues marines…………………………………………………………….……….

48

III.4.2. Activités anticancéreuses de pigments de microalgues…………………………. 50

IV.LES MICROALGUES, UNE ALTERNATIVE EN CONFORMITE AU

EXIGENCE DE LA RECHERCHE…………………………………………………………

51

CHAPITRE II : MATÉRIEL & MÉTHODES……………..……...

52

I. Préparation des extraits de Nannochloropsis gaditana……………………………..…… 53

I.1. Calcul du rendement d’extraction…………………………………………………....…... 53

II. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits de N.gaditana……………….……... 54

II.1.Dosage des phénols totaux…………………………………………………………..…... 54

II.1.1.Principe……………………..…………………………………………………………… 54

II. 1.2.Démarche expérimentale………………………………………………………..……… 54

II.2. Test de piégeage du radical libre DPPH•………………………………………..…….. 55

II. 2.1. Principe………….……………………………………………………………………... 55

II.2.2. Démarche expérimentale……………………………………………………….………. 55

II. 2.3. Expression des résultats……………………………………………………….……… 56

II.3. Test de la réduction du fer………………..………………………………….….……… 56

II.3.1. Principe……………………………………………………………………….….……... 56

II.3.2. Démarche expérimentale…………………………………………………………….…. 56

II.3.3. Expression des résultats………………………………………………………….…….. 57

III. Evaluation de l’activité antiproliférative des extraits des Nannochloropsis gaditana 57

III.1.Principe du test MTT……………………...……………………………….…….………. 57

III.2. La lignée A549……………………………………………………………...…………… 58

III.3. Culture et entretien de la lignée cellulaire……………………………………..…….…... 58

III.4. Protocole d’évaluation de l’activité antiproliférative des extraits……………………… 59

III.5. Expression des résultats et détermination des CI50……………………………………… 60

IV. Analyses statistiques……………………………………………………………………... 60

V. Caractérisation de l’extrait à activité antiproliférative…………………………...……. 61

V.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)………………..…………………………. 61

V.1.1.Démarche expérimentale ………………………………………………..……………... 61

V.1.2.Calcul du rapport frontal (Rf)…………………………………………………..……… 61

V.2. Analyse par spectrométrie infrarouge………………………………………….….…... 62

V.2.1. Principe……………………………………………………………………................... 62

V.2.2. Démarche expérimentale…………………...………………………………………….. 62

V.3. Analyses par HPLC analytique………………….………….………………………...... 62

V.3.1. Démarche expérimentale……………………………...………………………………... 63

CHAPITRE III : RÉSULTATS & DISCUSSION………………..

64

I. Rendement d’extraction…………………………………………………………………... 65

II. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits de Nannochloropsis gaditana……... 66

II.1.Dosage des phénols totaux…………………………………………………...................... 66

II.2. Test de piégeage du radical libre DPPH•…………………………………………………. 68

II.3. Test de la réduction du fer…………………………………………………....................... 71

III. Evaluation de l’activité antiproliférative des extraits des Nannochloropsis gaditana.. 74

IV. Caractérisation de l’extrait à activité antiproliférative………………………………... 77

IV.1. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)………………………………. 78

IV.2. Analyse par spectrométrie infrarouge………………………………………………...… 79

IV.3. Analyse par HPLC analytique………………………………………………………..… 84

CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES……………... 87

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES…………………………... 90

ANNEXES…………………………………………………………… 112

Introduction Générale

1

INTRODUCTION GÉNÉRALE


2

Les cancers figurent parmi les principales causes de mortalité dans le monde. Selon l’OMS,

en 2012 environ 14 millions de nouveaux cas et 8,2 millions de décès liés au cancer ont été

enregistrés. D’ici à 2030, le nombre de décès par cancer devrait poursuivre sa progression et

atteindre 12 millions de personnes.

Le Centre Pierre et Marie Curie (CPMC) d’Alger, révèle en 2014 qu’environ 45.000

nouveaux cas de cancer sont enregistrés chaque année en Algérie. Le cancer représenterait

21% des causes de mortalité en Algérie (OMS, 2014).

Bien que l’incidence du cancer soit en augmentation dans la plupart des régions du monde,

celle-ci demeure plus élevée dans les régions les plus développées, mais la mortalité est

relativement plus élevée dans les pays en développement, faute de détection précoce et

d’accès aux traitements. Environ 70 % des décès par cancer surviennent désormais dans les

pays en développement (OMS, 2014). La découverte de nouveaux traitements anticancéreux

toujours plus efficaces et spécifiques, est donc aujourd’hui primordiale.

On estime que deux tiers des médicaments actuels ont une origine naturelle, obtenus par

hémisynthèse, à partir d’un pharmacophore ou par modification d’un produit naturel

(Newmann et coll., 2007). Seul un tiers des médicaments commercialisés possède donc une

origine purement synthétique. Le milieu naturel a ainsi toujours été une source très importante

de molécules à activité biologique et 60% des anticancéreux utilisés à l’heure actuelle ont

pour origine un produit naturel (Pasquet, 2011).

Par ailleurs, les substances marines ayant une activité biologique potentiellement intéressante

seraient au moins 100 fois plus nombreuses que celle des organismes terrestres (Moreau,

2006). Le monde marin est en effet un écosystème présentant la plus grande diversité, avec de

nombreux organismes sans équivalent terrestre (Martins, 2014), offrant ainsi un domaine de

recherche inépuisable.

L’exploration de cet environnement durant les 50 dernières années a de ce fait abouti à

l’isolement d’environ 20.000 composants d’origine marine (Mayer & Glaser, 2013) avec des

structures chimiques peu courantes (Merour, 2004). Rien qu’en 2012, 1241 nouvelles

molécules ont été identifiés (Blunt, 2014). Une grande majorité de ces substances présente

une activité anti-tumorale.


3

Eu égards à la chimiodiversité et la pharmacodiversité du monde marin, nous avons axé notre

étude sur la recherche de nouvelles molécules d’origine marine capables d’inhiber la

prolifération de cellules cancéreuses.

Notre attention s’est ainsi orientée au cours de cette thèse, sur des organismes

particulièrement intéressants du fait de leur importante production biochimique encore peu

étudiée. En effet, les microalgues marines sont des microorganismes unicellulaires qui ont

conquis une grande diversité de milieux par le développement d’un grand nombre de voies

métaboliques, sources potentielles de structures chimiques originales. Un autre atout justifiant

le choix de ces organismes, est la facilité d’accès à une quantité importante de biomasse, de

qualité constante, sans atteinte à l’environnement, condition Sine qua non pour toute étude

pharmacochimique. De telles caractéristiques rendent les microalgues particulièrement

attractives pour la recherche de nouvelles molécules anticancéreuses.

L’étude qui est présentée dans cette thèse a pour but d’identifier des molécules issues de la

microalgue marine Nannochloropsis gaditana ayant un effet antiprolifératif sur des cellules

cancéreuses. Le choix de cette espèce s’est basé sur quelques critères :

§ La disponibilité de la souche isolée, cultivée en milieu artificiel en conditions

contrôlées.

§ La diversité de la composition pigmentaire de cette microalgue, sachant que chez les

microalgues, les pigments sont généralement les molécules les plus actives sur les

cellules cancéreuses.

§ Cette espèce ne présente pas de productions toxiniques connues, pouvant induire des

faux positifs lors de la réalisation des tests de cytotoxicité.

§ Peu d’études sur les vertus thérapeutiques de cette souche ont été réalisées à ce jour,

ce qui nous évite une redondance des travaux et conduit à une originalité des résultats.

Notre étude s’articule ainsi autour de deux axes. Le premier vise à mettre en évidence

l’activité antioxydante de cinq extraits de N.gaditana, afin d’évaluer l’impacte des molécules

antioxydantes sur l’activité antiproliférative de l’extrait. Le second axe est consacré à l’étude

de l’effet anticancéreux de ces cinq extraits afin de mettre en évidence l’effet des extraits de

N.gaditana sur la croissance de cellules cancéreuses.

Cinq extraits de type acétonique, méthanolique, dichlorométhanique, hexanique et

aqueux issus de N.gaditana sont ainsi préparés. Ces extraits ont fait l’objet d’un

dosage des phénols et d’une évaluation de l’activité antioxydante par deux


4

méthodes : le test de piégeage du radical libre DPPH• (1,1-diphényl-2-

picrylhydrazyl) et le test de la réduction du fer.

Nous avons par la suite entrepris une étape d’évaluation de l’activité antiproliférative des

extraits de N.gaditana sur une lignée du cancer bronchopulmonaire non à petites cellules ; la

lignée A549, par le test MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

Enfin, une caractérisation de l’extrait présentant le meilleur effet sur les cellules cancéreuses

est réalisée par les différentes techniques de chimie analytique : chromatographie sur couche

mince (CCM), spectrométrie par infrarouge et chromatographie liquide à haute performance

(HPLC), et ce dans le but d’identifier d’éventuelles molécules thérapeutiques susceptibles

d’engendrer un arrêt de la prolifération de cellules cancéreuses.

Chapitre I Etude Bibliographique

5

CHAPITRE I :

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE


6

Section 1 : Le cancer

Le terme cancer dérive du grec karkinos qui signifie crabe ou pinces, le mot latin cancer

désigne le crabe ou l’écrevisse. C'est Hippocrate (460-377 avant J-C) qui, le premier, compare

le cancer à un crabe par analogie à l'aspect des tumeurs du sein avec cet animal lorsqu'elles

s'étendent à la peau. Le mot cancer prend à la fin du XVème siècle le sens de tumeur maligne

(on trouve aussi cancre ou chancre). Ce rapprochement est justifié, par Galien (131-201), par

Henri de Mondeville puis par Ambroise Paré (1509-1590), par l'aspect d'une tumeur qui

présente une masse centrale d'où rayonnent des veines gonflées ou des ramifications, par

l'adhérence de la tumeur qui s'accroche aux tissus voisins comme avec des pinces. L’adjectif

« cancéreux » est utilisé dès le milieu du XVIIIème siècle, avant de d’employer

« anticancéreux » comme nom (1845). A partir de 1920, cancer est à l'origine de nombreux

mots : cancérologie, cancérologue, cancérigène puis cancérogène, cancérophobie....

I. DEFINITION DU CANCER

Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d'un

tissu normal de l'organisme. Ces cellules dérivent toutes d'un même clone, la cellule initiatrice

du cancer qui a acquis certaines caractéristiques lui permettant de se diviser indéfiniment et de

former des métastases. Les nouvelles cellules résultantes peuvent former une tumeur maligne

(un néoplasme) ou se propager à travers le corps et conduire à terme à une extension

progressive de la tumeur par l’intermédiaire de métastases (Moreau, 2006).

II. NOMENCLATURE DES CANCERS

La nomenclature des tumeurs suit une terminologie précise (Stevens & Lowe, 1997). Un nom

de tumeur se compose généralement d’une racine et d’un suffixe, et peut être associé à un

adjectif.

La racine définit le tissu d’origine de la tumeur (adéno désigne une tumeur glandulaire,

rhabdomyo une tumeur musculaire striée, leiomyo une tumeur musculaire lisse).

Le suffixe définit le type de prolifération :

§ ome définit les tumeurs bénignes (adénome, rhabdomyome, leiomyome). Il existe

cependant des exceptions (ex : les lymphomes et les mélanomes sont des tumeurs

malignes) ;


7

§ matose désigne la présence de tumeurs multiples ou diffuses (angiomatose,

leiomyomatose, adénomatose) ;

§ carcinome désigne une tumeur maligne qui se développe à partir d’un épithélium

comme l’œsophage, le col utérin, le poumon, le sein, la prostate, le colon,… (ex :

adénocarcinome) ;

§ sarcome désigne une tumeur maligne proliférant dans des tissus conjonctifs comme

les os ou les tissus mous (muscles, graisse), ou encore des tumeurs au niveau du

système nerveux central (ex : rhabdomyosarcome) ;

§ blastome désigne une tumeur embryonnaire (ex : néphroblastome ou neuroblastome).

III. BIOLOGIE DU CANCER

Le cancer résulte de six altérations de la physiologie cellulaire (Hanahan & Weinberg,

2000). Ces altérations sont communes à toutes les cellules cancéreuses et sont à l’origine de

leur prolifération incontrôlée.

La division cellulaire est induite par certains signaux (facteurs de croissance). Contrairement

aux cellules normales, les cellules cancéreuses acquièrent la capacité à produire elles-mêmes

leurs propres signaux de croissance cellulaire et d’y être sensibles. Cette capacité

s’accompagne de l’apparition d’une insensibilité aux différents signaux antiprolifératifs. Par

ailleurs, l’apoptose, qui est l’un des moyens de destruction des cellules ne pouvant achever un

cycle cellulaire normal, est absente. Les cellules cancéreuses acquièrent également la capacité

à se diviser à l’infini et à activer l’angiogenèse des capillaires sanguins à proximité. Enfin, la

tumeur primaire envahit les tissus adjacents et dissémine des cellules pionnières dans

l’organisme qui fonderont des tumeurs secondaires (métastases). Ces tumeurs distantes sont la

cause de 90% des décès dans les cancers (Hanahan & Weinberg, 2000). Ces différentes

altérations physiologiques sont représentées sur la figure 1.


8

Figure 1 : Les six altérations physiologiques de la cellule conduisant à la formation de cellules cancéreuses (Hanahan & Weinberg, 2000).

La figure 2 représente l’ordre d’apparition des différentes caractéristiques de la cellule

tumorale : autosuffisance en facteurs de croissance, insensibilité aux signaux antiprolifératifs,

disparition du phénomène d’apoptose, apparition d’un potentiel de division cellulaire infini,

induction de l’angiogenèse et capacité à former des métastases. Dans les différentes

chronologies représentées (variables selon les types de cancers), la capacité à métastaser est

souvent l’une des dernières caractéristiques acquises.


9

Figure 2 : Ordre d’apparition des différentes altérations physiologiques de la cellule conduisant à la formation de cellules cancéreuses (Hanahan & Weinberg, 2000). A : Différentes caractéristiques du cancer. B : Chronologies d’apparition des

caractéristiques de la cellule cancéreuse.

IV. GENESE DES CELLULES CANCEREUSES

Dans l’organisme il y a sans cesse un renouvellement cellulaire assuré par la naissance et la

mort de cellules qui forment un état dynamique dit « homéostasie ». La capacité de se diviser,

de se spécialiser mais aussi de mourir est inscrite dans le génome de chacune des cellules qui

composent l'organisme humain. Le déclenchement et l'arrêt de la prolifération cellulaire,

l'entrée dans un processus de différenciation ou dans un programme de mort cellulaire

(apoptose) résultent de l'intégration au niveau cellulaire de multiples signaux, les uns positifs,

les autres négatifs (Vaux, 1999). Cependant ces systèmes de régulation permettant un

maintient de l’homéostasie sont parfois, comme c’est le cas pour les cancers, déficients ou

"débordés".


10

En effet, suite à l’agression de facteurs de l'environnement, que ce soit des agents chimiques

(tabac, amiante, arsenic, cadmium,...) (Miller & Miller, 1975) ou physiques tels que les

rayons ionisants (UVB) (Hall & Angele, 1999), certains virus tel que le HPV (papillomavirus

humain ; responsable du cancer du col de l’utérus) , ou spontanément (Lindahl & Nyberg,

1972), le génome humain subit des lésions qui sont réparées (Frosina, 2000) ou non.

La cellule conserve alors certaines altérations qui touchent parfois les systèmes de régulation

de la prolifération. Ne répondant plus correctement aux signaux environnants, elle échappe à

toute régulation. La cellule s'engage alors dans un processus anarchique qui conduit, par

accumulation successive d'anomalies génétiques, au développement d'une cellule cancéreuse.

Plusieurs types d’inducteurs et de nombreuses étapes sont en cause dans la cancérisation

d’une cellule saine (Yokota et coll., 2000).

IV. 1. Inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs

Actuellement, plus de vingt gènes suppresseurs de tumeurs sont connus. Certains codent pour

des facteurs de transcription comme p53 et WTI, d’autres pour des régulateurs du cycle

cellulaires comme RB et p16. La plupart des protéines codées par les gènes suppresseurs de

tumeurs fonctionnent comme des régulateurs négatifs de la prolifération cellulaire (Karp,

2010). La mutation la plus rencontrée dans les cancers humains, est celle du gène qui code

pour la protéine p53 (50% des cancers). Elle est directement impliquée dans le processus de

réparation de l’ADN et dans le phénomène d’apoptose. Une protéine p53 non fonctionnelle

conduit à l’accumulation d’erreurs dans le génome pouvant amener à l’apparition d’une

cellule cancéreuse (Yokota, 2000).

IV.2. Activation de proto-oncogènes

Les cellules cancéreuses prolifèrent de manière incontrôlée. Cette propriété est liée à

l’activation constitutive d’oncogènes cellulaires. A l’état physiologique, ces gènes se trouvent

sous forme de « proto-oncogènes ». Ils sont impliqués dans les processus de croissance et de

différenciation tissulaire. Ils sont induits en oncogènes par transformation virale, par

mutation, par amplification ou translocation/dérépression génique (phénomène de levée des

mécanismes qui répriment la transcription). Les oncogènes peuvent conférer aux cellules

cancéreuses leur autonomie de croissance. Ils interviennent également dans la différenciation

cellulaire et génèrent des erreurs dans les programmes de maturation cellulaire. L’oncogène

muté le plus fréquemment retrouvé dans les tumeurs humaines est Ras. Il code pour une


11

protéine de fixation au GTP (Ras) régulatrice dans une des voies de contrôle de la

prolifération cellulaire (Yokota, 2000; Lechat, 2006; Karp, 2010).

IV.3. Défaut d’apoptose et tumorogenèse

Le processus par lequel une cellule normale devient une cellule maligne ayant la capacité de

former une tumeur requiert plusieurs dérèglements de la machinerie cellulaire. La disparition

du phénomène d’apoptose (mort cellulaire programmée) est l’un de ces dérèglements. La mort

cellulaire programmée fait partie intégrante de la physiologie normale d'un organisme. Un

dérèglement peut être à l'origine de nombreuses pathologies. La disparition de ce phénomène

est l’une des raisons qui explique la survenue d’un cancer. Il existe d’autres types de mort

cellulaire, comme la nécrose, la sénescence ou encore l’autophagie qui ne compensent qu’en

partie la disparition du phénomène d’apoptose chez les cellules tumorales. Par conséquent, de

nombreuses recherches se focalisent sur les voies cellulaires qui régissent ce phénomène afin

que l’apoptose puisse être restaurée chez les cellules cancéreuses (De Bruin & Medema,

2008).

IV.4. Accumulation des altérations génétiques

L'apparition d'un cancer s'effectue selon un processus en plusieurs étapes au cours desquelles

l'accumulation d'anomalies sur différents gènes, au fil des divisions cellulaires conduit à

l’apparition de nouveaux clones. Certains de ces clones acquièrent la capacité à métastaser et

à former des tumeurs secondaires (Yokota, 2000) (figure 3). Les cellules, toutes issues d'une

première cellule mutée (clone), forment une tumeur. Celle-ci devient de plus en plus agressive

pour son environnement et échappe progressivement à tout contrôle. Les cellules ayant

accumulées le plus d’altérations génétiques seront donc retrouvées dans les tumeurs

secondaires. La figure 3 montre que les métastases se forment à la fin du processus de

cancérogénèse.

Figure 3 : Les différentes étapes de la progression tumorale, en association avec les

altérations génétiques des cellules (Yokota, 2000).


12

L’accumulation des altérations génétiques conduit à l’apparition d’une lésion précancéreuse.

Celle-ci s’engage dans un processus qui abouti à une propagation de cellules métastasiques.

La progression tumorale implique ainsi quatre phases principales pour passer de la lésion

précancéreuse à des cellules métastasiques:

§ La 1ère phase : l’initiation, première étape vers la cellule cancéreuse

L’initiation est due aux premières mutations génétiques irréversibles de la cellule qui vont se

transmettre aux cellules filles du fait d’une lésion définitive de l’ADN. En général, les

mécanismes de réparation de l’ADN interviennent pour empêcher la transmission d’un

matériel génétique altéré. Au moment de l’initiation, ces mécanismes sont inopérants car

altérés. Il apparait alors les cellules initiées qui ne sont pas encore des cellules tumorales.

Elles n’ont pas acquis une autonomie de croissance. Il est tout de même possible de les

distinguer morphologiquement des autres cellules non initiées.

§ La 2ème phase : La promotion

C’est l’expansion clonale de cellules initiées qui manifestent en générale un taux de

croissance accrue. La prolifération de telles cellules va faciliter l’apparition de mutation

supplémentaire directement proportionnelle aux taux de division et accélère la conversion.

§ La 3ème phase : La conversion

Est l’étape qui provoque la transformation proprement dite de cellules pré-néoplasiques en

cellules malignes : elle résulte de mutations complémentaires.

§ La 4ème phase : La progression

Elle permet d’augmenter l’agressivité des cellules déjà transformées et leur confère la

capacité à métastaser (Yokota et coll., 2000).

V. LES DIFFERENTS TRAITEMENTS DU CANCER

Pour traiter les cancers, il existe deux grands types de traitements. Les traitements

locorégionaux qui agissent directement sur la tumeur, et les traitements systémiques qui ne

sont pas ciblés. Les différents traitements sont généralement couplés.

V.1. Les traitements locorégionaux

V.1.1. La chirurgie

La chirurgie a été le premier traitement utilisé pour lutter contre le cancer, notamment pour

traiter les petites tumeurs localisées ou les tumeurs solides à développement lent qui

représentent 70% des cancers.


13

Elle consiste en l’ablation de la tumeur et est souvent associée à d'autres thérapies telles que la

chimiothérapie, la radiothérapie ou l'hormonothérapie. Ce traitement est le seul moyen de

traiter les zones peu vascularisées où la chimiothérapie n’accède pas.

Toutefois, elle ne garantit pas l’élimination des extensions microscopiques toujours associées

au cancer. De plus cette approche ne peut traiter un cancer qui a émis des métastases dans

l’ensemble du corps, ni un cancer ayant atteint un organe vital. Plus de la moitié des cancers

étant diagnostiqués au stade de métastase, la détection précoce de la maladie reste un pré

requis pour une chirurgie efficace (Hellman & Vokes, 1996).

V.1.2.La radiothérapie

L’alternative à la chirurgie, lorsque l’organe atteint doit être préservé, est la radiothérapie. La

radiothérapie agit localement sur la région irradiée. Tous les types de radiothérapie sont basés

sur l’ionisation. Les particules émises (électrons, photons X ou γ, protons) interagissent avec

l’eau des cellules pour former des espèces réactives de l’oxygène (ERO), provoquant la

destruction des cellules adjacentes. Il existe différents types de radiothérapie :

- La radiothérapie transcutanée : ce traitement est basé sur un générateur de rayonnement qui

se situe en dehors du corps. Les faisceaux de radiations émis par ce générateur traitent la

tumeur.

