06metodos de Dispersion

Análisis Instrumental

Tema 6: Espectroscopía de dispersión Raman. Turbidimetría y Nefelometría.

Espectroscopía de

dispersión Raman. dispersión Raman.

Turbidimetría y

Nefelometría.


Tema 6: Espectroscopía de dispersión Raman. Turbidimetría y Nefelometría.

Turbidimetría y nefelometría• Dispersión de Tyndall(fenómeno y técnica no espectroscópica).

• Instrumentación de la turbidimetría y nefelometría.

•Aplicaciones.

Espectroscopía de dispersión RamanEspectroscopía de dispersión Raman•Dispersión Raman (fenómeno y técnica espectroscópica).

•El Espectrofotómetro Raman.

•Comparación con la Espectroscopia IR


Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersión

• Choques elásticos con moléculas o partículas de tamaño atómico

Dispersión Rayleigh

• Choques inelásticos con moléculasDispersión

Raman

• Choques elásticos con macromoléculas o partículas coloidales

Dispersión Tyndall

Espectroscopía

Raman

Turbidimetría y

nefelometría



La dispersión de radiación tiene lugar cuando un haz de radiación incidente UV-

visible choca con partículas atómicas, moleculares o coloidales.

Se observa que una pequeña fracción de la radiación se difunde a partir del haz en

todas las direcciones.

Radiación dispersada

Radiación transmitida

Radiación incidente


Los fotones de un rayo de luz monocromatico de la región vis- IR cercano pueden experimentar

el fenómeno de una dispersión debido a:

1) Colisiones elásticas en algunas regiones de la molecula: es la dispersión Rayleigh (tamaño de

partícula pequeño) o dispersión Tyndall (tamaño de partícula grande), que ocurre sin

prácticamente pérdida de energía.

2) Colisiones inelásticas (donde una parte de la energía del fotón se absorbe y el resto se dispersa:


2) Colisiones inelásticas (donde una parte de la energía del fotón se absorbe y el resto se dispersa:

dispersión Raman), que inducen vibraciones moleculares cuantizadas según los modos normales

de vibración posible en la molécula. Se pueden dar dos casos: Raman Stokes y Raman Anti-

Stokes.

λλλλo

λλλλF

λλλλo

λλλλF

Stokes: λ0 < λF Anti-Stokes: λ0 > λF


Tema 6: Turbidimetría y Nefelometría

TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) de radiación de la zona visible, atraviesa y

golpea una suspensión de partículas coloidales (muestra turbia en una cubeta) ocurre lo

siguiente:

–una parte de la luz es reflejada (a) hacia atrás–una parte de la luz es reflejada (a) hacia atrás

–una parte es diseminada en todas direcciones (dispersión Tyndall) (b)

–parte es absorbida (c)

–parte es transmitida (d)

Generalmente la suma de c y d es la mayor fracción. Como consecuencia (a) y (b) es una

medida indirecta de la turbidez y dicha fracción de luz dispersada se puede usar para el

análisis cuantitativo de disoluciones o suspensiones coloidales, emulsiones, humos o

nieblas (soluciones no homogéneas)



Ambas técnicas sirven para medir la dispersión Tyndall de suspensiones sólidasen un líquido (Propiedad no espectroscopica)

La turbidez y la luz que ella dispersa se puede medir:

1) directamente por la intensidad de luz desviada a, normalmente, un ángulo de 90º con

respecto a la radiación incidente (nefelometría).

2) indirectamente como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución

(turbidimetría).(turbidimetría).

Radiación dispersada

Radiación transmitida

Radiación incidente



La turbidimetría y la nefelometría son dos técnicas complementarias para medir

turbidez pero que emplean distintos instrumentos (similares respectivamente a

un fotómetro y a un flurómetro).

En principio cualquier materia en suspensión, analito que dé una reacción de

precipitación (precipitación inducida), o muestra con microorganismos se puede

cuantificar por su turbidez natural u originada.

En las reacciones de precipitación inducida se deben formar partículas muyEn las reacciones de precipitación inducida se deben formar partículas muy

finas, de tamaño reproducible y que permanezcan en suspensión sin

coagular. Si no se da este último caso, se añade un coloide protector (como

gelatina o glicerina) o un agente tensioactivo.



