מכון טכנולוגי לישראל –הטכניון

Technion – Israel Institute of Technology

ספריות הטכניוןThe Technion Libraries

ייקובס'ג ואן'וג ארווין ש"ע מוסמכים ללימודי הספר בית

Irwin and Joan Jacobs Graduate School

© All rights reserved

This work, in whole or in part, may not be copied (in any media), printed,

translated, stored in a retrieval system, transmitted via the internet or other electronic means, except for "fair use" of brief quotations for academic

instruction, criticism, or research purposes only. Commercial use of this material is completely prohibited.

© שמורות הזכויות כל

חיבור זה או , להפיץ באינטרנט, לאחסן במאגר מידע, לתרגם, להדפיס, )במדיה כלשהי(אין להעתיק

ת או רוביק, הוראה, בקטעים קצרים מן החיבור למטרות לימוד "שימוש הוגן"למעט , כל חלק ממנו .שימוש מסחרי בחומר הכלול בחיבור זה אסור בהחלט. מחקר

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

TSPOחקירת המבנה והפעילות של הקולטן המיטוכונדרי,

יגאל לינקובסקי

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

TSPOי, והפעילות של הקולטן המיטוכונדר חקירת המבנה

חיבור על מחקר

לשם מילוי חלקי של הדרישות לקבלת תואר

בכימיה למדעיםמגיסטר

יגאל לינקובסקי

הוגש לסנט הטכניון מכון טכנולוגי לישראל

2102 יוליתשע"ב חיפה אב

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

נעם אדיר בפקולטה לכימיה על שם שוליך המחקר נעשה בהנחיית פרופ'

העזרה הנדיבה במימון השתלמותיטכניון על קרנות הברצוני להודות ל

תודתי המיוחדת נתונה לפרופ'ח נועם אדיר

על הנחייתו, עזרתו ותמיכתו במחקר ועל יותר מזה

:כמו כן ברצוני להודות על שיתוף הפעולה

לפרופ' משה גביש

לדר' סבטלנה לסשינר

של אמנון הראל צוות המעבדהל

מרכז לפרוטאומיקה בטכניוןצוות הל

בגרנובל, צרפתמאיץ החלקיקים האירופאי אנשי ל

נועם אדיר לכל צוות המעבדה של פרופ'ובמיוחד

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

תוכן עניינים

0..................................................................................................................................תקציר

TSPO................................................................................4המיטוכונדרי הקולטן -מבוא

4............................................................................................................................מבנה וארגון

8...................................................................והגדרת התפקיד הפיזיולוגי.............פעילות פריסה,

TSPO..........................................................................................................01ליגנדות קושרות

00................................................................................................................עקרונות הגיבוש

01.......................................................................................................................גיבוש חלבונים

04.......................................................................................................................גיבוש טכניקת

X-ray......................................................................................01קריסטלוגרפית עקרונות

01...................................................................וגיבוש חלבונים ממברנליםהאתגר בהפקה

08..........................................................................................................................דטרגנטים

20...................................................................................................................בדיקת פעילות

X-ray...................25בשיטת קריסטלוגרפית TSPO -המוטיבציה לחקור את מבנה ה

21..................................................................................................................מטרות המחקר

21.....................................................................................................חומרים ושיטות עבודה

21.....................................................................................................................םיחומרים כללי

21.......................................................................חומרים לביטוי ביתר של חלבון משובט ממברנלי

21...............................................................................מתאי חיידקים חומרים להפרדת ממברנות

21.....................................................................................חומרים לבידוד וניקוי חלבון ממברנות

SDS-PAGE.....................................................................................................21חומרים עבור

TSPO.....................................................................................28-התמיסות בהן התגבש חלבון ה

28....................................................................................ליפוזומים-חומרים עבור יצירת פרוטאו

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

22...................................................................................................................שיטות עבודה

22........................................................................................משובט TSPOביטוי יתר של חלבון

E. coli.........................................................................................22 -הפרדת ממברנות מתאי ה

11................................................................................מתוך הממברנות TSPOבידוד וניקוי של

TSPO.......................................................................................................................11גיבוש

Sodium dodecyl sulfat polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)......................11

10...............................................................................................................קביעת ריכוז חלבון

10...............................................................................לתוך ליפוזומים TSPOהרכבה מחדש של

] -ל TSPOבדיקת קישור 3H]PK11195.................................................................................10

12............................................................................................................אחסון ושינוע גבישים

MUSCLE.......................................................................................12 -אינפורמטית-תוכנה ביו

11......................................................................................................................תוצאות ודיון