-L'irradiation interstitielle ou curiethérapie : cette technique consiste à implanter

temporairement dans la tumeur ou à proximité des sources radioactives.

- La radiothérapie métabolique : cette méthode repose sur l’utilisation de molécules à pouvoir

ionisant se fixant sélectivement sur la tumeur. La molécule est injectée dans l'organisme.

Mais la technique présente aussi des limites : comme la chirurgie, elle n’éradique pas toutes

les cellules cancéreuses, et ne peut traiter toutes les métastases disséminées (Hellman &

Vokes, 1996).

V.1.3 La photothérapie dynamique des tumeurs

La photothérapie dynamique repose sur l’utilisation combinée d’une substance

photosensibilisante et d’une irradiation lumineuse appropriée (LASER) qui pénètre bien les

tissus. La substance photosensibilisante est destinée à se concentrer le plus sélectivement

possible dans les tissus à traiter. L’irradiation déclenche la photooxydation du

photosensibilisant, ce qui va provoquer un stress oxydatif (production localisée de ERO) et

entraîner la mort cellulaire (Chaleix, 2003; Gachard-Bouty, 2003) (Figure 4). La substance

photosensibilisante peut être administrée soit par voie intraveineuse soit par voie topique


14

(Detty et coll., 2004). La plupart des molécules utilisées en photothérapie des tumeurs sont

des dérivés de porphyrines tels que le porfimère sodique ou des chlorines, des

bactériochlorines, ou des téxaphyrines.

Figure 4 : Représentation du principe de la photothérapie dynamique des tumeurs PDT (Gachard-Bouty, 2003).

V.2 Les traitements systémiques

V.2.1.L’hormonothérapie

L'hormonothérapie est utilisée pour lutter contre les cancers dont le développement est

dépendant d’hormones. Ce traitement est particulièrement efficace dans les cancers du sein et

de la prostate. Il inclut des médicaments dont l'action consiste à stopper la production de

certaines hormones et à modifier leur fonctionnement (Heron, 2003).

V.2.2.L’immunothérapie

L’approche immunothérapeutique est basée sur la modification et l’exploitation des

mécanismes cellulaires de défense de l’hôte ou sur le contrôle de la régulation de la

prolifération et de la différenciation des cellules du système immunitaire.

L’immunothérapie passive est une méthode qui utilise des anticorps comme agents

thérapeutiques. Ces anticorps reconnaissent et s’unissent à des protéines spécifiques à la

surface des cellules tumorales. Après sa fixation, l’anticorps dirige une attaque contre la

cellule en mobilisant d’autres éléments du système immunitaire. Actuellement, une vingtaine

d’anticorps monoclonaux a été approuvée pour le traitement du cancer et d’autres maladies.

L’herceptine est un anticorps humanisé dirigé contre un récepteur de la surface cellulaire

Her2. Il fixe le facteur de croissance Her2 favorisant la prolifération des cellules du cancer du

sein surexprimé dans 25% de ces cancers (Karp, 2010).


15

Une approche active fait appel à l’usage des modulateurs de l’immunité comme les cytokines

avec notamment les interférons (IFN), les interleukines (IL) et les TNF(Tumor Necrosis

Factor) qui jouent un rôle important dans le développement de la réponse immunitaire

(Bernades-Genisson et coll., 2003).

V.2.3 La chimiothérapie

La chimiothérapie isolée n’est indiquée que dans de très rares cas. Dans la plupart des cas une

combinaison de deux ou de trois approches est nécessaire (Lechat, 2006). Lorsque le cancer

prolifère et crée des tumeurs secondaires, les traitements locaux tels que la radiothérapie et la

chirurgie ne sont plus adaptés. La chimiothérapie est utilisée afin de soigner un cancer en

bloquant la prolifération cellulaire, en réduisant la taille de la tumeur, et en prévenant la

formation des tumeurs secondaires.

VI. LES CIBLES PHARMACOLOGIQUES DES AGENTS ANTICANCEREUX

Le but des agents anticancéreux est d’atteindre les cellules tumorales afin de les détruire, par

interaction avec une ou plusieurs cibles pharmacologiques (figure 5) (Bernades-Genisson et

coll., 2003).

Figure 5 : Les cibles des agents antitumoraux (Bernades-Genisson et coll., 2003).


16

Une des principales cibles des traitements anticancéreux est l’ADN. Il a un rôle capital dans la

vie de la cellule. Les molécules anticancéreuses peuvent interagir avec l’ADN de trois

manières différentes (Bernades-Genisson et coll., 2003):

§ Par liaison à l’ADN (agents alkylants).

§ En interagissant avec les systèmes de réparation de l’ADN (intercalants, inhibiteurs de

topo-isomérases).

§ En bloquant la biosynthèse des constituants de l’ADN (antimétabolites).

Les autres anticancéreux sont des molécules qui perturbent le fuseau mitotique, et empêchent

la division cellulaire. Enfin d’autres approches sont développées (Bernades-Genisson et

coll., 2003) comme celles qui:

§ Restaurent le phénomène d’apoptose.

§ Restaurent les systèmes de contrôle du cycle cellulaire.

§ Inhibent l’angiogénèse.

§ Interviennent dans les voies de signalisation cellulaire.

VII. LES DIFFERENTES CLASSES D’AGENTS ANTICANCEREUX

VII.1. Les molécules cytotoxiques

VII.1.1. Les molécules interagissant avec l’ADN

A. Les agents alkylants

L’effet cytotoxique agents alkylants tels que les aziridines, les triazènes, ou la mitomycine C,

est lié en grande partie à l’alkylation des bases puriques et pyrimidiques de l’ADN. Les agents

alkylants interviennent essentiellement au moment de la réplication de l’ADN (phase S)

quand les deux brins sont séparés et exposent ainsi les sites d’intérêt à l’action alkylante

(Bernades-Genisson et coll., 2003).

B. Agents inhibiteurs de topoisomérases

Leur rôle est de maîtriser les phénomènes de sous et surenroulement du matériel nucléique en

induisant ou stabilisant les coupures de l’ADN. Les molécules agissant sur les topo-

isomérases sont classées en deux groupes (Bernades-Genisson et coll., 2003) :

§ Celles qui sont actives sur les topo-isomérases I comme la camptothécine et ses dérivés

§ Celles qui sont actives sur les topo-isomérases II comme le mitoxantrone, le bisantrène

ou les bléomycines.


17

C. Les antimétabolites

Les antimétabolites sont des molécules qui interfèrent dans la synthèse des acides nucléiques

par l’un (ou les deux) des mécanismes suivants (Bernades-Genisson et coll., 2003) :

§ Par inhibition de la biosynthèse des nucléotides et des acides nucléiques.

§ Par incorporation dans les acides nucléiques.

Parmi ces antimétabolites on retrouvele fluorouracile, la cytarabine ou la mercaptopurine.

VII.1.2. Principes actifs interférant avec la tubuline et les microtubules

Les antimitotiques sont des composés qui bloquent la mitose et conduisent à l’apoptose des

cellules traitées. Leur action s’exerce essentiellement sur la formation et la fonctionnalité du

fuseau mitotique constitué par l’auto-assemblage de la tubuline. Les différentes molécules

intervenant sur la formation du fuseau mitotique peuvent être classées en fonction de leur

mécanisme d’action en deux groupes (Bernades-Genisson et coll., 2003) :

§ Les inhibiteurs de la polymérisation de la tubuline empêchent la formation du fuseau

mitotique. Parmi ces inhibiteurs, sont retrouvés les vinca-alcaloïdes, la colchicine et ses

dérivés.

§ Les inhibiteurs de la dépolymérisation des microtubules agissent en complexant la

tubuline et se comportent comme des stabilisateurs du fuseau. Les taxoïdes, les diterpènes

tétracycliques, les macrolides.

VII.2. Les thérapies ciblées

Au cours des traitements, la tumeur peut devenir résistante. Plusieurs mécanismes expliquent

ce phénomène, comme la diminution de la concentration intracellulaire du cytotoxique, ou la

mise en place de systèmes de détoxification. La résistance peut être également due à une

altération des cibles des anticancéreux, ou par réparation des dommages causés par les agents

alkylants sur l’ADN (Bernades-Genisson et coll., 2003).

Les efforts de recherches sont donc dirigés vers la mise en évidence de médicaments agissant

plus sélectivement sur le fonctionnement de la cellule tumorale en restaurant l’apoptose, en

régulant le cycle cellulaire ou les différentes voies de signalisation cellulaire.

VII.2.1 Régulation des voies de signalisation

Dans les cellules tumorales, les voies de signalisation sont souvent déséquilibrées par la

surexpression d’une protéine déterminée. Les molécules régulant les voies de signalisation


18

sont pour la plupart des inhibiteurs dirigés vers des enzymes cibles. Parmi ces cibles, il y a

(Bernades-Genisson et coll., 2003) :

§ Les kinases et les phosphatases comme les récepteurs à tyrosine-kinase

transmembranaires, les tyrosines kinases cytoplasmiques et nucléaires.

§ Les sérines thréonine kinases du cycle cellulaire.

§ Les phospholipases.

§ Les protéines kinase C intervenant dans la signalisation intracellulaire.

§ Des reverse-transcriptases comme les télomérases.

§ Les protéases de la matrice extracellulaire impliquées dans l’angiogenèse.

VII.2.2 Régulation du cycle cellulaire

Chaque changement de phase du cycle cellulaire est précédé d’un contrôle sous la dépendance

de kinases (CdK), de protéines activatrices (cyclines) ou inhibitrices (CKI, ou Cdk inhibitors).

Plusieurs stratégies ciblées sur différents événements du cycle cellulaire peuvent conduire à la

mort de la cellule par apoptose ou sénescence. Les inhibiteurs de CdK comme le flavopiridol

font partie de ces stratégies. Les inhibiteurs du protéasome (système impliqué dans le contrôle

général du cycle cellulaire) entraînent la dégradation de l’inhibiteur du facteur nucléaire

kappa B (NF- B) participant à la défense des cellules soumises à une radio ou

chimiothérapie. Les inhibiteurs des histones déacétylases conduisent à l’hyperacétylation des

histones et à la mort cellulaire. La figure 6 représente la structure chimique du flavopiridol

(Karp, 2010).

Figure 6: Structure chimique du flavopiridol (Karp, 2010).

VII.2.3.Molécules angiostatiques

L’angiogénèse résulte d’un équilibre entre des facteurs pro et anti-angiogéniques. Lors de la

tumorogenèse, un phénomène dénommé « switch angiogénique » conduit à la rupture de cet

équilibre. Les facteurs proangiogéniques sont alors surexprimés. Ce processus de

néoangiogénèse tumorale est stimulé par des facteurs de croissance sécrétés dans


19

l’environnement tumoral, en réponse à des stimulations diverses (hypoxie, inactivation de

gènes suppresseurs de tumeur, modifications épigénétiques…). Trois facteurs

proangiogéniques principaux jouent un rôle important dans la progression angiogénique et

représentent des cibles thérapeutiques d’intérêt: le Vascular-Endothelial Growth Factor

(VEGF), le Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) et le Fibroblast Growth Factor (FGF)

(You & Trillet-Lenoir, 2006).

VII.2.4. Induction de l’apoptose

L’apoptose apparaît comme un des mécanismes responsables des effets de toutes

chimiothérapies. Les anomalies des voies apoptotiques favorisent la prolifération des cellules

tumorales. Pour rétablir le phénomène d’apoptose dans les cellules cancéreuses, il existe de

nombreuses cibles moléculaires (Bremer et coll., 2006). Par exemple, l’apoptose peut être

induite par l’utilisation d’anticorps monoclonaux. Les cellules tumorales expriment à leur

surface des molécules différentes de celles retrouvées chez les cellules normales. L’utilisation

d’un anticorps conjugué à une molécule apoptotique est l’une des voies envisageables

(Sievers, 2003).

Dans une autre mesure, l’activation directe de la machinerie apoptotique chez les cellules

cancéreuses est possible en utilisant des formes solubles recombinantes du TNF (Tumor

Necrosis Factor). Le TNF, le FASL (Apoptosis Stimulating Fragment Ligand) et TRAIL

(tumor-necrosis-factor related apoptosis inducing ligand) sont les molécules effectrices

majeures de l’apoptose (Bremer et coll., 2006).

L’inhibition spécifique des protéines anti-apoptotiques comme Bcl-2 et Bcl-xl qui sont

fréquemment surexprimées dans les cancers, est une des voies de recherche pour induire

l’apoptose (Badros et coll., 2005). Par exemple, l’utilisation de l’ABT-737 (figure 7)

provoque l’inhibition de ces protéines avec une forte sélectivité. Cette molécule montre une

régression de la tumeur chez 77% des souris traitées et sans tumeurs secondaires (Oltersdorf

et coll., 2005 ; Fleischer et coll., 2006).


20

Figure 7 : Structure chimique de l’ABT-737 (Oltersdorf et coll., 2005 ; Fleischer et coll., 2006). Enfin, pour restaurer l’apoptose, l’action directe dans le noyau cellulaire par restauration de

l’activité de p53 (Vogelstein et coll., 2000 ; Bykov et coll., 2002) ou par inhibition de

l’induction de HIF-1α (Hypoxia Inducible Factors), impliqué dans l’hypoxie du micro-

environnement tumoral contribuant à la progression de la tumeur, sont également des voies

envisageables (Leek et coll., 2005).

VIII. IMPORTANCE DES PRODUITS NATURELS DANS LES TRAITEMENTS DU

CANCER

Les produits naturels sont directement ou indirectement à l’origine de 60% des traitements

anticancéreux (Pasquet, 2011). Les principales sources de ces molécules anticancéreuses sont

les végétaux supérieurs, les bactéries et les moisissures.

VIII.1. Les anticancéreux issus de plantes

Durant les 40 dernières années, les plantes ont été la plus grande source de métabolites

secondaires avec l’avantage de présenter une grande diversité chimique.

Dans le domaine de la thérapie anticancéreuse, la recherche de substances actives d’origine

végétale a permis la découverte d’une nouvelle classe de molécules, les taxoïdes. Ces

molécules sont représentées par le taxol® (Paclitaxel), et le taxotère® (Docétaxel) (figure 8).

Le taxol, molécule extraite de l’écorce de l’If de Californie Taxus brevifolia, utilisée dans le

traitement du cancer du sein, a été découvert aux États-Unis en 1964 par les docteurs Monroe

Wall et Mansukh Wani. Son mécanisme d’action anti-tumorale, inhibition du désassemblage

des microtubules constituant le faisceau mitotique en tubuline, a été identifié en 1979 par le

docteur Susan Horwitz. Mais son exploitation nécessitait l’abattage des arbres, dont la

croissance est très lente (un arbre centenaire ne fournit qu’un gramme de taxol, soit la moitié

de la quantité nécessaire pour le traitement d’une seule personne pendant un an) (Moreau,

2006). Il fallu donc recourir à l’utilisation du taxol hémisynthétique, fabriqué en laboratoire.


21

Figure 8 : Structure chimique du taxotère® (Docétaxel) (A) (Quetin-Leclercq, 2002) et

du taxol® (Paclitaxel) (B) (Bailly, 2009).

D’autres exemples de médicaments tels que les camptothécines (isolées de Camptotheca

acuminata), les vinca-alcaloïdes (la vinblastine et la vincristine) (isolées de Catharanthus

roseus) et les épipodophyllotoxines (isolées de Podophyllum peltatum) ou leur dérivés

synthétique sont toujours énormément utilisés pour les traitements du cancer (figure 9)

(Nobili et coll., 2009).

Figure 9 : Exemples de la diversité chimique du monde végétal terrestre ; formule

chimique de la camptothécine (A), la vinblastine (B) et de l’étoposide 5

(épipodophyllotoxine) (C) (Nobili et coll., 2009).

VIII.2. Les anticancéreux issus de microorganismes

La romidepsine (FK228) isolée de la bactérie Chromobacterium violaceum est un

depsipeptide inhibiteur des histones déacetylases. Il a montré des activités dans le traitement

des patients souffrant de lymphome (Pasquet, 2011).

L’épothilone (antibiotique de la classe des macrolides) synthétisé par la bactérie Sorangium

cellulosum a été découvert en 1995. L’épothilone montre une activité anticancéreuse in vitro

importante sur les lignées cellulaires résistantes aux taxanes. Plus de 300 analogues de

A


22

l’épothilone furent donc synthétisés conduisant à l’ixabepilone (Ixempra®) (figure 10)

(Bailly, 2009).

Figure 10 : Structure chimique de l’ixabepilone (Ixempra®) (Bailly, 2009).

Cet inhibiteur de microtubules possède le même mécanisme d’action que les taxanes, mais

sans présenter de phénomènes de résistance. En octobre 2007, l’ixabepilone a reçu

l’approbation de la FDA pour le traitement de cancer du sein métastatique ou localement

avancé (Bailly, 2009).

Le temsirolimus (ou CCI-779, Torisel®) est le premier inhibiteur de protéine kinase mTOR

(Mammalian Target Of Rapamycin), cette dernière régule la prolifération cellulaire, la

croissance cellulaire, la mobilité cellulaire, la survie cellulaire, la biosynthèse des protéines et

la transcription. Le temsirolimus a été approuvé par la FDA, en 2007, pour le traitement de

patients avec un cancer rénal avancé. La voie de signalisation mTOr est impliquée dans les

mécanismes de prolifération, de croissance, de survie cellulaire et d’angiogénèse. Il offre donc

un nombre de possibilités importantes en association avec d’autres molécules thérapeutiques

ciblées pour le traitement des tumeurs solides et des lymphômes (Bailly, 2009; Nobili et coll.,

2009). La structure chimique du temsirolimus est présentée sur la figure 11.

Figure 11: Structure chimique du temsirolimus (Torisel®) (Bailly, 2009; Nobili et coll., 2009).


23

Les exemples du temsirolimus et de l’ixabepilone montrent que les produits naturels sont une

source importante pour la mise en évidence de nouvelles molécules anticancéreuses à actions

ciblées.

VIII.3.Les anticancéreux issus de microalgues

Même si les algues marines sont utilisées depuis l'antiquité en médecine traditionnelle au

Japon, en Chine et en Egypte. Ce n’est qu’en 1960 que l’Algasol T331, un extrait de l’algue

brune Undaria pinnatifida (fougère de mer) fut utilisé en Italie pour la première fois pour

traiter le cancer du sein (Claudio & Stendardo 1965). Sur 162 patients traités par injection

intramusculaire d’Algasol T331, 68% répondaient au traitement (Claudio & Stendardo

1965). L’Algasol T331 peut être considéré comme une étape importante dans le

développement de médicaments à base d'algues (Claudio & Stendardo 1965). Ce fut le

début d’une multitude de recherches sur l’effet anticancéreux des microalgues.

Aujourd’hui, malgré la découverte de nouvelles technologies en chimie de synthèse,

permettant la création de composés actifs, le milieu naturel restent le principal fournisseur de

médicaments et de structures chimiques originales (Harvey, 2000; Newman et coll., 2000;

Newman et coll., 2003 ; Butler, 2004). Différentes sources potentielles touchant tous les

règnes du monde vivant sont aujourd’hui à l’étude (Tulp & Bohlin, 2004), avec un intérêt

tout particulier pour le milieu marin (Proksch et coll., 2002 ; Jensen et coll., 2003; Mayer &

Gustafson, 2004; Mayer & Hamann, 2004) et les algues marines (Leya et coll., 2009 ;

Bhatnagar & Kim, 2010 ; Guedes et coll., 2011 ; Nappo et coll., 2012 ; Talero et coll.,

2012). En effet, 6 % des brevets publiés sur les molécules naturelles d’origine marine entre

1999 et 2003 concernent des métabolites secondaires d'algues (Frenz et coll., 2004). Les

composés bioactifs isolés à partir de ces organismes sont principalement des antioxydants

(Engel et coll., 2002; Heo et coll., 2009; Shimizu 2003; Zubia et coll., 2009). Par ailleurs,

des études ont relié la possibilité de prévention du cancer par des algues (Schwartz & Shklar

1987 ; Fedkovic et coll., 1993), à leurs propriétés antioxydantes (Fedkovic et coll., 1993).


24

Section 2 : Antioxydants naturels et cancer

L’intérêt porté aux antioxydants naturels, en relation avec leurs propriétés thérapeutiques, a

augmenté considérablement. Depuis quelques années, il y a une restriction de l’utilisation des

antioxydants de synthèse, car suspectés d’effets tératogènes, mutagènes et cancérigènes

(Chavéron, 1999; Singh et coll., 2002). Les antioxydants naturels, ont par conséquent gagné

en importance. Ces derniers montrent une efficacité sur le stress oxydatif impliqué dans divers

états pathologiques comme l’inflammation, l’athérosclérose, ou le cancer (Lee et coll., 2004;

Mantena et coll., 2008).

Des recherches scientifiques dans diverses spécialités ont de ce fait, été développées pour

l’extraction, l’identification et la quantification de ces composés à partir de produits naturels

(Sanchez-moreno, 2002; Marc et coll., 2004 ; Huang et coll., 2005).

Le milieu naturel s’avère être un environnement riche en molécules bioactives. En effet,

nombre de recherches actuelles portent essentiellement sur les organismes marins et en

particulier sur les algues marines. Ces dernières sont considérées comme une source

prometteuse de métabolites pharmacologiquement actifs avec des effets antinéoplasiques

(Faulkner, 2000; El-Baz et coll., 2002; Tziveleka et coll., 2003) antimicrobiens et antiviraux

(Faulkner, 2000; Tziveleka et coll., 2003). En outre, en raison de leur vie phototropique, et

leur exposition permanente à de hautes teneurs en oxygène et aux radicaux libres, les

microalgues ont une grande capacité pour la production de nombreux métabolites efficaces

contre le stress oxydatif (Tsao & Deng 2004).

I. LES RADICAUX LIBRES ET LE STRESS OXYDATIF

I.1. Les radicaux libres

Les radicaux libres sont des espèces chimiques qui possèdent un électron non-apparié

(célibataire) sur leur couche orbitale externe. Les radicaux libres sont très instables de par leur

configuration électronique et leur durée de vie est très courte (environ 10-4s). Leur réactivité

réside dans le fait qu’ils recherchent un électron pour réapparier leur électron célibataire,

entraînant la propagation du phénomène par création d’un nouveau radical libre. Il se produit

ainsi des réactions en chaîne qui peuvent aboutir à des dénaturations ou destructions au niveau

cellulaire (Gardès-Albert et coll., 2003). Les radicaux libres peuvent être produits par notre


25

propre organisme au cours de réactions particulières, il s’agit de la voie endogène de

production de radicaux libres. Les radicaux libres peuvent également avoir une origine

exogène liée à notre environnement.