-La intensidad de luz dispersada depende de: la concentración o densidad del

número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, la longitud de onda de la

radiación incidente y de los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante.

-El procedimiento de medida de la dispersión es generalmente empírico haciendo que

permanezcan invariables las condiciones experimentales de tamaño/forma de las

partículas y de intensidad/longitud de onda usada. Las medidas generalmente usan partículas y de intensidad/longitud de onda usada. Las medidas generalmente usan

una lámpara cualquiera de luz blanca (policromática) pero asegurándonos de que su

intensidad sea constante durante el proceso.

-Sólo se obtienen datos fiables si se controlan escrupulosamente las variables que

afectan al tamaño de partículas, y si se mantiene una distribución uniforme del tamaño

de partículas en la muestra, y entre muestras y patrones.



Esquema de un turbidímetro-nefelómetro que permite medir la luz transmitida y

dispersada en dos ángulos para tener en cuanta los distintos patrones de dispersión de

acuerdo a las característicos y tamaño de las partículas.

P0Fuente

Co

mp

arti

men

to

de

mu

estr

a

Detector 1PP0

Id 90 º

Fuente

Co

mp

arti

men

to

de

mu

estr

a

Detector 1

(Turbidimetría)

P

Detector 2

(Nefelometría 90º)



Turbidimetría-log T = k b C k = f (forma , Φ y λ )

Se aplica a muestras de elevada turbidez dentro de ciertos límites, realizando la medida de una

“absorbancia aparente” (ya que, realmente, no se produce un proceso de absorción, sino de dispersión).

Existe una relación directa entre la “absorbancia aparente” y la concentración de analito o la

concentración celular bacteriana siempre y cuando se trate de suspensiones diluidas ( A< 0.3) ya que

valores mayores producen desviaciones de la “ley de Beer”. En las medidas de turbidez como parámetro

no específico se emplea la reacción de la formazina (hidrazina + hexametilen tetramina) comono específico se emplea la reacción de la formazina (hidrazina + hexametilen tetramina) como

estándar.

Nefelometría

ID = kD I0 C kD = f (forma , Φ y λ )

Es más sensible que la turbidimetría , por lo que se usa para muestras con bajo nivel de turbidez (lo cual,

por otro lado, presenta el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas que suelen involucrar un mayor

error de pipeteo) y que el ajuste en general de las condiciones experimentales es más crítico.


TemaTema 6

Técnicas de dispersión

Bioquímica clínica

Proteinas

Alcaloides

•Desnaturalizar con ác. sulfosalicílico o tricloroacético y medir a 420 nm

• Precipitar con reactivo de Sheibler(Na WO , Na PO , H+)

Turbidez Especies inorgánicas

Alcaloides (Na2WO4, Na3PO4, H+)

Detector de CCD y rejilla de difracción por trasmisión. Basada en capas muy distinto indice de refracción (

en lugar de rejilla de transmisión con relive escalonado en su suprficie. Que es mucho menos eficiente)

El uso de un láser en el verde ( 532 nm), rojo (633 nm), NIR (785 nm) o IR 1064 nm puede ofrecer una

solución al fondo de fluorescencia que satura el detector. Con el fotones de menor energía, el láser NIR o

IR no puede promover la transición electrónica (y por lo tanto la fluorescencia) por el espectro Raman es

más fácil detectar sobre un fondo reducido. Sin embargo cuando se aumenta la longitud de onda de verde a

NIR la eficiencia de la dispersión Raman disminuye, por lo que pueden ser necesarios mayores tiempos de

integración o láseres de mayor potencia.


Tema 6: Evaluación de la Turbidimetria y Nefelometria

La Turbidimetria y Nefelometria son métodos no espectroscópicos y por tanto poco selectivos (reacción de

precipitación selectiva) no se posee espectros y tienen las siguientes características:

- Poco selectivos

-Poco sensibles

COMPARACIÓN CON LOS METODOS ABSORCIOMETRICOS Y FLUORIMETRICOS

-Poco reproducibles

Por el contrario tienen la ventajas de ser 1) métodos sencillos , rápidos y los aparatos son baratos 2)

aplicables a muchísimos ensayos bioanalíticos ( inmunoensayos y ensayos enzimáticos).