R. norvegicus...............................................................11 -מ TSPOלחלבון שיבוט הגן המקודד

TSPO...............................................................................................14-ביטוי ביתר של חלבון ה

TSPO...................................................................................................14-בידוד וניקוי חלבון ה

18....................................................................................על ידי ספקטרומטר מסות TSPOזיהוי

TSPO............................................................................................................12-גיבוש חלבון ה

TSPO.........................................................................................................41-בדיקת פעילות ה

51.................................................................................................................................סיכום

TSPO....................................................................54סיכום ניסיונות הגיבוש של -נספח

11...............................................................................................................................מקורות

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

רשימת טבלאות

01..................................................................במערכת העצבים TSPO: שינויים בביטוי 0טבלה

TSPO ..................................................................................11: סיכום השיבוטים של 2 טבלה

11...............................................................הדטרגנטים בהם השתמשנותכונות סיכום : 1 טבלה

TSPO -בכדי להמיס ממברנות ולייצב את ה

TSPO..............................................................................................11: תהליך בידוד 4 טבלה

TSPO..........................44: הדטרגנטים השונים בהם השתמשנו לשיפור תנאי הגיבוש של 5טבלה

51.......................נטיבי כפי שקיים ברקמות שונות בעכבר TSPOשל Kd -ו Bmax: ערכי 1 טבלה

E. coliבממברנה של משובט TSPOבהשוואה לערכים הניסיוניים של

ליפוזום-וכפרוטאו

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

מתארים רשימת איורים

TSPO...................................4בין רצף חומצות אמינו של MUSCALבעזרת : השוואה0איור

מאדם ומחולדה

hydropathy analysis.........................................................1המתבססת על : אנימציה2איור

R. sphaeroides -מ TspO טופולוגיה של המדמה

1.........אלקטרונים...........על פי מיקרוסקופית TspO: תמונות צפיפות אלקטרונים של 1איור

TspO......................................................................1: מודל המתאר פרופיל כללי של 4איור

אלקטרונים מתוך מיקרוסקופית ניסיונית שהתקבלהעל פי מפת צפיפות אלקטרונים

1.................................................טוכונדריהמצוי בממברנה החיצונית של המי TSPO: 5איור

ונושק לממברנה הפנימית

1............................מעכבר TSPOטי של א: מודל תלת ממדי של פוטנציאל אלקטרוסט1איור

TSPO.................................................00: ליגנדות שונות המסוגלות להקשר לרצפטור 1איור

01...................................................................................................גיבוש: דיאגרמת 8איור

05.................................................המתארת את הקורלציה בין חלבון גיבוש: דיאגרמת 2איור

בשיטת "דיפוזיה באידוי" לחומרים משקעים בעת התגבשות החלבון

05........................................: שיטת "דיפוזיה באידוי" לגיבוש חלבונים בטיפה יושבת01איור

21.....................................................................ממברנות על ידי דטרגנט : המסה של00איור

20...............................ם במהלך ההמסה של הממברנותהתהליכים המתרחשי תיאור: 02איור

וייצובו במיצלות החלבון הממברנלי, מיצוי על ידי דטרגנט

21.................: סכמה המתארת את השלבים השונים במדידת קישור ליגנדות לרצפטור01איור

24......................................................................ליגנדה לרצפטוראגרמת קישור די: 04איור

כפונקציה של ריכוז הליגנדות החופשיות בתמיסה

Scatchard plot.................................................................................24דיאגרמת : 05איור

15......................................................................גודל ומטען קבוצת הראשהשפעת : 01איור

דטרגנטים על דנטורציה של חלבונים אורך שרשרת הפחמנים בקבוצת הזנב שלו

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

11.........................................................................: מבנה מולקולארי של דטרגנטים01איור

SDS-PAGE...............................................................................11על גבי TSPO: 08איור

SDS-PAGE......................................11של דוגמת חלבון הבודדה מג'ל MS: אנליזת 02איור

לאחר ניקוי חלבון בקולונת ניקל

18...............................................אשר נוצרו בשיטת "דיפוזיה באידוי" TSPO: גבישי 21 איור

(reservoirתמיסות הגיבוש ) תנאיופירוט בתוך "טיפה יושבת"

מהן התקבלו הגבישיםהשונות

12..................................................של דוגמת חלבון שהומסה מגבישים MS: אנליזת 20איור

12..................., גרנובל, צרפתID14-4, ESRF -ב TSPO: תבניות דיפרקציה של גבישי 22איור

Type 2.....................40 -ו -Type 1 -בישים מחלבונים ממברנליםגסוגי מערכים של : 21 איור