I.1.1. Production endogène

L’oxygène que l’on respire est nécessaire aux réactions chimiques nous permettant de

produire notre énergie. C’est au cours de ce métabolisme normal de l’oxygène (réduction de

l'oxygène moléculaire en eau) dans les mitochondries que la plupart des radicaux libres se

forment (Favier, 2003). Le passage d’une molécule d’oxygène à deux molécules d’eau

nécessite l’action de quatre électrons:

O2 + 4 e- + 4 H+ 2 H2O

Cependant, et jusqu’à 5 % des cas, on peut assister à une réduction incomplète de l’oxygène

en eau. Cette réduction incomplète aboutit à la production de l’oxygène singulet (1O2) mais

surtout de l’anion superoxyde (O2• -). La dismutation de ce dernier va donner naissance au

peroxyde d'hydrogène (H2O2) puis indirectement au radical hydroxyle (OH•) (Favier, 2003).

L’expression «Espèces Réactives de l’Oxygène » (ERO) désigne ces radicaux libres issus de

l’oxygène.

Les radicaux libres peuvent également être produits lors de la défense antibactérienne. Les

cellules phagocytaires activées pendant la réaction inflammatoire vont libérer un anion

superoxyde O2• -. Ce phénomène est appelé la flambée respiratoire. Les radicaux superoxydes

formés peuvent alors subir eux aussi des transformations donnant naissance aux dérivés

oxygénés toxiques présentés ci-dessus (Favier, 2003).

I.1.2. Production exogène

L’organisme humain est soumis à l’agression de différents agents extérieurs capables de

donner naissance à des espèces oxygénées réactives:

§ Les rayonnements UV (par l’intermédiaire d’agents photosensibilisants), les rayons X

et les rayons γ induisent la synthèse de radicaux libres dérivés de l’oxygène tels que O2• -,

1O2 et des molécules génératrices de radicaux libres (Favier, 2003).

§ L’oxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO2), des toxiques présents dans notre

environnement (suie, goudron, tabac, polluants industriels) sont également responsables de


26

la synthèse de radicaux libres. Ils sont à l’origine d’une auto-oxydation des acides gras

poly-insaturés (AGPI) des alvéoles pulmonaires (Favier, 2003).

§ L’ingestion d’alcool peut être à l’origine de la production de radicaux libres. Ils sont

produits au cours de l’oxydation de l’acétaldéhyde, principal métabolite de l’éthanol.

§ L'organisme peut avoir à faire face à une surproduction de radicaux libres beaucoup

trop forte pour être maîtrisée, qui sera observée dans les intoxications aux métaux lourds,

les ischémies/reperfusions suivant des thromboses (Favier, 2003).

§ Les radicaux libres sont également produits par des neutrophiles et des macrophages

pendant l'inflammation ; sont des sous-produits des réactions mitochondrie-catalysées de

transport d'électrons et d'autres mécanismes (Valko et coll., 2006).

§ Certains médicaments anti-cancéreux comme les anthracyclines peuvent aussi générer

des radicaux libres (Favier, 2003).

§ Enfin, une mauvaise alimentation pauvre en antioxydants contribuera également à

l’apparition d’un stress oxydant (Pincemail, 2002).

Généralement, le stress oxydant sera la résultante de plusieurs de ces facteurs et se produira

dans un tissu et un type cellulaire bien précis, objet de la défaillance et non pas dans tout

l’organisme (Favier, 2003).

I.2. Le Stress oxydatif

I.2.1.Définition du stress oxydatif

Dans les conditions physiologiques normales, les radicaux libres sont produits en permanence

et en faible quantité, cette production est parfaitement maîtrisée par des systèmes de défense

antioxydative, d'ailleurs adaptatifs par rapport au niveau de radicaux libres présents.

Dans ces circonstances normales, on dit que la balance antioxydants/pro-oxydants est en

équilibre. Si tel n'est pas le cas, que ce soit par déficit en antioxydants ou par suite d'une

surproduction de radicaux, l’équilibre est rompu au profit des pro-oxydants, cet excès de

radicaux libres est appelé stress oxydatif (Favier, 2003).

Chaque individu ne possède pas le même potentiel antioxydant selon ses habitudes

alimentaires, son mode de vie, ses caractéristiques génétiques ou l’environnement dans lequel

il vit (Diallo, 2005). L'importance des dommages du stress oxydant dépend de la cible

moléculaire, de la sévérité et du mécanisme par lequel l'effort oxydant est imposé (Aruoma,

1999).


27

I.2.2. Implications pathologiques du stress oxydatif

Les radicaux libres sont responsables de dommages sur toutes les molécules biologiques

comme les lipides, les protéines, les acides nucléiques (Favier, 2003):

• Au niveau de l’ADN, les radicaux libres peuvent induire des effets mutagènes ou un

arrêt des réplications.

• Les lipides sont une cible privilégiée des radicaux libres. Ceux-ci provoquent en effet

l’oxydation des acides gras poly-insaturés (AGPI) des phospholipides membranaires,

principaux constituants des membranes des cellules, mais aussi des organites cellulaires et des

noyaux. Ce phénomène est appelé peroxydation lipidique ou lipopéroxydation.

• Les radicaux libres peuvent aussi agir sur les macromolécules en provoquant des

inactivations enzymatiques, des fragmentations de ces molécules (collagène, protéoglycannes,

acide hyaluronique) et la formation de dimères ou d’agrégats protéiniques dans les

membranes cytoplasmiques.

En plus des altérations de l’ADN et des mutations, les radicaux libres peuvent être des

facteurs prédisposants au cancer (Silva et coll., 2001; Fresco et coll., 2006; Siquet et coll.,

2006). Ils sont impliqués dans divers processus pathologiques, incluant le cancer du sein

(Malins et coll., 1996), le cancer colorectal (Nelson, 1992), le cancer du poumon (Stayner,

1996) le cancer de la cavité nasale, le cancer du larynx (Feron et coll., 2001), le cancer du

colon (Vachtenheim, 1997), la leucemie (Karas et coll., 2000), le cancer de la peau (Clark

et coll., 1996), le cancer de l’estomac (Blot et coll., 2000) et le cancer de l’ovaire (Seemann

& Hainaut, 2005).

Le stress oxydatif est aussi impliqué dans de très nombreuses autres pathologies (figure 12)

comme facteur déclenchant ou associé à des complications (Favier, 2003). Il peut être associé

à l’athérosclérose, l’asthme, l’arthrite, la cataractogénèse, l’hyperoxie, l’hépatite, l’attaque

cardiaque, les vasospasmes, les traumatismes, les accidents vasculaires cérébraux, les

pigments d’âge, les dermatites, les dommages de la rétine, les parodontites (Cohen et coll.,

2000; Packer et Weber, 2001). Néanmoins, la plupart des maladies induites par le stress

oxydant apparaissent avec l'âge car le vieillissement diminue les défenses antioxydantes et

augmente la production mitochondriale des radicaux (Favier, 2003).


28

Figure 12 : Les pathologies associées aux espèces réactives de l’oxygène (Lee et coll., 2004).

II. LES ANTIOXYDANTS

II.1.Définition d’un antioxydant

Un antioxydant est défini comme toute substance ayant la capacité de retarder, prévenir ou

réparer un dommage oxydatif d’une molécule cible (Halliwell & Gutteridge, 2007). Ainsi,

les antioxydants servent à contrôler le niveau des espèces réactives pour minimiser le

dommage oxydatif (Tang & Halliwell, 2010).

II.2. Mode d’action des antioxydants

Indépendamment de leur localisation, les antioxydants peuvent agir à deux niveaux : en

prévenant la formation de radicaux libres oxygénés ou en épurant les radicaux libres

oxygénés. En complément de cette double ligne de défense, l’organisme est en outre capable

de réparer ou d’éliminer les molécules endommagées par l’attaque radicalaire (Gardès-

Albert, 2003).

Les antioxydants préventifs ont une action stabilisatrice, ils agissent en décomposant par

exemple les peroxydes en des produits stables ce qui empêche la formation des radicaux

libres. Ils peuvent aussi chélater les catalyseurs des réactions d’oxydation tels que les ions

métalliques.

Les antioxydants peuvent agir comme piégeurs des ERO, ils rentrent en compétition avec des

radicaux déjà existants et contribuent à bloquer la phase de propagation. On différencie deux

types de piégeage (Huang et coll., 2005):


29

- le premier par libération d’un atome d’hydrogène, souvent par une structure

aromatique (cas des dérivés des phénols : tocophérols, polyphénols, flavonoïdes…).

- et le deuxième par libération d’un électron.

II.3. Les différentes classes d’antioxydants

II.3.1. Les antioxydants endogènes

II.3.1.1. Les antioxydants enzymatiques endogènes

L’organisme humain possède un système enzymatique, constitué principalement de trois

enzymes: la superoxyde dismutase (SOD), la catalase et la glutathion peroxydase (GPx)

(Avissar et coll., 1989).

§ La superoxyde dismutase

La superoxyde dismutase (SOD), est une enzyme qui élimine l’anion superoxyde par une

réaction de dismutation, elle produit de l’oxygène et du peroxyde d’hydrogène.

§ La catalase

Elle transforme les deux molécules de peroxyde d’hydrogène produites lors de la réaction de

dismutation en eau et en oxygène qui sont des composés stables (Jacques & André, 2004).

§ La glutathion peroxydase

La glutathion peroxydase se trouve dans le cytoplasme et dans les mitochondries, elle

nécessite la présence de deux cofacteurs importants: le glutathion réduit et le sélénium.

En présence de deux molécules de glutathion sous forme réduites, la glutathion peroxydase

catalyse la transformation de peroxyde d’hydrogène en deux molécules d’eau.

Au fur et à mesure de sa consommation par la glutathion peroxydase, le glutathion doit être

régénéré, cela est rendu possible par une glutathion réductase qui consomme une molécule de

NADPH fourni par la voie des pentoses phosphates (Jacques & André, 2004).


30

Au total le mécanisme réactionnel invoqué dans la détoxification enzymatique peut être

résumé dans la figure 13:

(SOD : supéroxyde dismutase, CAT : catalase, GPX : glutathion peroxydase, GR : glutathion réductase, GSH : glutathion réduit, GSSG : glutathion oxydé, G6PD : glucose-6-phosphate déshydrogénase).

Figure 13: Principales étapes de la défense enzymatique contre les espèces réactives de l’oxygène (Jacques & André, 2004).

II.3.1.2. Les antioxydants non enzymatique endogènes

Le glutathion, agent antiradicalaire, est composé de 3 acides aminés : cystéine, acide

glutamique et glycine. Les deux derniers acides aminés sont produits rapidement par

l’organisme mais la cystéine est un acide aminé semi-essentiel, qui doit donc être présent dans

notre alimentation. Le glutathion a, en plus de son rôle de cofacteur des péroxydases, le

pouvoir de capter directement les radicaux libres, notamment le radical hydroxyle OH•

(Nakazawa et coll., 1996).

L’acide urique a également un rôle d’antioxydant, il participerait au piégeage de l’anion

superoxyde (O2• -

) et du radical hydroxyle (OH•) (Nakazawa et coll., 1996).

Plusieurs protéines qui circulent dans le sérum peuvent prendre en charge des ions métalliques

libres qui sont potentiellement toxiques, il s’agit de la bilirubine, l’albumine, la ferritine, la

transferrine et la lactoferrine pour le fer et la céruléoplasmine pour le cuivre. Elles agissent

comme des chélateurs et maintiennent les ions métalliques sous forme inactive par rapport à

la combinaison possible avec le peroxyde d’hydrogène (Jacques & André, 2004).

II.3.2. Les antioxydants exogènes

Les antioxydants exogènes sont des composés que l’organisme est incapable de fabriquer. Ces

composés, peuvent être naturels ou de synthèse.


31

II.3.2.1. Les antioxydants naturels

§ Les vitamines

La vitamine A, la vitamine E (tocophérol) ou encore la vitamine C (acide ascorbique), le b-

carotène et le lycopène, sont des antioxydants naturels, qu’on retrouve dans de nombreux

fruits et légumes. Ces vitamines sont de bons capteurs de radicaux libres oxygénés puisqu'ils

réagissent non seulement avec les radicaux hydroxyles •OH, mais aussi avec les radicaux

superoxydes O2•- (Gardès-Albert et coll., 2003).

Parmi les antioxydants d’origine naturelle, on remarque que les tocophérols présentent une

faible efficacité pour un coût de production élevé. Quant à l’acide ascorbique, il peut se

comporter comme une substance pro-oxydante à forte concentration (Moure et coll., 2001).

§ Les composés phénoliques

Les composés phénoliques et en particulier les flavonoïdes, sont des métabolites secondaires

des végétaux caractérisés par une structure commune de type 2-phénylbenzopyrane (Figure

14).

Figure 14 : Structure chimique de la 2-phénylbenzopyrane (Leopoldini et coll., 2011).

Leur capacité antioxydante réside dans leur faculté à « terminer » les chaines radicalaires par

des mécanismes de transfert d’électrons et de protons, et à chélater les ions des métaux de

transition capables de catalyser la peroxydation lipidique (Figure 15) (Schroeter et coll.,

2002; Leopoldini et coll., 2011).


32

Figure 15 : Mécanisme d’action antioxydante des composés phénoliques (Leopoldini et coll., 2011).

§ Les caroténoïdes

Les caroténoïdes sont constitués de deux classes de composés : les carotènes et les

xanthophylles (figure 16). Les premiers sont des molécules terpéniques pouvant être

assimilées à la condensation de chaînes de 20 carbones, ils se présentent majoritairement sous

les formes α et β-carotène et plus minoritairement sous les formes ε, γ ou δ carotène. Les

seconds découlent de l’oxydation progressive des carotènes, et regroupent : l’astaxanthine,

l’anthéraxanthine, la citranaxanthine, la cryptoxanthine, la canthaxanthine la diadinoxanthine,

la diatoxanthine, la flavoxanthine, la fucoxanthine, la lutéine, la néoxanthine, la

rhodoxanthine , la rubixanthine, la siphonaxanthine, la violaxanthine et la zéaxanthine

(Jeffrey et coll., 1997 ; De Reviers, 2002 ; Ruiz, 2005).


33

Figure 16: Structure chimique de caroténoïdes : violaxanthine et β,β-carotène (Jeffrey et

coll., 1997 ; De Reviers, 2002 ; Ruiz, 2005).

§ Les oligoéléments

Les oligoéléments ou les éléments-trace constituent des cofacteurs nécessaires aux activités

des enzymes antioxydantes (figure 17) (Roussel, 2009).

Le cuivre, le zinc, le manganèse, le sélénium et le fer sont des métaux essentiels dans la

défense contre le stress oxydant. Ces oligoéléments jouent le rôle de cofacteur pour maintenir

l’activité catalytique des enzymes antioxydantes (Garait, 2006).

Figure 17 : Oligoélements nécessaires aux activités des enzymes antioxydantes (Roussel, 2009). Ainsi, le sélénium (Se) joue un rôle clé dans la protection des cellules et de leurs constituants

contre l’attaque radicalaire. Cette fonction est due à sa présence dans le site actif des

glutathions peroxydases (GPX) sélénodépendantes (Lhuillier, 2007).


34

Le zinc (Zn) et le cuivre (Cu) jouent un rôle dans le fonctionnement de la SOD. Le zinc

protège les groupements thiols (SH) des protéines contre l’oxydation induite par le fer, en

empêchant la formation de ponts disulfure intramoléculaires (Lhuillier, 2007).

II.3.2.2. Les antioxydants de synthèse

Dans l’industrie alimentaire, les antioxydants synthèse, tels que le butylhydroxyanisole

(BHA), lebutylhydroxytoluène (BHT), le propyl gallate (PG) et le tétrabutylhydroquinone

(TBHQ) (figure 18), sont largement utilisés en raison de leur efficacité et leur faible coût.

Cependant, il a été démontré que ces antioxydants de synthèse pouvaient être toxiques (Yu et

coll., 2000). En effet, le BHA convertirait certains produits ingérés en substances toxiques ou

carcinogènes en augmentant la sécrétion des enzymes microsomales du foie et des organes

extra-hepatiques (Barlow, 1990). Le BHT présenterait des effets carcinogènes chez le rat (Ito

et coll., 1985).

Figure 18 : Structures chimiques de quelques antioxydants de synthèse (Yu et coll., 2000).

De nouvelles recherches se sont ainsi intéressées aux antioxydants naturels (Sanchez-

moreno, 2002; Marc et coll., 2004; Huang et coll., 2005; Gulcin et coll., 2010). Dans ce

contexte, les algues marines semblent constituer une alternative permettant de substituer les

antioxydants de synthèse. En effet, plusieurs études menées sur différents types d'extraits de

microalgues ont clairement indiqué que ces organismes sont une source prometteuse

d'antioxydants de nature biochimique variée (Li et coll., 2007; Rodriguez-Garcia & Guil-

guerrero, 2008; Chacón-Lee & González- Mariño, 2010; Hajimahmoodi et coll., 2010;

Lee et coll., 2010).


35

III. LES ANTIOXYDANTS NATURELS POUR LA PREVENTION DU CANCER

La relation entre les polyphénols naturels, l'apoptose et le cancer a été mise en évidence par

des études sur l'aptitude de ces composés à agir comme agents de chimio-prévention du

cancer et / ou comme agents chimiothérapeutiques (Kelloff et coll., 1994 ; Jang et coll.,

1997).

Les antioxydants naturels comme les acides phénoliques, les polyphénols et flavonoïdes

piègent les radicaux libres et inhibent les mécanismes oxydatifs (Gulcin et coll., 2010). De

plus ces composés phénoliques peuvent agir à différents stades du développement de tumeurs

en protégeant les biomolécules cellulaires contre les dommages oxydatifs et en prévenant le

processus de cancérogenèse (Bravo, 1998). En effet ces composés possèdent de nombreux

mécanismes impliqués dans la carcinogenèse (figure 19), tels que, la régulation de

l'expression de gènes cibles impliqués dans la survie et la prolifération cellulaire (Kang et

coll., 2011), l’induction de différents programmes d’apoptose (Giovannini et coll., 2012), ou

l’inhibition des métalloprotéinases matricielles (Katiyar, 2006) et les facteurs de croissance

de l’endothélium vasculaire (VEGF) (Oak et coll., 2005), affectant ainsi l'angiogenèse et le

développement de métastases.

Figure 19 : Effets biologiques des polyphénols (Martins & Andriantsitohaina, 2002).

Par ailleurs, des rapports ont suggéré que les polyphénols ont des effets protecteurs dans le

développement d'une néoplasie pulmonaire (Katiyar et coll., 1993 ; Komori et coll., 1993).

En outre, ils sont capables d'inhiber la prolifération du carcinome pulmonaire et des

métastases par différents mécanismes (Menon et coll., 1995 ; Sazuka et coll., 1995 ; Yang et

coll., 1998 ; Yuan et coll., 2006).


36

Dans une étude évaluant la cytotoxicité de plus de 100 polyphénols de bas poids moléculaire,

sur des lignées cellulaires normales et tumorales, il apparait que ces composés sont plus actifs

sur les souches cancéreuses que sur les lignées saines (Fukai et coll., 2000). Les composés les

plus actifs possèdent un groupe hydrophile (hydroxylation) en position vicinale d’un groupe

hydrophobe (prényle ou phényle) (Fukai et coll., 2000 ; Botta et coll., 2009).

Une récente étude a révélée que les polyphénols présentent des effets synergiques s’ils sont

administrés (en tant que thérapie adjuvante complémentaire) en association avec une

chimiothérapie et / ou radiothérapie anticancéreuse conventionnelle (Rodríguez et coll.,

2013). Cependant, d’autres études doivent être faites pour comprendre comment les

polyphénols peuvent être utilisés pour induire l’apoptose des cellules cancéreuses in vivo.

IV. ANTIOXYDANTS ET PRO-OXYDANTS

Le paradoxe des radicaux libres en biologie est qu’ils constituent des espèces extrêmement

dangereuses, susceptibles d'engendrer un nombre considérable de maladies, tout en étant des

espèces indispensables fonctionnement cellulaire.

Les radicaux libres participent au fonctionnement de certaines enzymes, à la signalisation

cellulaires, à la défense immunitaire contre les agents pathogènes, à la régulation de la

dilatation capillaire, au fonctionnement de certains neurones, à la fécondation de l'ovule, à la

régulation des gènes (Favier, 2003), à la production énergétique, à la régulation de la

croissance cellulaire, à la signalisation intracellulaire (Ardestani & Yazdanparast 2007), et à

la destruction par apoptose des cellules tumorales (Favier, 2003).

Une hypothèse proposée par Chen et coll., (2007) met en évidence l'effet anticancéreux de

radicaux libres générés in situ sur des cellules tumorales qui sont plus sensibles à cet effet que

les cellules saines environnantes.

En effet, dans l’étape de la promotion du cancer, un haut niveau de stress oxydatif est

cytotoxique à la cellule et arrête la prolifération en induisant une apoptose ou même une

nécrose (Figure 20), tandis qu’un faible niveau de stress oxydatif peut stimuler la division

cellulaire favorisant la croissance tumorale (Dreher, 1996). De même, au cours de l'étape de

progression du cancer, la diminution du stress oxydatif peut en fait stimuler la croissance des

tumeurs à travers la survie accrue des cellules tumorales (Valko et coll., 2006). Ainsi, à un


37

certain stade de la cancérogenèse, les radicaux libres peuvent soit provoquer une réponse

positive (prolifération cellules cancéreuses) soit une réponse négative (arrêt de la croissance

ou mort cellulaire) (Lowenstein, 1994).

Figure 20 : Effet des radicaux libres sur le processus de carcinogenèse (Valko et coll.,

2006).

Un autre point important qui doit être pris en considération est le caractère pro-oxydant de

certains antioxydants qui peut se produire en fonction de la concentration et de

l'environnement (pression d'oxygène) dans lequel ils agissent (Valko et coll., 2006 ;

Villanueva & Kross 2012).