La Turbidimetria es formalmente equivalente a medidas absorciométricas aunque generalmente se hacen

con luz no monocromática.

La Nefelometria es formalmente equivalente a medidas fluorimétricas aunque generalmente se hacen con

luz no monocromática.

La Turbidimetría se usa para muestras con gran turbidez por ser más reproducible. La Nefelometría es

más sensible que la Turbidimetría , por lo que se usa para muestras con bajo nivel de turbidez


Tema 6: Dispersión Raman.

ESPECTROSCOPIA RAMAN

La técnica analítica espectroscopia Raman se basa en un fenómeno específico de dispersión

de la luz que presenta alguna similitud y recuerda a la fluorescencia.

En Espectroscopía Raman, las vibraciones moleculares se miden en forma de emisión deEn Espectroscopía Raman, las vibraciones moleculares se miden en forma de emisión de

energía luminosa (radiación Raman dispersada ) como consecuencia de la excitación con

una fuente monocromática de luz visible generalmente del rojo o IRC ( la intensidad de luz

dispersada es sólo de 10-5 a 10-6 de la incidente).

Para evitar la aparición de emisiones de fluorescencia, el haz excitante es de la “zona del

rojo” (600-1000 nm), donde la energía del fotón es insuficiente para activar la molécula al

nivel electrónico excitado y desencadenar fluorescencia. Se evitar así un elevado fondo que

podría suponer una fluorescencia simultánea.



El haz excitador debe ser:

a) de elevada intensidad

b) altamente monocromático

Las fuentes láser de luz roja o

similar cumplen estos

requisitos, por lo que son las

usadas habitualmente en esta

técnica analítica

c) De λ elevada (zona visible)

En los espectros Raman se representa la diferencia en cm-1 de la radiación

dispersada con respecto a la radiación original. Este desplazamiento en energía

de las emisiones Raman de una molécula con respecto a la energía asociada la

longitud de onda incidente es una importante arma analítica complementaria

en cuanto a aplicaciones a la espectroscopia de absorción infrarroja.

técnica analítica

espectrocópica.



Choque

elásticoS0

hνo S0

Dispersión Rayleigh

Raman Stokes (νo>νf)

Choque

inelásticoS0

hνo S0

Choque

inelásticoS0

hνo S0

Raman Anti-Stokes (νo<νf)



Como regla, la dispersión Raman de la luz es solo

observada para un ángulo de 90° y se usan

principalmente las líneas Raman Stokes que son

más intensas y contienen toda la información de la

molécula.

Inte

nsi

dad

Rayleigh

StokesS0

λ

Stokes

Anti-Stokes

S0

Las diferencias de energía entre la λIncidente y

las λStokes se corresponden con las energías

necesarias para producir transiciones

vibracionales. Por lo tanto, midiendo dicha

diferencia de energía es posible obtener

información sobre estas transiciones (es

decir, sobre la estructura).

λIncidente


Espectroscopía

RamanRadiación

Induce vibraciones, reemite a menor E

Toma E de moléculas vibrando

Se reemite sin intercambio de E


Complementa a IR

Análisis InstrumentalTema 6: Dispersión Raman.

Inte

nsi

dad

λ fuente = 532 nm

λ = 576 nm

Inte

nsi

dad

λ fuente = 785 nm

λ = 885 nm

Si se representa la intensidad de radiación dispersada en función de su λ, el espectro

obtenido depende de la λ incidente…

Inte

nsi

dad

λ

λ = 576 nm

Inte

nsi

dad

λ

= 885 nm

A) Espectro Raman con

una fuente de excitación

de 532 nm

B) Espectro Raman con

una fuente de excitación

de 785 nm

Análisis InstrumentalTema 6: Dispersión Raman.

…pero si se trabaja en número de ondas en unidades relativas (asignando a la radiación

incidente un valor de 0), el espectro es independiente de la fuente empleada.