41...............................................אשר נוצרו בשיטת "דיפוזיה באידוי" TSPO: גבישי 24 איור

עם תערובות של דטרגנטים בתוך "טיפה יושבת"

44..................., גרנובל, צרפתID23-2, ESRF -ב TSPO: תבניות דיפרקציה של גבישי 25איור

TSPO.................................................................41של Scatchard plot: דיאגרמת 21איור

E. coliשל מופרדות המצוי בממברנות

48..............................ליפוזומית הנוצרת משכבה כפולה של ליפידים-פרוטאו: מערכת 21איור

TSPO -אשר נחצים על ידי חלבוני ה

42.......................................ליפוזום-כפרוטאו TSPOשל Scatchard plot: דיאגרמת 28איור

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

1

תקציר

רחב של תפקידים ביוכימיים מגוון בעליהם ותאים חיים חיוניים לאבני בניין משמשים כחלבונים

-אינטראקציות עם מאקרו באמצעות החלבונים מסוגלים לבצע את תפקידם. חשובים לקיומינוה

של המרחבי. המבנה לחלבונים גנדותליהמהוות מגוון מולקולות קטנות גם עם ומולקולות אחרות

ובעקבות כך ליות שלו אהחלבון מאבד את הפונקציונע נפג כאשר הראשון, מכתיב את פעילותו החלבון

במידה תלויה עם תהליכים פתוגניםהתמודדות . תאיםעלולות להתעורר תופעות פתוגניות שונות ב

פענוח .ביוכימייםתהליכים תם אולהבין כיצד חלבונים מעורבים ונוטלים חלק ב שלנו ביכולתרבה

ם בפרט ביוכימיים בכלל ובתהליכים פתוגניהמבנים המרחביים של חלבונים המעורבים בתהליכים

ה. הבנת הקשר בין תסייע משמעותית להבנת אופן הפעילות וההשפעה של החלבונים בתהליכים אל

ניעה של תהליכים עיכוב ומ חלבון יסייע לפיתוח טיפולים ועיצוב תרופות לניטור,המבנה לפעילות ב

היא שיטת ה חלבוני ברזולוציה אטומית גבוההאחת השיטות הפיזיקאליות לפענוח מבנם.פתוגני

. X-rayקריסטלוגרפיה באמצעות קרינת ה

עוסק מחקרנולפיתוח תרופות מבוססות מבנה. שמש כאבן דרך בתזה זו נציג מחקר שעתידו עשוי ל

-זה הינו חלבון טרנס קולטן. 18KDa( שגודלו translocator protein) TSPOמיוחד הנקרא בקולטן

מהווה חלק ממערך על TSPO .המיטוכונדריה ממברנלי הממוקם בעיקר בממברנה החיצונית של

( המצוי באזור המגע שבין הממברנה החיצונית permeability transition pore) PTPחלבוני המכונה

ידוע ומאופיין והוא להעביר TSPOו העיקרי של תפקידככל הנראה, והפנימית של המיטוכונדריה.

כולסטרול דרך הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה אל הממברנה הפנימית. שלב זה הינו שלב

מחקרים ביוכימיים סטרואידים. -סינתזה של סטרואידים ונוירו-קובע מהירות בתהליך הביו

בתהליכים פתוגנים שונים כמו סרטן, הפרעות גם רב מעו TSPOופרמקולוגיים שונים הראו כי

-ההבנה שיש בידנו כיום לגבי המבנה והפעילות של חלבון ה נוירולוגיות והפרעות פסיכיאטריות.

TSPO היא רחוקה מאוד מלהיות מלאה. מבנה החלבון הידוע כיום הוא פרופיל מודל כללי מאוד אשר

לקולטן ליגנדות הבנת מנגנון הקישור של ילות חלבון זה. פעמאפשר הבנה מבנית משמעותית לגבי אינו

TSPO .חיונית מאוד לצורך עיצוב תרופות חדשות כנגד אותם תופעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות

אמורה לתת לנו מבט מעמיק יותר אל תוך המבנה האטומי של X-ray -שיטת הקריסטלוגרפיה ב

. החלבוןשיאפשר לנו להציע מנגנון מדויק יותר לגבי הפעילות של דברהחלבון

TSPO תהליכי הביטוי, אחוז הידרופוביות מאוד גבוה. מכאן, כי חלבון ממברנלי ועל כן בעל הינו

מחקרנו התמקד בניסיונות להתמודד עם .ביותרמאתגרים הם של החלבון הבידוד, הניקוי והגיבוש

משובט המכיל קבוצה אנימלי TSPO-השתמשנו באנו ה ובפעילות החלבון.אתגר זה מבלי לפגוע במבנ