En 2013, une étude menée par Block et ses collaborateurs pour l’exploration de l'effet pro-

oxydant des antioxydants a révélé que de nombreux antioxydants naturels provoquent une

apoptose dans les cellules cancéreuses lorsqu'ils sont ajoutés à des doses élevées sur des

cellules cancéreuses cultivées in vitro. Alors que ces mêmes doses ne provoquent pas

d’apoptose sur les cellules saines. On en conclu qu’à de hautes doses, les antioxydants

induisent la production des radicaux libres par les cellules cancéreuses par interaction avec les

métaux, ce qui peut déclencher l'apoptose. En effet, la plupart des antioxydants naturels qui

sont connus pour déclencher l'apoptose dans les cellules cancéreuses se sont avérés former

des radicaux libres quand ils interagissent avec le cuivre (Block, 2013).


38

Les cellules cancéreuses sont bien connues pour avoir des concentrations élevées de cuivre et

d'autres métaux tels que le fer. Le cuivre en particulier, joue un rôle important dans les

processus métaboliques fondamentaux des cellules cancéreuses, dans l'angiogenèse, ainsi que

dans les métastases (Block, 2013). Les cellules cancéreuses ont besoin de cuivre pour

accomplir ces fonctions, qui sont absentes dans les cellules normales. Lorsque des

antioxydants naturels interagissent avec le cuivre, ils ciblent ainsi les cellules cancéreuses

avec des radicaux libres. Cela peut expliquer pourquoi les antioxydants induisent l'apoptose

dans les cellules cancéreuses, et pas dans les cellules normales.

La question des thérapies antioxydantes est ainsi largement ouverte et semble constituer une

voie de recherche et de développement prometteuse. Compte tenu de leur biodiversité (Li et

coll., 2007) et de leur capacité à métaboliser efficacement les espèces réactives de l’oxygène

(Halliwell et coll., 1995), les microalgues pourraient y trouver des créneaux de valorisation

spécifiques qui permettraient la mise en évidence de composants bioactifs d’origine marine.

En effet, les sources naturelles pour la découverte de nouvelles molécules pharmacologiques

sont nombreuses, mais l'environnement marin, abritant une grande variété d'organismes

différents dans leur physiologie et leur capacité d’adaptation, devient une ressource de choix

pour l'identification de nouvelles de molécules aux vertus thérapeutiques (Margulis &

Schwartz 1998).


39

Section 3 : Biodiversité, chimiodiversité et pharmacodiversité du

monde marin

Les océans couvrent 70% de la surface de notre planète (Haefner, 2003) et représentent le

plus grand écosystème mais aussi le plus ancien. Le monde marin apparaît aujourd’hui

comme une source très importante de molécules à activités biologiques présentant le plus

grand potentiel.

En effet, en raison de leur large panel d'activités biologiques; anti-tumorale, anti-

microtubules, antiproliférative, photoprotectrice, antibiotiques et anti-infectieux (Berdy et

coll., 2005 ; Molinski et coll., 2009 ; Mishra et coll., 2011 ; Schumacher et coll., 2011), les

produits naturels marins sont actuellement considérés comme des substances particulièrement

intéressantes pour des applications dans l'industrie pharmaceutique.

I. LES PREMIERES DECOUVERTES EN PHARMACOLOGIE MARINE

Le monde marin est resté longtemps inexploré du point de vue ressource pharmacologique.

Même si l’utilisation des algues marines apparaît dans la pharmacopée chinoise 2800 ans

avant J-C, l’utilisation d’organismes marins dans les médecines traditionnelles reste très

limitée. Les recherches en pharmacologie marine ont débuté au milieu du XXème siècle,

avec deux découvertes majeures.

1 : En 1948, les céphalosporines (figure 21) sont isolées par le professeur Brotzu d’un

champignon microscopique marin (Cephalosporium acremonium). Les céphalosporines sont

des antibiotiques encore couramment utilisées (Kornprobst, 2005).

2 : Au début des années 50, les arabinosides sont isolés par le chimiste américain

Bergmann à partir d’une éponge des caraïbes Cryptotethya crypta. L’ARA-C (figure 21) est

un anticancéreux puissant (Kornprobst, 2005; Newman et coll., 2009; Mayer et coll.,

2010).


40

Figure 21 : Structure chimique de la céphalosporine C (A) (Abraham & Newton, 1961)

et de l’ARA C (B) (Pizer& Cohen 1960).

Suite à ces deux découvertes, des efforts considérables furent mis en œuvre pour découvrir

des nouveaux produits naturels provenant des océans.

En 1998, 35 nouvelles molécules anticancéreuses issues du monde marin ont été identifiées et

caractérisées. En 2006, 136 produits naturels d’origine marine et appartenant à des classes

structurales diverses, incluant des polykétides, des terpènes, des stéroïdes et des peptides sont

référencés (tableau 1), (Glaser & Mayer, 2009). Ces molécules proviennent de diverses

sources comprenant les invertébrés, les bactéries et les moisissures.

Tableau 1 : Molécules marines anticancéreuses identifiées et caractérisées entre 1998-2006 (Glaser & Mayer, 2009).

Année Produits naturels marins en phase d’essai

clinique ou préclinique en oncologie 2006 136

2004 150

2002 97

2000 143

1999 31

1998 35

Total 592

A B


41

II. CHIMIODIVERSITE ET ORIGINALITE STRUCTURALE DES MOLECULES

ISSUES DU MONDE MARIN

La grande diversité des productions biochimiques marines s’est développée au cours de

millions d’années d’évolution des océans sur la base de deux poussées vitalistes

fondamentales, comme la défense et l’adaptation. Ceci est le résultat de la présence d’un

grand nombre d’espèces vivantes dont la coexistence dans les différents écosystèmes est

possible grâce à plusieurs systèmes d’interactions. Dans ces processus, la chimie joue un rôle

crucial; en effet, tous les organismes vivants possèdent une importante diversité biochimique

nécessaire à leur survie. Ils peuvent élaborer des composés, appelés «métabolites secondaires»

qui sont impliqués dans les interactions inter et intraspécifiques, ils ont un rôle de médiateur

chimique.

Les substances naturelles isolées d’organismes marins se caractérisent souvent par la présence

d’éléments chimiques ou de structures rarement observées en milieu terrestre en raison de la

composition chimique de l’eau de mer. Les molécules marines contiennent des atomes comme

le chlore, le soufre, le brome, le bore, le silicium, l’iode et l’arsenic. Ces éléments sont peu

retrouvés dans les métabolites des organismes terrestres (Kornprobst, 2005). Outre cette

originalité chimique, les molécules marines présentent également une originalité structurale.

Par exemple, les terpènes halogénés retrouvés chez certaines algues rouges (figure 22) n’ont

pas d’équivalents terrestres (Kornprobst, 2005).

Figure 22 : Structure chimique de l’halomon, un monoterpène issu de l’algue rouge

Portiera hornemannii. Cette molécule possède une forte action cytotoxique sur différentes lignées cellulaires cancéreuses (Kornprobst, 2005).

La description de substances nouvelles synthétisées par des organismes marins, algues,

invertébrés ou microorganismes, a permis de caractériser plusieurs molécules actives

susceptibles de limiter la progression tumorale et de freiner la cancérogenèse (Mayer &

Gustafson, 2004). Avec une approche intégrée de la microbiologie, le screening et la chimie

des produits naturels, les métabolites microbiens marins semblent être maintenant

d’importants candidats en pharmacologie. De nombreux composés de différentes classes


42

chimiques et avec des mécanismes d'action différents sont en phase pré-clinique ou clinique

de développement pharmaceutique afin de prouver leur potentiel en tant que médicaments

antitumoraux (tableau 2).

Tableau 2: Quelques exemples d’anticancéreux marins et leurs mécanismes d’action (Bhatnagar & Kim, 2010, Martins et coll., 2014).

Nom du composé

Classe chimique Origine Mode d’action Statut clinique

Cytarabine, Ara-C (Cytosar-U®)

Nucléoside Eponge Cryptotethya

crypta

Inhibition de l’ADN

polymerase Approuvée en 1969

Trabectedine (ET-743) (Yondelis®)

Alkaloide Tunicier Ecteinascidia

turbinata

Agent alkylant, Blocage du cycle cellulaire

Approuvée en 2007

Eribuline Mesylate (Halaven®)

Macrolide Eponge Halichodria

okadai

Agent interagissant avec les microtubes

Approuvée en 2013

Dolastatine (Adcetris®)

Oligopeptides Cyanobactérie Symploca sp

activité pro-apoptotique

Approuvée en 2013

Plitidepsine Depsipeptide Tunicier Aplidium

albicans

Inducteur d’apoptose Phase II

PM1004 (Zalypsis®)

Alcaloide Mollusque Joruna

funebris

Blocage du cycle cellulaire

Phase II

Squalamine Aminostéroïde Requin Squalus

acanthias

Inhibiteur de l’angiogènese

Phase II

Bryostatine 1 lactones macrocycliques

Bryozoaire

Bugula

neritina

Inhibiteur des Protéines Kinase C

Phase I

Hemiasterline (E7974)

Tripeptide Eponge Hemiasterella

minor

Agent interagissant avec les microtubes

Phase I

Salinosporamide A (NPI-0052)

Beta-lactone- gamma lactame

Actinomycète Salinospora

tropica

Inhibiteur des proteasome

Phase I


43

III. POTENTIEL DES MICROALGUES MARINES

Les molécules isolées à partir d’organismes marins ont souvent, comme évoqué

précédemment, des mécanismes d’action particuliers et peu retrouvés chez les autres

molécules anticancéreuses (Nobili et coll., 2009; Von Schwarzenberg & Vollmar, 2010).

Car les organismes sans moyens mécaniques de défense (coquilles, camouflages divers,

capacité de déplacement rapide, …), ne peuvent se protéger des prédateurs que par

l’utilisation de véritables armes chimiques, en général des sécrétions destinées à repousser ou

à empoisonner un agresseur éventuel. Les organismes les plus simples qui ont su coloniser

une immense diversité de milieux, allant des plus tempérés aux plus extrêmes, ont dû

développer une grande diversité de voies métaboliques impliquant une importante production

biochimique.

C’est pourquoi les microorganismes marins attirent tout particulièrement le monde de la

chimie marine (Fenical & Jensen, 1993; Schwartsmann et coll., 2001). Dans ce cadre les

microalgues, qui sont reconnues depuis longtemps comme potentiels producteurs de toxines et

qui sont présentes dans toutes les régions du globe, semblent être des organismes parfaitement

adaptés à la recherche de composés bioactifs (Skulberg, 2000).

III.1. Les microalgues

Dans le milieu marin, ces organismes constituent le phytoplancton qui est à la base de toute la

chaîne alimentaire et supporte une production de ressources renouvelables exploitées de

l'ordre de 100 millions de tonnes par an. Par leur taille de l'ordre de quelques μm, leur durée

de génération de l'ordre de la journée, leur diversité taxonomique et donc biochimique, ils

peuvent donner lieu à de nouvelles applications scientifiques et économiques. Leurs

particularités biochimiques les plus marquées concernent les lipides, les polysaccharides, les

pigments protéiques et caroténoïques, les enzymes et les substances bioactives. Ces molécules

intéressent de nombreuses applications dans les domaines de l'alimentation, la pharmacologie,

la cosmétique, etc …

C’est pourquoi les microalgues sont aujourd’hui au centre de l’attention de nombreux

scientifiques (Shimizu, 1996; Shimizu, 2000; Shimizu, 2003 ; Moreau, 2006 ; Pasquet,

2011 ; Baudelet et coll., 2013). En effet il semble clair, que ces organismes à fort potentiel

biochimique et facile à produire, peuvent répondre aux exigences du monde industriel et

notamment de l’industrie pharmaceutique. De plus les microalgues étant isolées et produites

de manière contrôlées présentent d’autres intérêts quant à leur utilisation en recherche :


44

§ Les microalgues étant produites de manières contrôlées seront disponibles dans

un état physiologique constant. En effet il est indispensable pour permettre une

reproductibilité des résultats des tests pharmacologiques, d’avoir accès une grande

quantité de matière première homogène. Il est su depuis longtemps que les variations

temporelles et géographiques ont une influence sur la physiologie d’un organisme vivant

et donc sur sa production biochimique. On sait de plus que les molécules bioactives sont

régulièrement des métabolites secondaires (Kelecom, 2002), produits dans des conditions

particulières en très faible quantité. C’est pour cela que la production d’une biomasse

constante et contrôlée est indispensable pour permettre la découverte et l’isolation de

molécules d’intérêts.

§ L’autre point important de l’intérêt de cette ressource de biomasse disponible

en laboratoire, concerne la problématique écologique. En effet, trop souvent la recherche

pharmacologique s’est intéressée à des organismes rares, en faible quantité dans la nature.

Or, on sait aujourd’hui que la production d’un nouveau médicament issue d’une molécule

naturelle va consommer une grande quantité de l’organisme producteur. Ainsi, il est

parfois difficile de faire correspondre les exigences de l’industrie pharmaceutique avec la

protection écologique d’une espèce vivante. La chimie de synthèse n’étant pas toujours

capable de palier au problème de la quantité de molécules disponibles, l’utilisation d’un

organisme produit à volonté semble être une bonne alternative.

III.2. Biodiversité des microalgues marines

Il existe quatre lignées de microalgues, chacune possédant de 1 à 7 embranchements pouvant

chacun compter jusqu'à 10 000 espèces (Jeffrey et coll., 1997). La classification des

microalgues selon la composition pigmentaire ainsi que leur biodiversité est présentée dans le

tableau 3.


45

Tableau 3 : Diversité des microalgues marines et dulçaquicoles (Jeffrey et coll., 1997).

Embranchement/Classe Nom usuel Genre Nombre approximatif

d’espèces

Lignée brune : chlorophylles a et c

Dinophyta Dinophlagellés 550 4000

Ochrophyta Algues dorées

Bacillariophyceae Diatomés 210 5500 à 10000

Chrysophyceae Chrysophyte, sillicoflagellés

120 1000

Eustigmatophyceae 6 12

Raphidophyceae Raphidophytes 4 9

Xanthophyceae 90 600

Haptophyta Algues dorées

Prymnesiophyceae Coccolithophorides 50 500

Cryptophyta Cryptonomades 8 >50

Lignée verte : chlorophylles a et b

Chlororophyta

Chlorophyceae Algues vertes 350 2500

Prasinophyceae Flagellés verts 13 120

Euglenophyta Euglenoïdes 43 650 à 800

Lignée rouge : chlorophylles a et biliprotéines

Rhodophyta Algues rouges 3 10

Cyanobactéries : chlorophylles a et biliprotéines

Cyanophyta Cyanobactéries >10000

Prochlorophyta Prochlorophytes 3 3


46

III.3. La microalgue Nannochloropsis gaditana

Selon Hibberd (1981), les espèces du genre Nannochloropsis sont des microalgues marines

appartenant au règne des Chromista, embranchement des Heterokontophyta, classe des

Eustigmatophyceae, ordre des Eustigmatales, et famille des Monodopsidaceae. Ces

microalgues ont une forme subsphérique de 2 à 4 μm de diamètre ou cylindrique de 3 à 4 ×

1,5 μm (Antia & Cheng, 1982). Le genre Nannochloropsis regroupe cinq espèces :

N.oculata, N.salina, N.gaditana, N.granulata et N.limnetica (Suda et coll., 2002). L’espèce

Nannochloropsis gaditana a été décrite pour la première fois en 1982 par Lubián. La souche

fut isolée au niveau de la baie de Cadix en Espagne. La figure 23 est une représentation

schématique de la cellule de Nannochloropsis gaditana.

Figure 23: Schéma représentatif des principales caractéristiques ultra-structurales de Nannochloropsis gaditana. C : chloroplaste ; MP : membrane plasmique ; N : noyau ; M : mitochondrie ; REC : réticulum endoplasmique associé au chloroplaste ; T : thylacoïde ; MC : membrane cellulaire ; V : vacuole ; L : lipides ; P : globules plastidiaux (Lubián, 1982).

Nannochloropsis gaditana est caractérisée par la présence de la chlorophylle a (pas de

chlorophylle b ou de chlorophylle c), le β-carotène, la violaxanthine et la vaucheriaxanthine

comme principaux pigments. Quelques xanthophylles (canthaxanthine, antheraxanthine,

astaxanthine, et zéaxanthine) sont également présentes en quantités beaucoup plus faibles

(Lubián et coll., 2000).

Toutes les souches de Nannochloropsis possèdent une composition en pigments similaire

(Antia et coll., 1975; Lubián & Establier, 1983; Owens et coll., 1987). La violaxanthine et

vaucheriaxanthine sont toujours présentes comme principaux caroténoïdes (Lubián, 2000).


47

Le tableau 4 illustre la teneur en pigments de trois espèces de Nannochloropsis après 10 et 20

jours de culture (Lubián et coll., 2000).

Tableau 4: Proportions relatives des principaux pigments par cellule exprimées en (ng [106 cellules]-1) chez trois espèces de Nannochloropsis après 10 et 20 jours de culture (Lubián et coll., 2000).

Pigments Jour N.gaditana N.oculata N.salina

Violaxanthine 10 37.4 48.9 47.7

20 31.7 32.0 28.0

Astaxanthine 10 6.7 2.6 5.4

20 12.4 3.4 9.6

Antheraxanthine 10 3.5 0.9 3.4

20 6.1 5.6 5.2

Vaucheriaxanthine 10 46.9 45.3 32.9

20 22.8 47.2 26.5

Zéaxanthine 10 1.0 0.8 3.3

20 4.9 1.8 5.9

Canthaxanthine 10 4.5 1.5 7.3

20 16.9 4.5 15.9

β-carotène 10 n.d n.d n.d

20 5.2 5.5 8.8

Chlorophylle a 10 92.6 116.4 116.8

20 89.7 168.6 103.8

n.d : non déterminé

Les espèces du genre Nannochloropsis sont généralement utilisée dans l'aquaculture car elle

possède un bon profil nutritionnel (Lubián, 1982 ; Rocha et coll., 2003). Elles présentent une

teneur en protéines de 22% (Volkman et coll., 1993) et jusqu’à 68 % de lipides (Chisti,

2007). En comparaison avec les autres espèces de Nannochloropsis ainsi qu’avec d'autres

microalgues, N.gaditana montre un rendement élevé en lipides et est donc considérée comme

une source appropriée pour la production de biodiesel (Carrero et coll., 2011). En outre, elle

présente des quantités élevées en acide eicosapentaenoıque (EPA ou 20:5ϖ3), un important

acide gras polyinsaturé permettant la prévention de plusieurs maladies (Wen & Chen, 2003).

Nannochloropsis a également prouvé qu’elle est une souche robuste car elle peut résister à des

taux d’irradiation ou de pH élevés (Sukenik et coll., 2009) ce qui lui permet de faire face à

des conditions environnementales variables.


48

III.4. Effets anticancéreux de microalgues

III.4.1. Etudes menées sur les molécules naturelles antiprolifératives issues de

microalgues marines

Les invertébrés marins comme les éponges, les cnidaires, les tuniciers et les bryozoaires sont

une source de molécules à activité biologique. La plupart de ces organismes ont une flore

commensale incluant des bactéries, des microalgues (dont les cyanobactéries) et des

moisssures. De nombreux métabolites secondaires retrouvés chez les invertébrés proviennent

de cette flore (Dunlap et coll., 2007).

L’exemple le plus connu est la mise en évidence des dolastatines, agents déstabilisants des

microtubules. Les dolastatines ont été isolées initialement du mollusque Dolabella

auricularia. En réalité, elles proviennent des cyanobactéries du genre Symploca qui font

partie du régime alimentaire de D.auricularia (Pettit et coll., 1981; Bai et coll., 1993;

Simmons et coll., 2005).

Plus de 120 alcaloïdes issus de cyanobactéries ont été décrits entre 2001 et 2006. Ces

substances présentent une large diversité de structures chimiques avec une grande variété

d’activités biologiques (Tan, 2007). Par exemple, le jamaicamide A (figure 24), neurotoxine,

issue de L. majuscula présente des activités cytotoxiques sur la lignée de cancer du poumon

H460 (Edwards et coll., 2004). La wewakpeptine A (figure 24), issue de L. semiplena est

cytotoxique contre la lignée de cancer du poumon H 460 (Edwards et coll., 2004 ; Han et

coll., 2005; Tan, 2007).

Figure 24 : Structure chimique du jamaicamide A (A) et de la wewakpeptine A (B)

(Edwards et coll., 2004 ; Han et coll., 2005; Tan, 2007).


49

Arthrospira platensis ou « Spiruline » montre des activités antioxydantes. Certains de ses

extraits enrichis en sélénium ont montré une activité antiproliférative et apoptotique sur des

lignées de cancers du sein (Chen et coll., 2009).

Les espèces du groupe des dinoflagellés sont les plus intéressantes. En effet, elles partagent de

nombreux métabolites uniques avec les cyanobactéries (Shimizu, 2003). Ces microalgues

sont également connues pour former des « bloom » toxiques, et produisent de nombreux

métabolites secondaires, comme des composés hétérocycliques, des éthers polycycliques, des

polyketides et des macrolides (Shimizu, 2003).

Les amphidinolides, macrolides produits par les dinoflagellés du genre Amphidinium ont des

propriétés antitumorales. Ils sont cytotoxiques sur les cellules de lymphome murin L210, et

les cellules cancéreuses de l’épiderme KB (Kobayashi et coll., 1994; Kobayashi &

Ishibashi, 1997 ; Tsuda et coll., 2000). Un composé dérivé, le caribenolide I, montre une

forte cytotoxicité contre la lignée de cancer du colon HCT 116 (Daranas et coll., 2001;

Kobayashi & Ishibashi, 1997 ; Camacho et coll., 2007). La structure chimique de

l’amphidinolide A et du caribenolide I sont présentés sur la figure 25.

Figure 25: Structure chimique de l’amphidinolide A (A) (Kobayashi et coll., 1994) et du

caribenolide I (B) (Kobayashi & Ishibashi, 1997).

En 2008, Andrianasolo et coll. ont isolés deux monoacylgalactosyl diacylglycérols de la

diatomée Phaeodactylum tricornutum capables d’induire l’apoptose sur des cellules

épithéliales de souris (W2).

Par ailleurs, des extraits d’espèces du genre Chlorella ont montré des activités

antiprolifératives sur les lignées H1299, A549, et H1437 de cancer du poumon (Wang et


50

coll., 2010) et une activité antiproliférative et apoptotique sur la lignée de cancer du colon

HCT116 (Cha et coll., 2008).

III.4.2. Activités anticancéreuses de pigments de microalgues

Les microalgues ont un grand potentiel pour la production de molécules bioactives d'intérêt

pharmaceutique (Leya et coll., 2009 ; Bhatnagar & Kim, 2010 ; Guedes et coll., 2011 ;

Nappo et coll., 2012 ; Talero et coll., 2012). En particulier, les pigments des microalgues

protègent les cellules normales des dommages génétiques et exercent des activités

antiprolifératives, cytotoxiques et pro-apoptotiques sur les cellules cancéreuses, ce qui

suggère leur utilisation pour la prévention ou la chimiothérapie du cancer (Moreau et coll.,

2006; Pasquet et coll., 2011 ; Gagez et coll., 2012).