532 nm 576 nm

Nº ondas

absolutas 18797 cm-1 17355 cm-1

Nº ondas

relativas 0 cm-1 -1142 cm-1

785 nm 885 nm

Nº ondas

absolutas 12739 cm-1 11297 cm-1

Nº ondas

relativas 0 cm-1 -1142 cm-1

A B

Inte

nsi

dad

νrelativas

−1142 cm-1

relativas 0 cm-1 -1142 cm-1 relativas 0 cm -1142 cm

0


Tema 6: Espectrofotómetro de Raman.

El ESPECTROFOTÓMETRO RAMAN

Fuente

Laser

Mono-

Radiación

incidenteRadiación

dispersada

Filtro

bloqueante

Espejo

concentrador

FuenteDebe proporcionar una radiación de monocromática intensa con λ visible/IR cercano. Hoy día,

los láser se usan para esto (haz de luz muy estrecho e intenso que puede ser focalizado

perfectamente hacia la muestra). Una línea de un plasma gaseoso productor de radiación láser

(láser iónico de Ar o Kr) es enfocada en la muestra.

Mono-

cromadorDetector

Radiación

transmitida

Muestra



Raman-FT



Compartimento de muestraLas muestras pueden ser dispuestas en tubos de punto de fusión cuando se trata de

sólidos en polvo, líquidos puros o disoluciones, y para gases en cubetas de

múltiples reflexiones. Se requiere un sistema de enfriamiento efectivo para

sustancias termosensibles o que pueden experimentar degradación fotolítica, por

eso las medidas se hacen mientras la muestra está rotando.

Filtro bloqueantePara eliminar la dispersión Rayleigh proveniente de la fuente laser.

Monocromador (también existen espectrómetros Raman-FT)

Debido a la débil intensidad de la radiación de dispersión Raman y la necesidad de

separar ésta de la radiación Raleigh, el monocromador equipado debe ser de alta

calidad óptica. Con el monocromador de rejilla de difracción holográfica se alcanza

una muy buena resolución.



Detector

En el fotomultiplicador los fotones, que corresponden a la región visible/IR cercano

pero cuyos desplazamientos de λ con respecto a la λ incidente se dan en una

extensión de la zona IR medio, producen una corriente fotoeléctrica. A pesar de que

la intensidad de la luz Raman producida es muy pequeña, el detector

fotomultiplicador es muchísimo más sensible que los detectores para absorción de IRfotomultiplicador es muchísimo más sensible que los detectores para absorción de IR

constituidos por termoelementos.

La posibilidad de usar tubos fotomultiplicadores, junto con que los picos son muy

estrechos y con poco fondo, hace que la espectroscopia Raman dé mejores resultados

que la IR en análisis cuantitativos.Ir = k Φ P0 b C = K C


Tema 6: Comparación de la Espectroscopía Raman con la Espectroscopía IR.

La base de espectrocopía IR es la absorción de la energía de fotones (hv) para la excitación de vibraciones

moleculares. Los espectros Raman e IR no coinciden en cuanto a las bandas que aparecen, si bien pueden

tener algunas bandas en común. En Raman se obtienen espectros algo más simples, pues los sobretonos o

picos de combinación suelen ser muy poco intensos.

- La espectroscopía Raman puede ser usada para identificar moléculas inactivas al IR por tener una total

COMPARACIÓN CON LA ESPECTROSCOPIA IR Y APLICACIONES

- La espectroscopía Raman puede ser usada para identificar moléculas inactivas al IR por tener una total

simetría, o en las que abundan grupos simétricos o grupos poco polares. El IR va mejor para investigar

moléculas poco simétricas y con grupos muy polares.

- En Raman se puede usar el agua como disolvente y cubetas de vidrio.

-La ventaja fundamental de la espectroscopia Raman respecto al IR es su mejor aptitud para realizar

análisis cuantitativos (mayor linealidad y sensibilidad), no obstante el análisis de estructura de compuestos

orgánicos sigue siendo una aplicación destacada.

-Se hacen análisis de muestras artísticas tales como pinturas para identificar los pigmentos (técnica no

destructiva)

06metodos de Dispersion

Documents

Transcript of 06metodos de Dispersion