En 2006, Moreau et coll. ont montré que la fucoxanthine isolée à partir d’un extrait

dichlorométhanique d’Odontella aurita présentait un potentiel antiprolifératif et apoptotique

sur des lignées de cancer du poumon NSCLC-N6 et A549.

Une étude menée par Pasquet (2011) a conduit à l’isolement de la violaxanthine à partir d’un

extrait acétonique de Dunaliella tertiolecta, et à la démonstration de son activité

antiproliférative, cytotoxique, pro-apoptotique et pro-nécrotique sur la lignée cellulaire de

cancer du sein MCF-7.

L'activité biologique des pigments des microalgues est expliquée par une variété d'actions

physico-chimiques et pharmacologiques (Gagez et coll., 2012). La plupart exercent des

activités antioxydantes, protègent les cellules des UV ou des altérations de l'ADN induites par

les ERO (Espèces Réactives de l’Oxygène) et limitent l'inflammation et la mutagenèse.

Certains pigments traversent les membranes lipophiles et peuvent interagir avec des protéines

membranaires impliquées dans la résistance multi-médicamenteuse des cellules cancéreuses,

ou dans l'apoptose. Certains inhibent également les ADN polymérases ADN-dépendantes, ou

interférent avec les principales voies contrôlant la survie cellulaire et l'activation de la

transcription des gènes impliqués dans l'apoptose. L'activité anticancéreuse de pigments de

microalgues peut également être liée à leur activité angiostatique et leur capacité à stimuler

des réponses immunitaires antitumorales (Baudelet et coll., 2013). Enfin, l’effet des pigments

de microalgues comme agents inducteurs de mort cellulaire, anti-métastatique , ou inhibiteurs

de l’invasion ou la motilité des cellules cancéreuses, reste à établir et fait l’objet de nombre de

recherches.


51

IV. LES MICROALGUES, UNE ALTERNATIVE EN CONFORMITE AU EXIGENCE

DE LA RECHERCHE

Bien que de nombreuses avancées ont été réalisées dans le domaine de la biomédecine et des

sciences pharmaceutiques, à ce jour, très peu de produits naturels ont été approuvés et

commercialisés. Le développement de nouvelles drogues anti-tumorales provenant de sources

naturelles rencontre, dans certains cas, des problèmes qui ne sont pas habituellement

rencontrés lorsque l'on traite des composés synthétiques. De nombreuses raisons peuvent

affecter le développement de la recherche d’anti-tumoraux d’origine marine dont :

-les difficultés d'accès à la source des échantillons, et les problèmes associés à la récolte du

produit marin,

-les troubles dans la synthèse de quantités nécessaires du composé,

-les difficultés dans les procédures d'isolement et de purification dues à la grande diversité

structurale des composés naturels marins (Bhatnagar & Kim, 2010).

Toutefois, les microalgues présentent l’avantage d’être cultivables en bioréacteurs (Olaizola,

2003). On peut ainsi en obtenir une quantité importante en biomasse sans porter atteinte à la

biodiversité marine, et ce tout en répondant aux contraintes écologiques.

D’autant plus que les microalgues marines, de par leur grande biodiversité, présentent un

vivier de molécules à explorer. Parmi les quatre lignées d’algues existantes, seule la lignée

verte a quitté le milieu marin. Les algues rouges et brunes n’ont aucun équivalent terrestre et

leurs métabolites sont souvent originaux (Kornprobst, 2005). Compte tenu de la quantité

d’espèces microalgales non étudiées, du manque de données précises sur leur composition

biochimique, les microalgues marines apparaissent ainsi comme un champ d’investigation

majeur pour la mise en évidence et la découverte de molécules originales utilisables en

cancérologie.

Chapitre II Matériel & Méthodes

52

CHAPITRE II :

MATÉRIEL & MÉTHODES


53

I. Préparation des extraits de Nannochloropsis gaditana

La microalgue Nannochloropsis gaditana est sélectionnée pour l’évaluation de son effet

antioxydant et antiprolifératif sur des cellules cancéreuses. Cette espèce est fournie par le

laboratoire Partisano Biotech (Sidi Bel Abbes, Algérie). Les microalgues sont envoyées sous

forme lyophilisée à notre laboratoire.

Les extractions sont ainsi réalisées à partir de la biomasse algale lyophylisée de N.gaditana en

utilisant des solvants de polarités différentes (annexe 1), à savoir, l’acétone, le méthanol, le

dichlorométhane, l’hexane, et l’eau pure. Ces extractions ont pour but d’essayer de couvrir

tout le spectre de polarité des différentes molécules de la microalgue.

Les extraits sont préparés selon la procédure décrite par Li et coll. (2007) avec quelques

modifications, par macération de 2g de biomasse lyophilisée dans 40ml de solvant. La

macération est réalisée à 20°C, sous agitation magnétique, pendant 1h pour l’extrait

acétonique et 2 heures pour les autres extraits (Pasquet, 2011). Afin de préserver les pigments

photosynthétiques de la photo-oxydation, l’extraction est réalisée à l’obscurité. Après

macération, l’extrait obtenu est séparé des microalgues par centrifugation à 45000g pendent

10min suivie d’une filtration sur un filtre Whatman standard. Le filtrat de l’extrait aqueux est

concentré avec un lyophilisateur (TELSTAR CRYODOS–50). Tandis que pour les autres

extraits le solvant des filtrats est concentré par évaporation au nitrogène. Les extraits secs

obtenus sont conservés à -20°C et à l’obscurité.

I.1. Calcul du rendement d’extraction

Le rendement d’extraction est calculé à partir de l’équation suivante :

m extrait : La masse de l’extrait. m microalgue : La masse d initiale de la microalgue Nannochloropsis gaditana (2g).


54

II. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits de Nannochloropsis gaditana

Dans le but de valoriser Nannochloropsis gaditana comme source d’antioxydants

naturels, nous avons déterminé la composition biochimique en phénols totaux de ses

extraits, et nous avons évalué leur activité antioxydante par deux méthodes : le test

de piégeage du radical libre DPPH• (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl) et le test de la

réduction du fer.

L’extrait aqueux est resolubilisé dans l’eau pure, tandis que les autres extraits sont

resolubilisés dans l’éthanol absolu (Li et coll., 2007).

II.1. Dosage des phénols totaux

II.1.1. Principe

Le dosage des phénols totaux a été effectué avec le réactif colorimétrique Folin-Ciocalteu

selon la méthode cité par Singleton & Rossi (1965). Le réactif de Folin Ciocalteu est un acide

de couleur jaune constitué par un mélange d'acide phosphotungstique (H3PW12O40) et d'acide

phosphomolybdique (H3PMo12O40). Il est réduit, lors de l'oxydation des phénols, en un

mélange d'oxydes bleus de tungstène et de molybdène dans une solution alcaline (Ribereau,

1968). La coloration produite, dont l'absorption maximum est à 765 nm, est proportionnelle à

la quantité de polyphénols présents dans l’échantillon.

II.1.2. Démarche expérimentale

Un volume de 200μl de chaque extrait dissous dans l’éthanol pour une concentration de 50

mg/ml est ajouté à 1ml de réactif de Folin-Ciocalteu dilué (1:10). Après une incubation de 4

minutes, 800 μl de la solution de carbonate de sodium Na2CO3 (75g /l) sont auditionnés.

Après 2 heures d'incubation dans l'obscurité à température ambiante. L'absorbance de tous les

extraits est mesurée par un spectrophotomètre (Optizen 1412V) à 765 nm. Une courbe

d’étalonnage est réalisée avec de l’acide gallique pour des concentrations allant de 0 à 180

μg/ml. La concentration des phénols totaux est calculée à partir de l’équation de la régression

linéaire et exprimée en microgrammes équivalents d’acide gallique par gramme de matière

sèche (μg EAG/g M.S). L'expérience a été répétée trois fois et les résultats sont exprimés

comme une valeur moyenne ± écart type (n = 3).


55

II.2. Test de piégeage du radical libre DPPH•

L'activité de piégeage des radicaux libres par les extraits de N.gaditana est mesurée en

employant le radical libre DPPH• (2.2 diphenyl 1 picryl hydrazyl) (C18H12N5O6) qui est l'un

des principaux tests employés pour explorer l'utilisation des extraits d’algues comme

antioxydants.

II.2.1. Principe

Le DPPH• (2.2 diphenyl 1 picryl hydrazyl) (Figure 26) est un radical de couleur violette qui

absorbe entre 514 à 518nm. En présence de composés antiradicalaires, le DPPH• est réduit en

2.2 diphényl 1 picryl hydrazine de couleur jaune (Molyneux, 2004 ; Maataoui et coll., 2006).

Figure 26: Forme libre et réduite du DPPH (Molyneux, 2004).

Le radical DPPH• est réduit par l'antioxydant (AH) selon la réaction suivante (Celiktas et

coll., 2007):

DPPH• + AH DPPH-H + A•


L’effet des extraits de N.gaditana sur le DPPH• est mesuré selon la procédure décrit par

Sanchez-Moreno et coll. (1998). Un volume de 50µl de chaque extrait utilisé à trois

concentrations (10, 30 et 50 mg/ml) est ajouté à 1,95 ml de la solution méthanolique du DPPH

(0,025g/l) préparée extemporanément. Un contrôle négatif est préparé en mélangeant 50µl de

méthanol et 1,95 ml de la solution méthanolique de DPPH. Après une incubation de 30min à

l'obscurité et à température ambiante, l'absorbance est mesurée par un spectrophotomètre

(Optizen 1412V) à 515nm contre un blanc préparé pour chaque concentration de chaque


56

extrait qui contient 50µl de l’extrait et 1,95 ml de méthanol. L'acide ascorbique et le BHT

(hydroxytoluène butylé) (20-300μg/ml) sont utilisés comme références. L'expérience est

répétée trois fois et les résultats sont exprimés comme une valeur moyenne ± écart type (n =

3).

II.2.3. Expression des résultats

Les absorbances mesurées servent à calculer le pourcentage de piégeage du radical DPPH• ;

qui est proportionnel au pouvoir antiradicalaire de l’extrait. Le pourcentage de piégeage des

radicaux libres est exprimé selon l’équation suivante:

% = [(A517nm contrôle - A517nm extrait)/A517nm contrôle] x 100.

Où:

A517nm contrôle = Absorbance du contrôle négatif à 517nm

A517nm extrait = Absorbance de l’extrait à 517nm

La EC50 (concentration efficace médiane), est la concentration de l'extrait permettant 50 % de

piégeage des radicaux DPPH•. Elle est calculée à partir de la régression linéaire des courbes

des pourcentages de piégeage des radicaux libres en fonction des concentrations de l’extrait

[% piégeage = f (concentrations)].

II.3.Test de la réduction du fer

II.3.1. Principe

Le test de la réduction du fer permet de mesurer la capacité des extraits testés à réduire le fer

ferrique (Fe3+) présent dans le complexe K3Fe(CN)6 de ferricyanure de potassium en fer

ferreux (Fe2+), en présence d’un antioxydant qui a la capacité à céder un électron

(Oyaizu,1986). Par conséquent, le Fe2+ peut être évalué en mesurant et en surveillant

l'augmentation de la densité de la couleur bleu vert dans le milieu réactionnel à 700 nm. Une

augmentation de l’absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur.


Le pouvoir de la réduction du fer des extraits de N.gaditana est évalué selon la méthode

décrite par Oyaizu (1986). 500 µl de chaque extrait utilisé à trois concentrations (10, 30 et 50

mg/ml) sont mélangés avec 500 µl de tampon phosphate de sodium (0,2 M, pH=6,6) et 500 µl


57

de ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) à 1%. Le mélange est incubé au bain-marie à 50°C

pendant 20 min. Après incubation, 500 µl d'acide trichloroacétique à 10 % sont ajoutés pour

stopper la réaction. Après une centrifugation à 650g pendant 10 min, 500 µl de surnageant

sont mélangés avec 500 µl d'eau pure et 100 µl de chlorure fer (FeCl3) à 0,1 % préparé

extemporanément. L'absorbance est mesurée par un spectrophotomètre (Optizen 1412V) à

700 nm. L'acide ascorbique et le BHT (hydroxytoluène butylé) (20-300μg/ml) sont utilisés

comme références. L'expérience est répétée trois fois et les résultats sont exprimés comme

une valeur moyenne ± écart type (n = 3).

II.3.3. Expression des résultats

La valeur EC50 (concentration efficace médiane) est la concentration de l’extrait qui

correspond à une absorbance égale à 0,5 et est calculée à partir de la régression linéaire de la

courbe de l’absorbance en fonction de la concentration de l’extrait.

III. Evaluation de l’activité antiproliférative des extraits des Nannochloropsis gaditana

L’activité antiproliférative des cinq extraits N. gaditana est déterminée par l’utilisation du

MTT (bromure de 3-(4,5-diMethylThiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium). Ce test est réalisé

sur une lignée de cancer bronchique : la lignée A549.

III.1.Principe du test MTT

L’activité antiproliférative des extraits est déterminée par l’utilisation du MTT

(bromure de 3-(4,5-diMethylThiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium). Ce test donne

une indication du fonctionnement mitochondrial. Il consiste à mesurer l'activité de la

succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. Cette enzyme, par

coupure du cycle tétrazolium, transforme le MTT, de couleur jaune, en cristaux de

formazan bleus (figure 27). Après dissolution dans l’isopropanol ou le DMSO

(Diméthylsulfoxyde) des cristaux, une lecture spectrophotométrique est réalisée à

550 nm (Mosmann, 1983). Les absorbances obtenues sont directement

proportionnelles au nombre de cellules vivantes.


58

Figure 27 : Action de la succinate déshydrogénase sur le MTT. Coupure du cycle tetrazolium conduisant à des cristaux de formazan (Mosmann, 1983).

III.2. La lignée A549

La lignée A549 est issue d'un adénocarcinome d'épithélium pulmonaire prélevé chez un

patient de 58 ans (Giard et coll., 1973). Elle est conservée dans la banque de lignées du NCI

(réf. Collection ATCC n°CCL-185). Il s'agit d'une lignée hypotriploïde qui possède 24% de

cellules à 12 chromosomes, 22% à 64 chromosomes, les autres cellules étant diploïdes. La

lignée est tumorigène chez la souris nude et a conservé le type sauvage du gène p53. La figure

28 est une observation microscopique (×200) de la lignée A549, dans son milieu de culture,

fixée sur support solide.

Figure 28 : Observation microscopique (x200) de la lignée A549 en croissance normale, dans son milieu de culture, fixée sur support solide (Pasquet, 2011).

III.3. Culture et entretien de la lignée cellulaire A549

Les cellules cancéreuses sont cultivées en flasques à bouchon filtrant, 75 cm2 dans 15 ml

milieu de culture RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) 1640 additionné de 10%

de SVF (Sérum de Veau Fœtal), 1% d'antibiotiques (10000U pénicilline.ml-1 et 10 mg

streptomycine.ml-1).


59

Les cellules sont incubées à 37°C sous une atmosphère contrôlée à 5% de CO2 et 95%

d'humidité. Le milieu de culture est renouvelé tous les deux jours afin que les nutriments du

milieu ne deviennent pas limitant pour le bon développement des cellules. De la trypsine (1X)

est utilisée pour décrocher les cellules de leur support afin de procéder aux différentes

expérimentations ou pour réaliser les repiquages.

Après récupération des cellules, la concentration cellulaire est déterminée par un comptage à

la cellule de Mallassez. Les A549 sont utilisées à une concentration de 105cellules/ml.

III.4. Protocole d’évaluation de l’activité antiproliférative des extraits (Mosmann, 1983)

L’évaluation de l’activité antiproliférative des extraits de N.gaditana sur la lignée cancéreuse

A549 est réalisée au niveau du Laboratoire National de Contrôle des Produits

Pharmaceutiques (LNCPP) d’Alger.

J-1: Dépôt des cellules en plaques 96 puits

Le milieu de culture contenant les cellules est déposé dans des plaques à raison de 100 μl dans

chaque puits. Les cellules sont utilisées à une concentration de 105 cellules/ml équivaut à 104

cellules/100µl. Les plaques sont incubées 24h à 37°C sous une atmosphère contrôlée à 5% de

CO2 et 95%d’humidité.

J0: Dépôts des extraits

Des solutions mères à 1mg/ml sont préparées, par solubilisation des extraits acétonique,

méthanolique, dichlorométhanique et hexanique dans le DMSO à 1%. L’extrait aqueux est

solubilisé dans l’eau distillée stérile.

Les extraits ont par la suite été dissous dans le milieu de culture RPMI 1640 pour obtenir

différentes concentrations (5 µg.ml-1, 10 µg.ml-1, 25 µg.ml-1, 50 µg.ml-1, 75 µg.ml-1, 100

µg.ml-1et 150 µg.ml-1).

Pour chaque extrait 100µl des différentes dilutions sont déposés dans chaque puits.

Les plaques sont laissées à incuber pendant 72h à 37°C sous une atmosphère contrôlée à 5%

de CO2 et à 95% d’humidité.

J 3: Révélation de la croissance

Après 72h d’incubation, le MTT dilué à 5mg.ml-1 dans du tampon PBS (pH = 7,4 ; 0,1 M)

puis au 1/10 dans le milieu culture RPMI 1640, est déposé à raison de 100μl dans chaque


60

puits. Les plaques sont incubées pendant 3h à 37°C sous une atmosphère contrôlée à 5% de

CO2 et à 95% d’humidité.

Le milieu de culture est retiré, et les cristaux de formazan sont dissous dans 100μl

d’isopropanol. L’absorbance dans chaque puits est mesurée à 550 nm par un lecteur de

microplaques (TECAN Sunrise™) après 1h d’incubation.

III.5. Expression des résultats et détermination des CI50

Les CI50 (concentration inhibant 50% de la croissance cellulaire) sont calculées pour 72h

d’incubation des cellules, en phase exponentielle de croissance. La détermination des CI50 se

fait en deux temps:

Les pourcentages de croissance pour chacune des concentrations sont déterminés à

partir de l’équation suivante :

: Pourcentage de croissance des cellules en présence d’une concentration donnée en

extrait.

: Absorbance mesurée à 550 nm après 72h d’incubation des cellules en présence

d’une concentration donnée en extrait.

: Absorbance mesurée à 550 nm après 72h d’incubation des cellules en

absence d’extrait (témoin).

: Concentration en extrait.

La CI50 est ensuite estimée graphiquement sur la courbe :

IV. Analyses statistiques

Les résultats des tests effectués sont exprimés en moyenne ± écart type (± SD). Les

comparaisons multiples et la détermination des taux de signification sont faites par le test

ANOVA univarié suivi par le test de Tukey en utilisant logiciel de statistiques (Statistica). Les

différences sont considérées statistiquement significatives au seuil de 0,05 (P <0,05).

% Cx croissance = Log (C)


61

V. Caractérisation de l’extrait à activité antiproliférative

Après avoir évalué l’activité antiproliférative sur les cellules cancéreuses, l’extrait brut

présentant la meilleure activité, c'est-à-dire la CI50 la plus faible, est sélectionné. Dans le but

de caractériser les différentes molécules présentes dans cet extrait, diverses techniques

analytiques sont réalisées. Ici nous avons ciblé les pigments de N.gaditana, compte tenu de

leur activité antiproliférative largement mise en évidence dans diverses études (Moreau et

coll., 2006; Pasquet et coll., 2011 ; Gagez et coll., 2012, Baudelet et coll., 2013).

L’extrait est ainsi soumis à une analyse qualitative par chromatographie sur couche mince

(CCM), une spectrométrie par infrarouge et une chromatographie liquide à haute performance

(HPLC) analytique.

V.1. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)

L’analyse par CCM permet d’établir une identification primaire des différents constituants de

l’extrait par le calcule du rapport frontal (Rf).

V.1.1.Démarche expérimentale

L’extrait de N.gaditana présentant la meilleure activité antiproliférative sur les cellules

cancéreuses est solubilisé dans 1 ml d’acétone, avant d’être soumis à une analyse par CCM.

La phase stationnaire ou l’adsorbant est une plaque de silice. La phase mobile ou l’éluant est

un mélange d’éther de pétrole (40-60°C) : acétone : i-propanol 71:28 :1 (v/v/v) (Jeffrey,

1997). La migration est réalisée dans une cuve à l’abri de la lumière.

V.1.2. Calcul du rapport frontal (Rf)

On appelle rapport frontal (Rf) d'une espèce chimique, le rapport entre la distance x parcourue

par l'espèce et la distance y parcourue par l'éluant pendant le même temps. Rf dépend de la

nature du produit, de l'éluant et de la phase fixe.

Le Rf (rapport frontal ou rétention frontale) est caractéristique d’un produit dans un éluant

donné et pour une phase stationnaire donnée.


62

V.2. Analyse par spectrométrie infrarouge

V.2.1. Principe

La spectroscopie d'infrarouge (IR) permet de déterminer la présence de groupements

fonctionnels dans les molécules organiques, et les structures dans certaines molécules simples.

Elle est basée sur l’interaction de la lumière IR avec le nuage électronique des liaisons

chimiques. Le rayonnement infrarouge dispense suffisamment d’énergie pour stimuler les

vibrations moléculaires à des niveaux d’énergie supérieurs. La spectrométrie infrarouge

permet ainsi de mesurer la diminution de l’intensité du rayonnement qui traverse un

échantillon en fonction de la longueur d’onde.

V.2.2. Démarche expérimentale

Avant de procéder à l’analyse par infrarouge, l’extrait de N.gaditana est soumis à une

séparation par chromatographie sur couche mince, chaque bande qui apparait sur la plaque de

silice est récupérée et analysée par spectroscopie infrarouge. L’analyse est réalisée par

l’équipe du professeur Benguedache au niveau du laboratoire de chimie des matériaux de

l’université d’Oran 1 Ahmed Ben Bella.

La technique employée pour l’analyse de nos échantillons par spectroscopie IR utilise un

appareil de type Alpha Bruker, selon un procédé par réflexion de type ATR (Attenuated Total

Reflection) ou réflexion totale atténuée, dans le moyen infrarouge (2,5 à 25 μm soit 4000-500

cm-1).

Les spectres représentent la transmittance (T%) en fonction du nombre d'onde (cm-1). La

transmittance est égale au pourcentage de rayonnement ayant traversé la cellule de mesure par

rapport au rayonnement incident. Quant au nombre d'ondes, il est égal à l'inverse de la

longueur d'onde.

V.3. Analyses par HPLC analytique

L’analyse par HPLC analytique nous permet d’établir une étude qualitative et de caractériser

les molécules présentes dans l’extrait portant l’activité antiproliférative. Celle-ci est réalisée

au niveau du Centre de Recherche et d’Analyses Physico-Chimiques (CRAPC) de Bou-

Ismail, Tipasa.


63

V.3.1. Démarche expérimentale

Les extraits sont solubilisés dans l’éthanol 70 et filtrés sur une membrane PVDF de 0.2 μm

afin d’éliminer les débris cellulaires. Pour analyser les extraits, une HPLC (YL-Clarity)

équipée d’une pompe (Waters, W600), d’un injecteur (Waters, W717) et d’un détecteur

PDA (Waters, W486) est utilisée en phase inverse, avec une colonne analytique

Phenomenex Luna C18 (2) (250 mm x 4,6mm, 10 µm), avec thermostat réglé à 20°C . Le

PDA permet de détecter les molécules absorbant pour des longueurs d’onde comprises

entre 190 et 600 nm. Les longueurs d’onde choisies pour l’analyse sont de 290nm et 435

nm. Les pigments ont été séparés dans des essais indépendants réalisés en triplicata. Le débit

de la phase mobile est de 1ml.min-1. Le gradient des solvants utilisés est dérivé de la

méthode de Jeffrey et al et est présenté dans le tableau 5. Il s’agit du gradient utilisé pour

l’analyse des différents extraits de microalgues. Ce gradient est constitué de trois solvants :

méthanol/eau (80/20), acétonitrile/eau (90/10) et acétate d’éthyle. Le volume injecté pour

les différentes analyses est compris entre 10 à 50µl.

Tableau 5 : Colonnes et Gradients de solvants utilisés en HPLC analytique

A : méthanol/eau (80/20)

B : acétonitrile/eau (90/10)

C : acétate d'éthyle

Temps (min)

Débit analytique (ml.min-1)

Solvants

%A %B %C

0 1 100 0 0

3 1 0 100 0

35 1 0 30 70

38 1 0 0 100

41 1 0 0 100

43 1 0 100 0

45 1 100 0 0

47 1 100 0 0

Chapitre III Résultats & Discussion

64

CHAPITRE III :

RÉSULTATS & DISCUSSION


65

I. Rendement d’extraction

Les paramètres les plus importants conduisant à la sélection d’une méthode d’extraction sont

généralement liés :

§ aux caractéristiques biochimiques de la molécule à extraire,

§ à la rapidité de la méthode d’extraction,

§ aux quantités de solvants utilisées,

§ à la reproductibilité et à la répétabilité de la technique,

§ aux rendements d’extraction obtenus,

§ à la limitation de la dégradation des molécules extraites,

§ au dimensionnement, au coût et à la facilité du procédé (Rodríguez Bernaldo de

Quirós & Costa, 2006 ; Wang & Weller, 2006).

Pour notre étude, nous avons opté pour une extraction par macération. Cette méthode est la

plus utilisée pour l’extraction des pigments de microalgues marines (Jeffrey et coll., 1997).

Elle est simple et très avantageuse lorsqu’il faut préparer un grand nombre d’échantillons.

Nous avons ainsi obtenu cinq extraits par macération de la biomasse algale de N.gaditana

dans l’acétone, le méthanol, l’hexane, le dichlorométhane et l’eau pure. Cependant les

rendements d’extraction variant entre 9.07% et 52.57% (tableau 6) restent relativement

faibles.

Tableau 6: Données concernant la concentration, la masse et le rendement d’extraction des cinq extraits de N.gaditana.

Extrait Concentration (mg.ml-1)

Masse (g) Rendement (%)

Acétonique (Ac) 84 0.32 16.06

Méthanolique (Met) 75 1.051 52.57

Dichlorométhanique (DCM) 130 0.315 15.75

Hexanique (Hex) 92 0.090 9.07

Aqueux (AQ) 67 0.54 27.27

La majorité des méthodes d’extraction sensées améliorer le rendement sont destructives pour

les microalgues, comme le « bead beating », la sonication (Rostagno et coll., 2007), ou alors


66

les méthodes consistant à réaliser un choc osmotique permettant la libération dans le milieu

extérieur du contenu intracellulaire de la microalgue (Jeffrey et coll., 1997).

L’utilisation du CO2 supercritique pour extraire des lipides, des pigments ou des composés

bioactifs à partir de plantes (Jaren-Galan et coll., 1999; Kim et coll., 2005) ou de

microalgues a été décrite comme très efficace, malgré son coût élevé (Mendes et coll., 2003;

Macías-Sánchez et coll., 2005; Macías-Sánchez et coll., 2007; Mendiola et coll., 2007 ;

Klejdus et coll., 2009; Macías-Sánchez et coll., 2009a; Macías-Sánchez et coll., 2009b).

Cette technique reste une technique d’extraction de référence surtout lorsqu’il s’agit d’extraire

des molécules à visée thérapeutique.

II. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits de Nannochloropsis gaditana

II.1.Dosage des phénols totaux

Les composés phénoliques constituent un groupe de métabolites secondaires aux divers vertus

thérapeutiques, avec des effets anti-inflammatoires, anti-athérosclérose et anti-cancérigènes

(Chung et coll., 1998). Ces composés sont surtout réputés pour leur effet antioxydant, dû à

leurs propriétés d’oxydo-réduction (figure 15), qui leur permettent d'agir comme agents

réducteurs, donneurs d'hydrogènes, piégeurs de radicaux libres, désactivateurs de l’oxygène

singulet et chélateurs de métaux (Gilioli et coll., 2007).

Les composés antioxydants des microalgues peuvent être de polarités très différentes, et par

conséquent, nous avons choisi de les extraire par des solvants de polarités croissantes (annexe

1).En outre, nombre de rapports sur l'évaluation de l'activité antioxydante des microalgues,

ont conclu que plusieurs genres de microalgues contiennent des antioxydants puissants, à la

fois de nature lipophile et hydrophile (Miranda et coll., 1998; Guzman et coll., 2001; Jaime

et coll., 2005; Wu et coll., 2005; Herrero et coll., 2006; Rao et coll., 2006 ; Cerón et coll.,

2007 ; Li et coll., 2007; Mendiola et coll., 2007; Goh et coll., 2010).

La teneur en composés phénoliques des extraits de N.gaditana (figure 29b) est déterminée

afin d'évaluer l’impact des ces molécules sur l'activité antioxydante et antiproliférative de

l'extrait, et identifier ainsi une source naturelle de composés phénoliques. La concentration

des phénols totaux est calculée à partir de l’équation de la régression linéaire de la courbe

d’étalonnage (figure 29 a) et est exprimée en microgrammes équivalents d’acide gallique par

gramme de matière sèche (μg EAG/g M.S).


67

Figure 29: (A) Courbe d’étalonnage de l’acide gallique et (B) teneur en composés phénoliques dans les extraits de N.gaditana; (Ac): extrait acétonique, (Met): extrait méthanolique, (DCM): extrait dichlorométhanique, (Hex): extrait hexanique et (AQ): extrait aqueux. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3).

A partir de la figure 29, nous constatons que la variation de la teneur en composés

phénoliques dans les cinq extraits de N.gaditana est relativement importante, mais

statistiquement non significative (P> 0,05). L'extrait aqueux et l'extrait méthanolique

présentent la plus grande concentration en phénols (tableau 7), avec respectivement 3,84 ±

0,12 μg EAG/g M.S, et 3,33 ± 1,00 μg EAG/g M.S, suivi par l'extrait hexanique (1,74 ± 0.04

μg EAG/g M.S) et l'extrait dichlorométhanique (1,40 ± 0,02 μg EAG/g M.S). Cependant,

l'extrait acétonique révèle la plus faible teneur en phénols avec 1,12 ± 0,09 μg EAG/g M.S.

Tableau 7: La teneur en composés phénoliques dans les extraits de N.gaditana. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3).

Les résultats de la présente étude révèlent que parmi tous les solvants d'extraction utilisés,

l’eau pure s’avère être le meilleur extracteur des phénols. Cela est lié au fait que les composés

phénoliques sont typiquement des composés polaires (Goiris et coll., 2012) et sont donc

y = 0,0057x + 0,0165

R² = 0,9935

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

-50 0 50 100 150 200

76

5n

m

Concentration acide gallique (µg.ml-1)

A

0

1

2

3

4

5

Ac Met DCM Hex AQ

Ten

eur

en p

héno

ls (

µg

EA

G/g

M.S

)

B

Extrait Teneur en phénols µg EGA/g M.S

Acétonique (Ac) 1.12 ± 0.09

Méthanolique (Met) 3.33 ±1.00

Dichlorométhanique (DCM) 1.40 ± 0.02

Hexanique (Hex) 1.74 ± 0.04

Aqueux (AQ) 3.84 ± 0.12


68

extraits en quantités plus élevées par les solvants les plus polaires (Anwar et coll., 2006 ;

Siddhuraju et coll., 2007 ; Sultana et coll., 2007).

En tenant compte de l’effet des composés phénoliques sur les cellules cancéreuses largement

évoqués dans diverses études (Kelloff et coll., 1994 ; Jang et coll., 1997 ; Fukai et coll.,

2000 ; Rodríguez et coll., 2013), l'amélioration des systèmes de l’extraction des antioxydants

naturels et des polyphénols pour augmenter leur biodisponibilité, leur efficacité et leur

stabilité, sont nécessaires afin de rendre possible l'utilisation en milieu clinique.

II. 2. Test de piégeage du radical libre DPPH•

L'activité de piégeage des radicaux libres DPPH• a été largement utilisée pour déterminer

l'activité antioxydante de différentes matrices (Oliveira et coll., 2007 ; Pereira et coll.,

2007 ; Oliveira et coll., 2008 ; Sousa et coll., 2008).

La figure 30 (A) illustre l'activité de piégeage du radical DPPH• par les extraits N.gaditana.

Dans le tableau 8, nous présentons les valeurs des EC50 relatives à cette activité. Compte tenu

de la quantité insuffisante des extraits, les graphes sont tracés à partir de trois points

seulement, représentant l’activité des extraits à trois concentrations différentes, en

l’occurrence à 10, 30 et 50 mg.ml-1. A 50mg.ml-1, l'action de piégeage est plus élevé dans

l'extrait aqueux (69,97 %) que dans l'extrait méthanolique (47,59 %) et l'extrait acétonique

(44.90 %). L'extrait dichlorométhanique (19,47 %) et l’extrait hexanique (14,90 %) révèlent

une activité antioxydante beaucoup plus faible.


69

Figure 30: Activité de piégeage du radical DPPH• (%): (A) par les extraits de N.gaditana, (B) par l’acide ascorbique et le BHT. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3). Ces extraits ne montrent pas de différence significative dans leur activités (P = 0,97).

Cependant, l'extrait aqueux se démarque des autres extraits avec une valeur P = 0,0018. Il faut

noter que tous ces extraits ont une action de piégeage inférieure à celle de l'acide ascorbique

et du BHT (utilisés comme références), qui présentent un effet antioxydant très fort à

y = 0,6508x + 13,794 R² = 0,9727

y = 0,929x + 1,2088 R² = 0,9384

y = 0,3589x + 1,7511 R² = 0,9971

y = 0,0422x + 12,974 R² = 0,8775

y = 1,4555x - 8,9253 R² = 0,8838

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50 60

Pou

rcen

tage

de

pié

geag

e d

u r

adic

al D

PP

H

Concentration mg.ml-1

Met Ac DCM Hex AQ

y = 0,2384x + 28,875 R² = 0,9338

y = 0,216x + 42,838 R² = 0,8309

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400

% d

e pi

égag

e du

rad

ical

DP

PH

Concentration (µg.ml-1)

BHT

Acide ascorbique

B

A


70

300µg.ml-1 (Figure 30 B), avec respectivement 96,23 % et 93 %. Les cinq extraits de

N.gaditana ont de ce fait présenté une différence significative par rapport à ces deux

références.

Il est important de souligner que le piégeage des radicaux libres par des antioxydants est

tributaire de deux types de mécanismes: la libération de l’atome d’hydrogène du groupement

hydroxyle (cinétique rapide de certaines acides et dérivées phénoliques) ; et la libération d’un

électron (cinétique lente des dérivées glycosylées et des anthocyanes) (Nanjo et coll., 1996 ;

Huang et coll., 2005).

Dans le cas des composes phénoliques (Φ-OH), le mécanisme principal d’action est le

piégeage des radicaux libres par le transfert d’un atome d’hydrogène sur le DPPH• alors

transformé en une molécule stable DPPHH (Sanchez-Moreno, 1998 ; Molyneux, 2004) :

DPPH•+ ΦOH → DPPHH + ΦO•

L'extrait aqueux a présenté la plus grande concentration en composés phénoliques (3,84 ±

0,12 µg EAG/g M.S) et l'effet de piégeage des radicaux DPPH• le plus élevé (tableau 8) (EC50

= 2.52 mg.ml-1), on peut donc supposer que les composés phénoliques sont à l'origine de cette

activité via le transfert d'atomes d'hydrogène.

Tableau 8: Valeurs des EC50 en mg.ml-1 des extraits de N.gaditana pour le piégeage du radical DPPH.

Extrait EC50 (mg.ml-1)*

Acétonique 3.12

Méthanolique 3.28

Dichlorométhanique 7.22

Hexanique 44.37

Aqueux 2.52

Acide ascorbique 0.03

BHT 0.08

*EC50 (mg.ml

-1): concentration efficace médiane, est la concentration qui permet 50 % de

piégeage des radicaux DPPH•.

Cependant, l'extrait acétonique qui ne présentait pas une forte concentration en composés

phénoliques (1,12 ± 0,09 µg EAG/ g M.S), révèle une bonne activité antioxydante sur le

radical DPPH• (tableau 8) (EC50 = 3.12 mg.ml-1). Ce qui revient au fait que chez les


71

microalgues, les composés phénoliques ne sont pas les seules molécules antioxydantes,

d'autres molécules tels que les caroténoïdes, les acides gras polyinsaturés et les

polysaccharides peuvent jouer un rôle important dans l'activité antioxydante (Chen, 1996 ;

Chen et coll., 2005).

Bien que les composés phénoliques peuvent être les principales molécules antioxydantes dans

de nombreuses espèces végétales comme les légumes, les fruits et les plantes médicinales

(Cai et coll., 2004; Soong & Barlow, 2004; Wong et coll., 2006), elles sont moins

importantes dans les microalgues, comme en témoigne la faible corrélation entre la capacité

antioxydante et la teneur phénolique (Li et coll., 2007; Goh et coll., 2010).

En effet des études ont comparé l'activité antioxydante et la teneur en composés phénoliques

dans des extraits fractionnées de quelques espèces de microalgues. Trois études ont montré

que les fractions qui étaient riches en composés phénoliques possèdent une capacité

antioxydante élevée (Jaime et coll., 2005; Geetha et coll., 2010; Hajimahmoodi et coll.,

2010), tandis que d’autres études ont révélé le contraire (Li et coll., 2007; Goh et coll., 2010).

Par ailleurs, l’activité antioxydante des composés phénoliques est dépendante de la nature, de

la structure chimique, et de la concentration et de ces molécules dans un extrait donné (Rice-

Evans et coll., 1996). Le type du solvant peut être un autre facteur affectant l'effet

antioxydant des extraits de microalgues (Khumpook et coll., 2012). L’intensité de l’activité

antioxydante des composés phénoliques dépend aussi de leur degré de polymérisation.

Généralement, les faibles degrés de polymérisation génèrent une meilleure activité

antioxydante (Li et coll., 2009).

II.3. Test de la réduction du fer

Pour caractériser d’avantage les propriétés antioxydantes de N.gaditana, nous avons testé le

pouvoir de réduction du fer de ses cinq extraits.

La figure 31 (A) illustre le pouvoir réducteur des extraits de N.gaditana en fonction de leur

concentration. Compte tenu de la quantité insuffisante des extraits, les graphes sont tracés à

partir de trois points seulement, représentant l’activité des extraits à trois concentrations

différentes, en l’occurrence à 10, 30 et 50 mg.ml-1. A 30 et 50 mg.ml-1, l'extrait méthanolique

présente la plus forte réduction du fer avec des valeurs de DO à 700nm égales à 1,22 et 1,84,


72

suivi dans l’ordre par l'extrait aqueux qui présente à ces mêmes concentrations, des DO égales

à 1,14 et 1,52, et l’extrait acétonique avec des DO égales à 1.02 et 1.25 . Ces extraits ne

montrent pas de différence significative dans leur activité (P>0,05). L’extrait

dichlorométhanique et l'extrait hexanique présentent une très faible activité par rapport aux

autres extraits. Le pouvoir de réduction du fer des cinq extraits est inférieure à celui du BHT

et de l'acide ascorbique (figure 31 B) et statistiquement très significative (P = 0,0001).

Figure 31: Pouvoir de réduction du fer: (A) par les extraits de N.gaditana, (B) par

l’acide ascorbique et le BHT. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ±

écart-type (n = 3).

y = 0,0355x + 0,101 R² = 0,9942

y = 0,0118x - 0,0231 R² = 0,972

y = 0,0017x - 0,0108 R² = 0,9411

y = 0,028x + 0,2016 R² = 0,9763

y = 0,0234x + 0,1621 R² = 0,9201

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60

DO

700

nm

Concentration mg.ml-1

Met DCM Hex AQ Ac

y = 0,006x + 0,019 R² = 0,973

y = 0,005x - 0,032 R² = 0,988

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 100 200 300 400

DO

700

nm

Concentration (µg.ml-1)

BHT

Acide ascorbique

B

A


73

Les EC50 en rapport avec cette activité sont indiqués dans le tableau 9. L'extrait aqueux et

l’extrait méthanolique, les plus riches en phénols, révèlent le meilleur pouvoir de réduction du

fer avec respectivement des EC50 égales à 1.03 mg.ml-1 et 1.06 mg.ml-1. Il est évident que

l’activité antioxydante de ces deux extraits est due à la présence de composés phénoliques qui

agissent comme des réducteurs et des inhibiteurs des oxydants, en raison de la présence d'un

groupement hydroxyle qui peuvent servir de donneur d'électrons (Siddhuraju & Becker,

2007).

Tableau 9: Valeurs des EC50 en mg.ml-1 des extraits de N.gaditana pour la réduction du fer.

Extrait EC50 (mg.ml-1)*

Acétonique 1.22

Méthanolique 1.06


Hexanique 15.5

Aqueux 1.03

Acide ascorbique 0.10

BHT 0.08

*EC50 (mg.ml-1

): concentration efficace médiane, est la concentration de l’extrait qui

correspond à une absorbance égale à 0,5.

Cependant, l’extrait acétonique a pour ce test aussi, révélé une activité antioxydante

considérable (EC50=1.22mg.ml-1) qui ne concorde pas forcément avec une concentration

élevée en phénols (1.12 ± 0.09 µg EAG/g M.S). Il apparait ainsi que cet extrait renferme

d’autres molécules antioxydantes qui restent à caractériser.

Il convient de souligner que les caroténoïdes représentent une classe importante

d’antioxydants issus des microalgues et qui contribuent de manière significative à la capacité

antioxydante totale des microalgues (Jahnke 1999; Takaichi 2011). Ces derniers jouent un

rôle important dans le piégeage des espèces réactives de l'oxygène générés lors de la

photosynthèse. L’activité antioxydante de ces molécules est liée à leur longue chaîne

polyénique qui leur permet de réagir avec les radicaux peroxyde (ROO•), hydroxyle (HO•),

ou superoxyde (O2•-) par simple addition électrophile et transfert d’électron. Ils permettent, en

particulier, de neutraliser l’oxygène singulet (1O2) (Valko et coll., 2006).


74

D’autres études ont relié la possibilité de prévention du cancer par des algues (Schwartz &

Shklar 1987 ; Fedkovic et coll., 1993), à leurs propriétés antioxydantes (Fedkovic et coll.,

1993). Boveris et Navarro (2008) ont démontré que la détoxication de corps des radicaux

libres, améliore la réponse au traitement anticancéreux. Selon Folmer et coll. (2010) les

antioxydants et les pigments naturels jouent un rôle important dans la chimioprévention du

cancer en empêchant les dommages cellulaires et en prévenant les altération de l’ADN.

Nos résultats témoignent du potentiel de N.gaditana comme source de molécules

antioxydantes, et démontre l’intérêt d’investiguer dans des démarches d'identification de ses

composants actifs et de mise en évidence de leurs activités sur des cellules cancéreuses.

III. Evaluation de l’activité antiproliférative des extraits des Nannochloropsis gaditana

L’activité antiproliférative des extraits des N.gaditana est mise en évidence par le test MTT

qui fonctionne comme un indicateur de l'activité des succinates déshydrogénases

mitochondriales (Mosmann, 1983).

La figure 32 représente la viabilité de la lignée cellulaire A549, après sa mise en culture

pendant 72 heures avec les différentes concentrations des extraits de N. gaditana. L'extrait

acétonique affiche une activité antiproliférative significative (P˂0.05) avec une CI50 égale à

0.412 mg.ml-1 (Tableau 10). Cet extrait a montré le meilleur effet à 150 µg.ml-1, avec 70,67%

de viabilité cellulaire. Les autres extraits ont montré un effet plus faible sur la viabilité

cellulaire, dans l'ordre, l'extrait méthanolique (CI50 = 0.512 mg.ml-1), l’extrait

dichlorométhanique (CI50 = 0.521 mg.ml-1), et l'extrait hexanique (CI50 = 1.16 mg.ml-1). En

revanche, la viabilité cellulaire n'est pas réellement affectée par l'extrait aqueux qui présente

une CI50 égale à 2.308 mg.ml-1.


75

Figure 32 : Viabilité de la ligné cellulaire A549 mise en culture avec les extraits de N.gaditana pendant 72h. Chaque valeur est exprimée sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3). Tableau 10: Valeurs des IC50 (mg.ml-1) des extraits de N.gaditana pour le test MTT.

Extrait IC50 mg.ml-1*

Acétonique 0.412

Méthanolique 0.512


Hexanique 1.16

Aqueux 2.308

*IC50 (mg.ml-1

): concentration inhibant 50% de la croissance cellulaire

Un extrait brut est intéressant lorsque les CI50 sont inférieures à 10 μg.ml-1 (Kornprobst,

2005). Les extraits bruts de N.gaditana ne correspondent pas à ce critère. Cependant, un

extrait est un mélange complexe, et le composé actif peut être une molécule minoritaire du

mélange. De plus, les résultats doivent être exprimés en mol.l-1 pour se prononcer sur le

potentiel antiprolifératif d’une molécule, le composé actif pouvant être de haut poids

moléculaire (Pasquet, 2011).

y = -0,092x + 87,95

y = -0,123x + 112,9

y = -0,096x + 100,4

y = -0,039x + 95,35

y = -0,025x + 107,7

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 40 60 80 100 120 140 160

% V

iab

ilit

é c

ell

ula

ire

Concentration de l'extrait µg.ml-1

Ac Met DCM Hex AQ


76

Néanmoins, la lignée A549 répond à l’effet de l'extrait acétonique. L'activité antiproliférative

de ce dernier peut être liée à la présence de pigments, puisque l'acétone extrait la plupart des

pigments photosynthétiques, dans un large éventail de polarité. En outre, l'acétone à 90 % est

recommandée pour l'analyse des pigments phytoplanctoniques (Strickland & Parsons, 1972;

Parsons et coll., 1984; Jeffrey & Hallegraeff, 1987).

Diverses études ont été consacrées à l'action d’extraits de microalgues sur différentes lignées

de cellules cancéreuses. Toutes ces études ont montré que les pigments et en particulier les

caroténoïdes, sont les composés les plus efficaces sur les cellules cancéreuses.

La fucoxanthine est le caroténoïde qui a été le plus étudié pour son activité antiproliférative.

Elle montre une activité antiproliférative et apoptotique sur les lignées cancéreuses du

poumon A549 et NSCLC-6 (Moreau et coll., 2006), sur les cellules du cancer de la prostate

PC3 (Kotake-Nara et coll., 2005), sur les cellules de cancer du colon Caco-2 (Hosokawa et

coll., 2004) et sur la lignée HL-60 (leucémie) (Hosokawa et coll., 1999 ; Nakazawa et coll.,

2009), en diminuant l’expression des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. Il a

également été démontré que la fucoxanthine inhibe la prolifération des cellules du cancer

hépatique HepG2 (Das et coll., 2008), du cancer du colon WiDr (Das et coll., 2005) et du

cancer de la prostate DUI45 (Satomi & Nishino, 2009), en induisant l’arrêt du cycle

cellulaire en phase G1.

Par ailleurs, il a été démontré que des hauts niveaux des espèces réactives de l’oxygène

(ERO) intracellulaires déclenchaient l’apoptose et la nécrose (Kotamraju et coll., 2004). Les

travaux, Kim et coll. (2010) se sont intéressés à l’impact de la fucoxanthine isolée à partir de

l’algue brune Ishige okamurae sur l’induction de l’apoptose via une augmentation du niveau

des ERO intracellulaires. Pour la lignée HL-60 (leucémie), ils ont montré que la fucoxanthine

induisait une augmentation du niveau des ERO intracellulaires. Cette augmentation conduit à

l’activation de l’apoptose par diminution du niveau d’expression de Bcl-xL (antiapoptotique)

entraînant l’activation des caspases -3 et -7.

Une autre étude a révélée que de fortes concentrations de β,β-carotène montrent des activités

apoptotiques associées à la génération des ERO dans des cellules d’adénocarcinome du colon

WiDr. Le β,β-carotène augmente le niveau intracellulaire des ERO, ce qui conduit à une

inhibition des protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 (Palozza et coll., 2001).


77

La néoxanthine a également révélé une activité antiproliférative et apoptotique sur la lignée

PC-3 de cancer de la prostate (Kotake-Nara et coll., 2005). On a montré que la néoxanthine

déclenchait l’apoptose via une diminution du niveau d’expression de Bcl-2 (antiapoptotique)

(Kotake-Nara et coll., 2005).

La violaxanthine a été étudié pour son potentiel antiprolifératif, cytostatique, cytotoxique et

pro-apoptotique (Pasquet, 2011). Il en ressort que la violaxanthine présente sur la lignée

cellulaire MCF-7 une activité cytotoxique, cytostatique réversible, pronécrotique et pro-

apoptotique. La violaxanthine est doublement époxydée (comportant un oxygène ponté sur

une liaison carbone-carbone) (figure 16), mais ne possède pas de liaison de type allénique

(liaison d’atomes de carbone de façon linéaire au moyen de doubles liaisons). La présence des

fonctions époxydes pourrait expliquer l’activité de la violaxanthine sur la lignée cellulaire

MCF-7(Pasquet, 2011).

Enfin, l'activité antiproliférative de la zéaxanthine et de la β-cryptoxanthine isolées à partir

d’un extrait éthanolique de Cyanophora paradoxa a récemment été démontrée par Baudelet

et coll. (2013) sur des cellules de mélanome (A-2058).

Les caractéristiques structurales des caroténoïdes sont suspectées d’être à l’origine de leurs

activités (Nakazawa et coll., 2009). Ce qui met en évidence l’importance de la stéréochimie

dans l’action des caroténoïdes sur les cellules cancéreuses.

L’extrait acétonique de N.gaditana que nous avons étudié, apparait comme le plus prometteur,

la lignée A549 répond mieux à son effet. Ainsi, la seconde partie de l'étude se poursuit sur cet

extrait, de manière à caractériser ses différents constituants et de rechercher la présence de

pigments caroténoïdes sus-cités.

IV. Caractérisation de l’extrait à activité antiproliférative

L’extrait brut sélectionné pour une première étude de chimie analytique est donc l’extrait

acétonique. Ce choix s’est appuyé sur le fait que cet extrait présente la CI50 la plus faible et

donc la meilleure activité antiproliférative sur la lignée cancéreuse A549.

L’effet des pigments de microalgues sur les cellules cancéreuses, ayant déjà été prouvé dans

les différentes études évoquées précédemment, ces analyses ont ainsi pour but de mettre en

évidence les pigments présents chez Nannochloropsis gaditana.


78

IV.1. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)

L’analyse de l’extrait acétonique de N.gaditana par CCM (figure 33) met en évidence,

principalement, 3 sortes de pigments: des carotènes (apolaires), des xantophylles (polaires), et

la chlorophylle (peu polaire).

Figure 33 : Résultat de la séparation de l’extrait acétonique de N.gaditana sur plaque

CCM.

Le gel de silice est polaire, il a par conséquence une plus grande affinité pour les composés

polaires:

§ Les carotènes (β-carotène): sont des composés apolaires, ne comportant pas d’atome

d’oxygène et ne sont donc pas retenus par le support solide.

§ Les chlorophylles (chlorophylle a): sont des composés peu polaires.

§ Les xantophylles sont des carotènes oxydés, ils sont polaires puisqu’ils comportent de

nombreux atomes d’oxygènes qui vont pouvoir se lier avec les groupements hydroxyles

(–OH) du support solide.

Par le calcul du rapport frontal (Rf) et par comparaison de nos résultats à ceux de Jeffrey

(1981) et Jeffrey et coll. (1997), nous avons pu identifier 6 bandes parmi les 9 qui

apparaissent sur la plaque de CCM (figure 33/ tableau 11). Ces dernières correspondent à des

7

3

1

5 6

9


79

pigments présents chez Nannochloropsis gaditana. En l’occurrence, la chlorophylle a, le β-

carotène et quelques xanthophylles (vaucheriaxanthine, astaxanthine, zéaxanthine, et

canthaxanthine).


Nannochloropsis gaditana selon le rapport frontal par comparaison aux résultats d’analyse par CCM des pigments de microalgues selon Jeffrey (1981) et Jeffrey et coll. (1997).

N° de la bande Rf (cm) Rf (cm) de référence (Jeffrey, 1981;Jeffrey et coll. 1997).

Identification

1 0.17 0.11 Vaucheriaxanthine

3 0.40 0.55 Chlorophylle a

5 0.54 0.54 Astaxanthine

6 0.58 0.58 Zéaxanthine

7 0.77 0.70 Canthaxanthine

9 0.96 0.99 β-carotène

IV. 2. Analyse par spectrométrie infrarouge (IR)

L’analyse par infrarouge de l’extrait acétonique de N.gaditana est réalisée à partir des

résultats obtenus par CCM. Chaque bande qui apparait sur la plaque de silice est récupérée, et

solubilisée dans un volume d’acétone. Le solvant est évaporé par nitrogène avant de procéder

à la spectrométrie infrarouge.

La spectrométrie infrarouge permet principalement une analyse qualitative d'une molécule en

mettant en évidence la présence de liaisons entre les atomes (fonctions et groupements).

L'absorption du rayonnement IR par les liaisons des composés organiques correspond à deux

types principaux de vibrations : vibration de valence ou d'élongation et vibration de

déformation angulaire. Une vibration de valence (d’allongement ou d’élongation) est un

mouvement des atomes le long de l’axe de la liaison. Une vibration de déformation est un

mouvement des atomes en dehors de l’axe de la liaison.

Le domaine infrarouge s’étend de 0,8 μm à 1000 μm. Il est divisé en 3 catégories, le proche

infrarouge (0,8 à 2,5 μm soit 12500-4000 cm-1), le moyen infrarouge (2,5 à 25 μm soit 4000-

500 cm-1) et le lointain infrarouge (25 à 1000 μm soit 500-10 cm-1).


80

La figure 34 représente les spectres infrarouge de l’extrait acétonique de N.gaditana soumis

au préalable à une séparation par CCM. L’analyse par IR de cet extrait emploi un procédé par

réflexion de type ATR (Attenuated Total Reflection) et est réalisée dans le moyen infrarouge

(2,5 à 25 μm soit 4000-500 cm-1).

Figure 34 : Spectres infrarouge type ATR dans le moyen infrarouge (2,5 à 25 μm soit

4000-500 cm-1) respectivement des bandes n° 1 et 3 obtenues à partir de la CCM de

l’extrait acétonique de N.gaditana.


81

Figure 34 (suite): Spectres infrarouge type ATR dans le moyen infrarouge (2,5 à 25 μm

soit 4000-500 cm-1) respectivement des bandes n° 5 et 6 obtenues à partir de la CCM de

l’extrait acétonique de N.gaditana.


82

Figure 34 (suite): Spectres infrarouge type ATR dans le moyen infrarouge (2,5 à 25 μm

soit 4000-500 cm-1) respectivement des bandes n° 7 et 9 obtenues à partir de la CCM de

l’extrait acétonique de N.gaditana

Les spectres IR obtenus sont assez simples. Ils présentent des régions de faible énergie qui

s’étendent entre (1000-400cm-1) caractéristiques des transitions vibrationnelles de

déformation. L’analyse spectrale est faite sur la base des tables indiquant les plages

d'absorption (annexe 2 / tableau 12). Les nombres d’ondes compris entres 1050-1300 cm-1


83

indiquent la présence de liaisons de type Ctet-O-Ctri. Ceux entre 960 – 970 cm-1 indiquent la

présence de liaisons Ctri-H de -HC=CH-, ceux entre 800-860 indiquent la présence de

composés aromatiques, et ceux entre 500 - 750 indiquent la présence de liaisons de type Ctet-

Br.

Tableau 12 : Table des nombres d’onde des vibrations de référence et ceux obtenus par analyse infrarouge de l’extrait acétonique de N.gaditana.

Nombre d’ondes (cm-1)

obtenus Nombre d’ondes (cm

-1) Référence

Type de liaisons

1056.28-1060.83

1050 -1300 Ctet-O-Ctri (esters)

971.23- 973.24 960 - 970 Ctri-H de -HC=CH-

794.52-797.32 800-860 Ctri-H aromatique

506.06- 572.46 500 - 750 Ctet-Br

Avec : Ctet-O-Ctri :

Néanmoins, à ce stade nous ne disposons pas d’assez d’informations pour identifier la

présence d’un pigment et déterminer avec exactitude sa structure chimique. Souvent les

pigments n’ont pas de signature en IR moyen (2,5 à 25 μm soit 4000-500 cm-1). Ils peuvent

être détectés en IR lointain (25 à 1000 μm soit 400-10 cm-1). L’analyse en ATR moyen IR ne

donne aucune information exploitable [1].

En outre, les spectres obtenus sont très simples, se ressemblent et présentent seulement des

absorptions vers 1056, 971, 794 et 506 cm-1 (figure 34). Ce qui est caractéristique des

hydrocarbures saturés, il pourrait s’agir d’hydrocarbures saturés résiduels présents dans la

phase mobile de la CCM. En effet, les hydrocarbures saturés présentent des spectres très

simples, des absorptions principales situées en dessous de 3000 cm-1, et des absorptions vers

1450, 1375, et 720cm-1 (Zaydoun, 2007).

[1] Patrick Bernard-Moulin. Complémentarité des techniques de spectroscopie moléculaire. Etudes de cas réels. Division Spectroscopie Moléculaire www.heliospir.net/medias/upload/files/15J_c_BernardMoulin.pdf.


84

IV.3. Analyse par HPLC analytique

L’analyse par HPLC est réalisée à deux longueurs d’onde 290nm et 435nm. Les molécules

présentes dans l’extrait acétonique de N.gaditana présentent un maximum d’absorption à

435nm (figure 35), cette longueur d’onde permet de détecter l’ensemble des pigments

solubles dans les solvants organiques: chlorophylles, carotènes et phéopigments (Jeffrey et

coll., 1997). Nous avons ainsi réalisé les identifications sur la base des temps de rétention

obtenus à 435nm (tableau 13), par comparaison de nos résultats à ceux de l’analyse par HPLC

des pigments de microalgues selon Bortas & Plante-Cuny, (1995) et Jeffrey et coll. (1997).

Figure 35 : Chromatogramme de l’extrait acétonique de Nannochloropsis gaditana, à 290nm (Channel 1) et 435 nm (Channel 2) en mode analytique.

Tableau 13: Identification des pigments présents dans l’extrait acétonique de

Nannochloropsis gaditana selon le temps de rétention par comparaison aux résultats d’analyse par HPLC des pigments de microalgues selon Bortas & Plante-Cuny, (1995) et Jeffrey et coll. (1997).

N° Pic Temps de rétention (min)

Temps de rétention de référence (min)

Nom du composant

1 14.32 14 Canthaxanthine

2 15.96 16.15 Chlorophylle a

3 17.76 17.53 Zéaxanthine*

4 19.64 18.76 β-Carotène

* (Bortas & Plante-Cuny, 1995)


85

Parmi les huit pigments présents chez la microalgue Nannochloropsis gaditana, nous avons

réussi à identifier quatre d’entre eux (tableau 13) : la canthaxanthine, la chlorophylle a, la

zéaxanthine et le β-carotène. La violaxanthine, la vaucheriaxanthine, l'anthéraxanthine, et

l’astaxanthine n’ont pu être identifiées.

Il faut souligner, les xantophylles telles que la violaxanthine, et l'anthéraxanthine

n'apparaissent que lors du stress lumineux via le cycle des xantophylles (figure 36). Ces

pigments jouent un rôle photoprotecteur chez les microalgues (Lee & Ding, 1992).

Le déclenchement de ce mécanisme photoprotecteur est régit par la violaxanthine de-

époxydase (VDE) activée par un stress lumineux et un faible pH (activité maximale à pH <5,8

(Eskling et coll., 1997) ce qui conduit à la réduction de la violaxanthine en anthéraxanthine

puis en zéaxanthine (De Reviers, 2002; Ruiz, 2005). L’excès d’énergie non utilisée est alors

éliminé évitant, par la suite, la production d’oxygène singulet nuisible à la cellule. Lorsque

l'énergie lumineuse et le gradient de pH diminuent, la VDE est inactivée et la zéaxanthine

époxydase (ZEP) (activité optimale à pH 7-7,5) est activée (Eskling et coll., 1997), ce qui

conduit à la conversion de la zéaxanthine en anthéraxanthine et dans une seconde étape en

violaxanthine en utilisant l'oxygène et le NADPH (Eskling et coll., 1997 ; Gentile & Blanch,

2001).

Figure 36 : Cycle des xanthophylles chez les Chlorophyceae (Jeffrey et coll., 1997).


86

La présence de ces pigments n’est de ce fait pas permanente. Ce qui pourrait justifier leur

absence lors de l’analyse par CCM et par HPLC (tableau 14).

A l’issus de notre travail de caractérisation de l’extrait acétonique de N.gaditana, nous avons

pu mettre en évidence la présence des pigments illustrés dans le tableau 14.

Tableau 14 : Pigments de N. gaditana identifiés par CCM et HPLC

Pigments de N. gaditana Caractérisation par CCM Caractérisation par HPLC

Chlorophylle a + +

Violaxanthine - -

Vaucheriaxanthine + -

Canthaxanthine + +

Antheraxanthine - -

Astaxanthine + -

Zéaxanthine + +

β-Carotène + +

Il en ressort que N.gaditana présente un large éventail de pigments ayant déjà été évoqués

dans divers études pour leur effet antiprolifératif, cytotoxique et pro-apoptotique sur les

cellules cancéreuses. Ces études ont suggéré l’utilisation des pigments de microalgues pour la

prévention du cancer (Moreau et coll., 2006; Pasquet et coll., 2011 ; Gagez et coll., 2012 ;

Baudelet et coll., 2013).

Le potentiel de N.gaditana est d’autant plus important, qu’on peut orienter la culture vers la

surproduction d’un pigment en particulier, par la modification des paramètres de cultures. En

1983, Lubián et Establier ont étudié les variations de la composition pigmentaire de

Nannochloropsis gaditana en fonction de la croissance et ont observé une augmentation de la

teneur en canthaxanthine avec le temps pouvant allant jusqu'à 4 fois plus que dans la culture

de départ. Chez cette espèce, l'accumulation de canthaxanthine était plus élevée dans les

cultures exposées à une de forte irradiation et à faibles concentrations de nitrate.

Nos résultats de caractérisation mettent ainsi en évidence la diversité de la composition

pigmentaire de N.gaditana, et dévoilent le potentiel de cette microalgue à fournir des

molécules susceptibles d’affecter la prolifération des cellules cancéreuses.

Conclusion Générale & Perspectives

87

CONCLUSION GÉNÉRALE

& PERSPECTIVES


88

Les travaux entrepris dans le cadre de la présente thèse s’inscrivent dans une démarche de

valorisation de produits naturels marins. Ils visent à mettre à profit le potentiel de la

microalgue marine Nannochloropsis gaditana comme source de nouvelles molécules

antioxydantes et anticancéreuses.

Nous nous sommes intéressé à un groupe de microalgues qui n’ont jusqu’ici, que très peu été

étudiées d’un point de vue pharmacologique, cela nous a ainsi permis de confirmer l’intérêt

des microalgues dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, et

spécifiquement :

- De démontrer l’effet antioxydant de cinq extraits de N.gaditana, particulièrement celui

de l’extrait aqueux qui révèle la teneur la plus élevée en phénols et aussi l’activité

antioxydante la plus élevée, que ce soit pour la réduction du radical DPPH• ou pour la

réduction du fer. Nous pouvons en conclure que les groupements hydroxyles des

composés phénoliques de cet extrait aqueux sont à l’origine de son activité antioxydante

via le transfert d'atomes d'hydrogène, et le transfert d'électrons.

- Par ailleurs, notre travail nous a aussi permis d’évaluer le potentiel antiprolifératif de

différents extraits de N. gaditana sur la lignée cancéreuse A549, conduisant ainsi à la

sélection de l’extrait acétonique comme étant le plus prometteur pour approfondir les

études.

- Enfin, nous avons caractérisé cet extrait, et identifié ses différents composants en

adoptant des démarches analytiques ciblant les pigments. Ces analyses ont permis de

mettre en évidence la présence de pigments caroténoïdes, en l’occurrence des

xanthophylles, déjà évoqué dans la littérature pour leurs effets sur les cellules

cancéreuses. Ce qui nous permet d’avancer que les pigments présents dans l’extrait

acétonique de N.gaditana seraient à l’origine de son activité antiproliférative sur la

lignée A549.

Nos résultats témoignent du potentiel des microalgues marines comme source de molécules

antioxydantes et anticancéreuses, et permettent d’envisager la possibilité d’isoler à partir de

N.gaditana des molécules à activité anticancéreuse capables d’induire un arrêt de la

prolifération de cellules cancéreuses.

Ainsi les futurs travaux devront porter sur différentes problématiques :

- Etudier les potentiels cytotoxique, cytostatique et pro-apoptotique de l’extrait acétonique

de N.gaditana sur la lignée A549 ainsi que sur d’autres lignées cellulaires cancéreuses.


89

- Réaliser un travail d’isolation et d’identification des principes actifs présents dans

l’extrait acétonique de N.gaditana en adoptant une démarche bioguidée par

fractionnement successif de l’extrait par HPLC préparative. Chaque fraction devra être

étudiée pour son potentiel anticancéreux. Si en fonction des étapes de purification les CI50

diminuaient (augmentation de l’activité antiproliférative), cela signifierait que l’activité

mesurée dans l’extrait brut de départ n’est pas due à un phénomène de synergie d’action

entre les différentes molécules du mélange. En effet, un phénomène de synergie

conduirait à une augmentation des CI50 au fur et à mesure des étapes de purification.

L’extrait de plus en plus pur contenant proportionnellement toujours plus de molécules

actives.

- Réaliser une analyse par spectrométrie de masse afin d’identifier la fraction dotée de la

meilleure activité antiproliférative.

- Etudier l’impact des paramètres de culture et de l’état physiologique des microalgues sur

la synthèse de molécules bioactives.

- Enfin, déterminer les cibles moléculaires des pigments et leur mode d’action sur les

cellules cancéreuses.

Notre étude confirme que les microalgues feront assurément partie des futurs organismes

prépondérants dans la découverte de nouveaux médicaments d’origine naturelle. En effet, ces

organismes constituent une alternative fiable pour la production de molécules bioactives en

donnant accès à une quantité importante de biomasse, de qualité constante et sans atteinte à

l’équilibre écologique des espèces vivantes. Les microalgues réunissent ainsi les conditions

idoines pour leur utilisation en recherche pharmacologique, d’où l’intérêt de notre étude et

celui d’investiguer plus avant les pistes qu’elle révèle.

Références Bibliographiques

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ANNEXES

112

ANNEXES

ANNEXES

113

ANNEXE 1

Echelle de polarité des solvants organiques

Source : www.snv.jussieu.fr/bemedia/lafont/chromato/A62.html

ANNEXES

114

ANNEXE 2

Spectroscopie infrarouge : Tables détaillées des nombres d’ondes

RESUMÉ

Les organismes marins, dont les microalgues, constituent un champ d’investigation majeur pour la

recherche de nouvelles molécules thérapeutiques susceptibles d’améliorer les réponses aux traitements

anticancéreux. Dans ce contexte, et afin d’identifier des molécules naturelles ayant un effet antioxydant et antiprolifératif sur les cellules cancéreuses, nous avons évalué la teneur en composés phénoliques de cinq extraits issus de la microalgue Nannochloropsis gaditana, à savoir des extraits de type: acétonique, méthanolique, dichlorométhanique, hexanique et aqueux. Par ailleurs, l’activité antioxydante de ces extraits a été étudiée par deux méthodes: la réduction du fer et le piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Ces extraits ont de surcroit fait l’objet d’une évaluation de l’activité antiproliférative sur

une lignée du cancer du poumon (A549) par le test MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Une caractérisation de l’extrait présentant le meilleur effet sur la lignée

A549 a été réalisée par CCM, spectrométrie infrarouge et HPLC. Les résultats révèlent que l’extrait

aqueux, le plus riche en phénols, fait preuve de la meilleure activité antioxydante. L’extrait acétonique qui

a présenté la plus faible concentration en phénols révèle une bonne activité antioxydante et l’activité

antiproliférative la plus élevée. Nos résultats suggèrent que l'activité antioxydante des extraits de N.gaditana n’est pas seulement due à la présence de composés phénoliques, mais aussi à d'autres molécules à effet antioxydant qui restent à caractériser. Par ailleurs, des molécules dotées d’un effet potentiellement

anticancéreux doivent certainement être présentes dans l'extrait acétonique, ce qui lui confère l’effet

antiprolifératif sur la lignée A549. La caractérisation de cet extrait a mis en évidence la présence de pigments, principalement des xanthophylles qui seraient à l’origine de son activité antiproliférative. Nos

résultats témoignent du potentiel de N.gaditana comme source de molécules à activités antioxydante et antiproliférative. Des investigations plus approfondis permettront la mise en valeur de ces résultats préliminaires et la caractérisation d’éventuelles molécules thérapeutiques à grande valeur ajoutée.

Mots clés: Nannochloropsis gaditana, cancer, phénols, DPPH, réduction du fer, MTT, pigments.

ABSTRACT

Marine organisms, including microalgae, are among major fields of investigation for the research of novel therapeutic molecules that may improve responses to cancer treatment. Within this framework and in order to identify a natural antioxidants and antiproliferative molecules, we focused most of our investigations towards the evaluation of phenolic compounds in Nannochloropsis gaditana extracts namely: acetonic, methanolic, dichloromethanic, hexanic and aqueous extracts. Otherwise, the antioxidant activity of these extracts was evaluated by two methods: the scavenging of DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical and the ferric reducing power. The antiproliferative activity is also assessed on A549 (Human lung cancer cell line) by MTT assay. A characterization of the extract having the best effect on the A549 cell line is carried out by a TLC, IR spectrometry and HPLC. The results reveal that the aqueous extract, the richest in phenols, has demonstrated best antioxidant activity. The acetonic extract which exhibits the lowest phenols concentration reveals good antioxidant activity and the highest antiproliferative activity. Our results suggest that the antioxidant activity of N.gaditana extracts is not only due to the presence of phenolic compounds, but is also due to the presence of other molecules with an antioxidant effect. In addition, molecules endowed with a potentially anti-cancer effect must certainly be present in the acetonic extract, which gives it the antiproliferative effect on A549 cell line. The characterization of this extract showed the presence of pigments, mainly xanthophylls, which could be the cause of the antiproliferative activity of the acetonic extract. Our results demonstrate the potential of N.gaditana as a source of antioxidant and antiproliferative molecules. More detailed investigations will allow the development of these preliminary findings and the characterization of potential therapeutic molecules with high added value.

Key words: Nannochloropsis gaditana, cancer, phenols, DPPH, ferric reducing power, MTT, pigments.

ISSN: 0975-8585

May–June 2016 RJPBCS 7(3) Page No. 904

Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical

Sciences

Evaluation of Antioxidant and Antiproliferative Activities of Nannochloropsis gaditana Extracts.

Loubna Mekdade1*, Mohamed Bey Baba Hamed1, Fatima Zohra EL-Kebir2, and Sidi Mohamed El-Amine Abi Ayad1 .

1Laboratory of Aquaculture and Bioremediation (AQUABIOR), Department of Biotechnology, University of Oran 1 Ahmed

Benbella, Algeria. 2Laboratory of Developmental Biology and Differentiation (LBDD), Department of Biology, University of Oran 1 Ahmed

Benbella, Algeria.

ABSTRACT

To identify a new source of natural antioxidants and anticancer agents from marine microalgae, we investigated the evaluation of phenolic compounds in Nannochloropsis gaditana extracts namely, acetonic, methanolic, dichloromethanic, hexanic and aqueous extracts. The antioxidant activity of these extracts was evaluated by two methods: the scavenging of DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical and the ferric reducing power .The antiproliferative activity was also assessed on A549 (Human lung cancer cell line) by MTT assay. The results revealed that the aqueous extract and the methanolic extract had the highest amount of phenolic compounds and the highest ferric reducing power. In DPPH assay, the aqueous extract and the acetonic extract exhibited the highest antioxidant activity. The acetonic extract showed the best effect on A549 cell line. The obtained results suggest that the antioxidant activity of N.gaditana extracts is not only due to the presence of phenolic compounds, but also due to the presence of other molecules that act as scavengers of free radicals via the hydrogen atom transfer and the electron transfer. Moreover, others molecules with an anticancer effect must be present in the acetonic extract, giving it an anti-proliferative activity on A549 cell line. Keywords: Nannochloropsis gaditana, phenols, DPPH, reducing power, antiproliferative activity. *Corresponding author

ISSN: 0975-8585


INTRODUCTION

Marine algae have been historically and exceptionally considered rich source of pharmacologically active metabolites with antineoplastic [1-3], antimicrobial and antiviral effects [1, 3]. Moreover, because of phototropic life of microalgae and their permanent exposure to high oxygen and radical stresses, they have a high capability for production of numerous efficient protective chemicals against oxidative and radical stressors [4].

Highly reactive free radicals and oxygen species are present in biological systems from a wide variety of sources. These free radicals may oxidize nucleic acids, proteins, lipids or DNA and can initiate degenerative disease [5, 6]. Nowadays, there are restrictions on the use of synthetic antioxidants, are suspected to be carcinogenic [7]. Natural antioxidants, therefore, have gained importance. Antioxidant compounds like phenolic acids, polyphenols and flavonoids scavenge free radicals such as peroxide, hydroperoxide or lipid peroxyl and thus inhibit the oxidative mechanisms [8]. Furthermore phenolic compounds may act in different stages of the development of malignant tumors by protecting cellular biomolecules from oxidative damage and preventing carcinogenesis process [9]. It was demostrated that detoxifying the body from free radicals, improve responses to anticancer treatment [10]. In this context, we propose to study different extracts of Nannochloropsis gaditana as free radical scavengers, by the evaluation of phenolic compounds and the measurement of antioxidant capacity by two methods: the scavenging of DPPH• (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl) free radical and the ferric reducing power. In order to highlight the effect of N.gaditana extracts on cancer cells, we investigated the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay to study the antiproliferative activity of these extracts on A549 cell line.

MATERIAL AND METHODS

Biological material

Nannochloropsis gaditana is a microalgae that belongs to the class Eustigmatophycea [11]. This marine microalgae presents only chlorophyll a [12] and the main accessory pigments, violaxanthin and vaucheriaxanthin esters play a major role in light harvesting [13]. Some minor xanthophylls (canthaxanthin, anteraxanthin, zeaxanthin) and carotenes (β-carotene) are also present in much lower amounts [14]. The microalgae Nannochloropsis gaditana used in this study was obtained from Partisano Biotech Company, Algeria. Sample preparation

The extraction was performed according to the method described by Li and al. [15] with some modifications. 2g of dried algal biomass of Nannochloropsis gaditana were macerated in 40ml of the extraction solvents namely: acetone, methanol, dichloromethane, hexane and purified water. After centrifugation at 45000g for 10min, the supernatant of aqueous extract was lyophilized while the supernatants of the others solvents were purged to dryness using nitrogen. The extracts were stored at 0°C before use. For the antioxidant assays, the aqueous extract was appropriately diluted in water, while the others extracts were diluted with ethanol and immediately used the tests [15]. Determination of total phenolics content

Total phenolics content was estimated by the Folin–Ciocalteu method [16]. 200µl of diluted sample (50mg/ml) were added to 1 ml of 1:10 diluted Folin–Ciocalteu reagent. After 4 min, 800 µl of saturated sodium carbonate (75 g/l) was added. After 2h of incubation at 20°C, the absorbance at 765 nm was measured. Gallic acid (0–180 µg/ml) was used for the standard calibration curve. The results were expressed as µg gallic acid equivalent /g dry weight of microalgae (µg GAE/g D.W) from the gallic acid standard curve, and calculated as mean value ± standard deviation (n = 3). DPPH scavenging assay

The antioxidant assay was investigated by the DPPH method [17]. 50μl of each extract at three concentrations (10- 30 and 50mg/ml) were added to 1,95 ml of DPPH methanolic solution (0,025g/l). A negatif

https://en.wikipedia.org/wiki/Di-

https://en.wikipedia.org/wiki/Di-

https://en.wikipedia.org/wiki/Thiazole

https://en.wikipedia.org/wiki/Phenyl

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control was prepared with 50μl methanol and 1,95 ml DPPH methanolic solution. After incubation for 30 min in the obscurity and at 20°C, the absorbance was readed at 517nm with a blank prepared for each concentration of each extract. Ascorbic acid and BHT(butylated hydroxytoluene) (20-300µg/ml) were used as references. Percentage of free radical scavenging activity was expressed as percent inhibition:

% = [(A517nm of control - A517nm of sample)/A517nm of control] x 100.

The extract concentration providing 50% inhibition (EC50) was calculated from the linear regression. The experiment was performed in triplicate. Ferric reducing power assay

The reducing power was determined according to the method described by Oyaizu [18]. 500 µl of each extract at three concentrations (10- 30 and 50mg/ml) were mixed with 500µl of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6) and 500µl of 1% potassium ferricyanide. The mixture was incubated at 50°C for 20 min. After incubation, 500µl of 10% trichloroacetic acid were added to the mixture, followed by centrifugation at 650g for 10 min. The upper layer (500µl) was mixed with 500µl of deionized water and 100 µl of 0.1% of ferric chloride. The mixture absorbance was measured at 700 nm (higher absorbance indicates higher reducing power). Ascorbic acid and BHT (butylated hydroxytoluene) (20-300µg/ml) were used as references. The experiment was performed in triplicate. Extract concentration providing 0.5 of absorbance (EC50) was calculated from the graph of absorbance against extract concentration. Antiproliferative activity assay

The inhibition of cell viability was assessed by modified MTT colorimetric assay [19]. Each extract was firstly dissolved in DMSO 1%. The final concentration was equal to 1mg/ml. The extracts were then dissolved in RPMI1640 medium to obtain different concentrations ranging from 5 to150 µg/ml.

A549 cell line (ATCC n°CCL-185) (105cells/ml) were seeded in 96-well plates using RPMI 1640

containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum) supplemented with 1% antibiotics (10000 U penicillin.ml-1

and 10mg streptomycin.ml

-1). After 24 h of incubation, cells were synchronized and attached to plates, after which the

medium in the plates was discarded and replaced with 100 µl fresh medium containing different concentrations of N. gaditana extracts. The plates were incubated at 37°C for 72h under 5% CO2 and 99% humidity. The medium containing various tested extracts were discarded and 100µl MTT at a final concentration of 5 mg/ml in PBS was added to each well. The cells were then incubated for 3 h and then 100µl isopropanol were added. Absorbance at a test wavelength of 550 nm and a reference wavelength of 620 nm was measured with a microplate reader (TECAN Sunrise™). The test was performed in triplicates. Percentage of cell viability was calculated from the flowing equation:

Cell Viability (%) = [A 550nm sample / A 550nm control] x 100.

The concentration of 50% inhibition (IC50) was the concentration that achieved 50% cytotoxicity against culture cells. Statistical analysis

The statistical analysis of the outcome data was carried out using one way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test using statistics software package (Statistica). P value <0.05 were considered as significant.

RESULTS AND DISCUSSION

Total phenolic content

Phenolic compounds constitute a group of secondary metabolites that are quite widespread in nature with diverse biological activities, such as anti inflammatory, anti-atherosclerotic and anti-carcinogenic activities [20]. They exert properties such as free radical scavenging and inhibiting the generation of reactive species [21,

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22].Their antioxidant activity is mainly due to their redox properties, which allow them to act as reducing agents, hydrogen donors, free radical scavengers, singlet oxygen quenchers and metal chelators [23].

Fig 1: Phenolic content of acetonic (Ac), methanolic (met), dichloromethanic (DCM), hexanic (Hex) and aqueous extracts (AQ) of N. gaditana. Each value is expressed as mean ± standard deviation (n = 3).

The total phenolic content of N.gaditana (fig.1) was determined in order to assess its effect on the

extract’s antioxidant activity, and to identify a natural source of phenolic compounds. The antioxidant compounds of microalgae could be of very different polarity, and as a result were extracted into different polarity solvents. Table 1: Phenolic content of N. gaditana extracts. Each value is expressed as mean ± standard deviation (n =

3).

Extract Phenolic content µg GAE/g D.W

Acetonic (Ac) 1.12 ± 0.09

Methanolic (Met) 3.33 ±1.00

Dichloromethanic (DCM) 1.40 ± 0.02

Hexanic (Hex) 1.74 ± 0.04

Aqueous (AQ) 3.84 ± 0.12

The variation of phenolic content was quite large but statistically insignificant (P>0.05). The aqueous

extract and the methanolic extract showed the highest amount of this compounds (table 1) with respectively 3.84 ± 0.12 µg GAE/g D.W, and 3.33 ±1.00 µg GAE/g D.W followed by the hexanic extract (1.74 ± 0.04µg GAE/g D.W) and dichloromethanic extract (1.40 ± 0.02 µg GAE/g D.W). The acetonic extract showed a low phenolic content with 1.12 ± 0.09 µg GAE/g D.W.

Results of the present study showed that among all the extraction solvents; the aqueous extract had the highest phenolic content. This may be due to the fact that phenolics are typically polar compounds [24], and are often extracted in higher amounts in more polar solvents [25-27]. Scavenging of DPPH radicals

The scavenging activity on DPPH radicals has been widely used to determine the free radical scavenging activity of different matrices [28-31]. Antioxidant molecules can quench DPPH free radicals by providing hydrogen atoms or by electron donation, conceivably via a free-radical attack on the DPPH molecule, and convert them to a colorless/bleached product (2,2-diphenyl-1-hydrazine, or a substituted analogous hydrazine), resulting in a decrease in absorbance at 517 nm [32].

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Fig 2: Scavenging activity (%) on DPPH radicals: (A) by N.gaditana extracts, (B) by ascorbic acid and BHT. Each value is expressed as mean ± standard deviation (n = 3).

Table 2: EC50 values (mg/ml) of N.gaditana extracts in DPPH scavenging assay and ferric reducing power

assay

Extract DPPH (EC50 a) Reducing power (EC50

b)

Acetonic 3.12 1.22

Methanolic 3.28 1.06

Dichloromethanic 7.22 2.72

Hexanic 44.37 15.5

Aqueous 2.52 1.03

Ascorbic acid 0.03 0.10

BHT 0.08 0.08 aEC50 (mg/ml): effective concentration at which 50% of DPPH radicals are scavenged.

bEC50 (mg/ml): effective concentration at which the absorbance is 0.5.

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Fig.2 (A) shows the scavenging activity of N.gaditana extracts. In Table 2, we present the EC50 values

corresponding to that activity. At 50mg/ml, the scavenging action was higher in aqueous extract (69.97%) than methanolic extract (47.59%) and acetonic extract (44.90%). At this concentration, the dichloromethanic extract (19.47%) and hexanic extract (14.90%) showed a weak antioxidant activity. These extracts do not show a significant difference in their activity (P= 0.97). However, the aqueous extract exhibited a significant difference in relation to all these extracts (P=0.0018). It must be noted that all these extracts had a lower scavenging action than ascorbic acid and BHT which present a very strong antioxidant effect at 300µg/ml (fig. 2B), with respectively 96.23% and 93%. The five extracts of N.gaditana exhibited a significant difference compared to the standards (P<0.05).

It is important to highlight that the free radical scavenging by antioxidants is dependent on two types of mechanisms : the hydrogen atom transfer from hydroxyl group (a rapid kinetics from some phenolic acids and derivatives) and the electron transfer (slow kinetics from derived glycosylated and anthocyanins) [33, 34]. The aqueous extract had exhibited the highest amount of phenolic compounds (3.84 ± 0.12 µg GAE/g D.W) and the highest scavenging effect on DPPH free radical (tab.2) (EC50=2.52mg/ml), so we can suppose that phenolic compounds are the source of this activity via the hydrogen atom transfer. It was suggested that the ability of these phytochemicals to scavenge free radicals depended on types and volume of phenolic compounds [35]. The difference in their chemical structure was proposed for their different scavenging property. The type of solvent might be another factor affecting the antioxidant efficiency of the extract [36].

However, the acetonic extract had not a high concentration of phenolics (1.12 ± 0.09 µg GAE/g D.W), therefore it had a good scavenging effect on DPPH (tab.2). It should be noted that other antioxidant compounds such as carotenoids, polyunsaturated fatty acids and polysaccharides may play an important role in the antioxidant activity [37, 38]. Ferric reducing power

To further characterize the antioxidant properties in N.gaditana extracts, we tested the antioxidant capacity using the ferric reducing power assay. This technique measures the ability of extracts to reduce the ferric iron (Fe

3+) present in the K3 [Fe(CN)6] complex to Ferrous iron (Fe

2+) [18].

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Fig 3: Ferric reducing power: (A) of N. gaditana extracts, (B) of ascorbic acid and BHT. Each value is expressed as mean ± standard deviation (n= 3).

Fig.3 (A) shows the reducing power of N.gaditana extracts as a function of their concentration. At 30

and 50mg/ml the methanolic extract exhibited the highest ferric reducing power with OD700 values equal to 1.22 and 1.84, followed by the aqueous extract which exhibited at these same concentrations, OD700 values equal to 1.14 and 1.52. These two extracts do not show a significant difference in their activity (P> 0.05). Dichloromethanic extract and hexanic extract exhibited a very weak activity than the other extracts. The ferric reducing power of the five extracts was lower than that of BHT and ascorbic acid (fig. 3 B) and statistically very significant (P=0.0001).

The EC50 related to this activity are reported in table 2. It is obvious that the reducing power of aqueous extract and methanolic extract is due to the presence of phenolic compounds that are considered as reducer and inactivators of oxidants, because of the presence of hydroxyl group that can serve as an electron donor [25]. Antiproliferative activity

The MTT assay works as an indicator of the activity of mitochondriale succinate deshydrogenase in living cells. This enzyme convert the MTT into crystal of formazan by cleaving the tetrazolium ring [19].

Table 3: IC50 values (mg/ml) of N.gaditana extracts in MTT assay

Extract IC50 mg/ml

Acetonic 0.412

Methanolic 0.512

Dichloromethanic 0.521

Hexanic 1.16

Aqueous 2.308

IC50 (mg/ml): The concentration of 50% inhibition was the concentration that achieved 50% cytotoxicity against culture cells

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Fig 4: Viability of A549 cell line in response to N.gaditana extracts. Each value is expressed as mean ± standard deviation (n= 3).

Fig. 4 shows the viability of A549 cell line, after culturing with various concentrations of N. gaditana

extracts for 72h. The acetonic extract displayed a significant (P˂0.05) antiproliferative activity with an IC50 equal to 0.412mg/ml (tab.3). This extract showed the best effect at 5µg/ml and 150µg/ml with respectively 77.64% and 70.67% of cell viability. The others extracts had shown a weaker effect on cell viability, in order, methanolic extract (IC50=0.512mg/ml), dichloromethanic extract (IC50=0.521mg/ml), and hexanic extract (IC50=1.16 mg/ml). In contrast, the cell viability was not really affected by the aqueous extract which exhibited an IC50 equal to 2.308mg/ml.

The antiproliferative activity of acetonic extract on A549 can be related to the presence of pigments in this extract. Because the acetone is known to extract most of the photosynthetic pigments, in a wide range of polarity and furthermore, acetone 90% is recommended for phytoplankton pigment analysis [39-41].

Various studies have been devoted to the action of microalgae extracts on different cancer cells lines. All these studies showed that the pigments, in particular carotenoids, are the most effective compounds on cancer cells.

Fucoxanthin is the carotenoid that has been most studied for its antiproliferative activity. It shows antiproliferative and apoptotic activity on lung cancer cell lines A549 and NSCLC-6 [42], on prostate cancer cell line PC-3 [43], on liver cancers [44], on the colon cancer lines Caco-2 [45] and WiDr [44], and on leukemia cell line HL-60[46,47]. The violaxanthin showed a cytotoxic and apoptotic effect on MCF-7 cancer cells line [48]. The β,β-carotene [49], lycopene, neoxanthin, lutein, cantaxanthin, also showed an antiproliferative and apoptotic activity on various cancer cell lines [43].

In an other side, a crude extract is interesting when the IC50 values are lower than 10 µg. ml-1

[48]. Crude extracts of N.gaditana do not reach this value. However, an extract is a complex mixture, and the active compound may be a minority molecule of the mixture. In addition, the results must be expressed in mol.l

-1 to

rule on the antiproliferative potential of molecules, the active compound may have a high molecular weight [48]. Thus, a bioguided research on active molecules present in the acetonic exctract of N.gaditana will decide on its real anti-cancer effect.

CONCLUSION

Nannochloropsis gaditana extracts display a remarkable antioxidant activity. Overall, aqueous extract revealed the highest concentration of phenolic compounds, which is in agreement with its antioxidant

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properties due to the hydroxyl groups of phenolic compounds. This result suggests that, antioxidants compounds of N. gaditana can be considered as promising alternative to synthetic antioxidants.

In the other hand, the acetonic extract exhibited the lowest phenolic content, but showed a good antioxidant activity. Furthermore, this extract presents the best antiproliferative activity on A549 cell line. Then, it is clear that different functional compounds would be present in this extract endowed with great antioxidant and antiproliferative activity.

In recent years, the use of photosynthetic microorganisms, such as microalgae, in life sciences has received increasing attentions due to their diverse phytometabolic contents with various chemical structures and biological activities [50]. Thus, present findings encourage for further studies for isolation and identification of active components of N. gaditana extracts, to consider them as antioxidants and anticancer agents.

ACKNOWLEDGEMENTS

The research was supported by the National Laboratory of Pharmaceutical Products Control (LNCPP) Algiers, Algeria. The authors are grateful to Prof. H. CHADER and Prof. M.B. MANSOURI for the supply of the A549 cell line. The authors would like to thank Partisano Biotech Company for providing Nannochloropsis gaditana used in the study.

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