ית פרו באמצעות כרומטוגילי בכדי לנקותחומצות אמינו מסוג היסטידין בקצה הקרבוקס שששל

בדרגת ניקיון גבוהה התקבלה כאשר הגן המקודד TSPOאפיניות לניקל. כמות גדולה יחסית של

שמוקדם יותר הוכח כי E. coli C41והביטוי נעשה בחיידקי pET20bלחלבון שובט בווקטור הביטוי

E. coli -ה בכדי למצות את החלבון מתוך ממברנת זהו זן יעיל לביטוי יתר של חלבונים ממברנלים.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

2

למצות ממנה את ,היה עלינו לבחור דטרגנטים מתאימים אשר יהיו מסוגלים להמיס את הממברנה

מיטבי המשמר את המבנה ואת הפעילות שלו. סרקנו מגוון של דטרגנטים החלבון ולייצב אותו באופן

שלנו המטרהולכן הידועים מהספרות כדטרגנטים עדינים אשר אינם גורמים לדנטורצית חלבונים.

הצלחנו . בתום סריקות וניסיונות רבים הייתה למצוא את הדטרגנט האידיאלי ביותר בריכוז מתאים

הלא טעון, דטרגנטה בעזרת ימית מבלי לגרום לו לדנטורציהבו בתמיסה מאת החלבון ולייצלמצות

DDM (dodecyl β-D-maltoside) לאחר ניקוי החלבון, קיבלנו דוגמה גדולה יחסית .4%בריכוז של

לנו לגבש את החלבון. פשרהכזו שא וברמת ניקיון והומוגניות

לליגנדה האנדוגנית, כולסטרול, אלא גם ניות גבוהה לא רק יבאפ להקשרמסוגל TSPOנמצא כי

עובדה זו עומדת בבסיס בדיקת פעילות החלבון אשר מודדת את .PK11195טית, תלליגנדה הסינ

ממערכת משובט הוא חלק TSPOלליגנדה זו. תוצאות הבדיקה הראו כי כאשר TSPOהקישור של

טית תלליגנדה הסינ קישור הוא מגלהליפוזום, -ם ממברנה חיידקית או פרוטאו, בין אתיליפיד

כי ראהנעל פי ממצאי הפעילות כמו כן, .נטיבי TSPOבדומה לאפיניות של מולר-ננובאפיניות של

של Bmaxדומים בערכם לערכי כאשר הוא בממברנה המבודדת של החלבון המשובט Bmaxערכי

TSPO נטיבי כצפוי, אך נמוכים מאוד מהמצופה כאשר החלבון המשובט הוא חלק ממערכת

.ליפוזום-הפרוטאו

לגיבוש בשיטת "דיפוזיה באידוי" בטכניקת הטיפה , העמדנו את החלבוןTSPO מבחינת פענוח מבנה

בו הגבישים נוצרו תוך שלושה ימים והיו בעלי מורפולוגיה רכה יחסית. הגבישים לא הני .היושבת

אופן הגיבוש של חלבונים ממברנלים במערך הגבישי מושפע באופן תבנית דיפרקציה אינפורמטיבית.

היה משמעותי מהבדלים כימיים ואפילו הקטנים ביותר בין הדטרגנטים בהם משתמשים בגיבוש ולכן

היאעלינו להתמקד במאמץ לסרוק מגוון רחב של דטרגנטים לשיפור המערך הגבישי. בחירת הדטרגנט

מיציבות והומוגניות החלבון בתמיסת הגיבוש כיוון שמיצלות הדטרגנט חייבות לא פחותפקטור חשוב

היה כדי לשפר את איכות הגבישים סריג הגבישי של החלבון, ולכן התוך מאלי בבאופן אופטי להשתלב

בכך את האינטראקציות בסריג ו וחזקאשר י מבנה וריכוז מתאימיםלבחור דטרגנטים עם לנסות עלינו

נבדלים זה ה בעלי תכונות פיזיקאליות שונותדטרגנטים מגוון נוקסרלו להיות מסודר יותר. יגרמו

השוני בגודל מזה על פי אורך השרשרת הפחמנית ובגודל ומטען חשמלי של "קבוצות הראש".

. אומנם סריג הגבישידטרגנט ב-המיצלות שייווצרו עשוי לשפר את איכות אריזת מערך חלבון

גבישים לא הניבו תבנית דיפרקציה מורפולוגית הגבישים השתפרה במעט אך גם הפעם ה

תופעות מעניינות שהתרחשו בשלבי הגיבוש היו שבעת ניסיון לגבש את החלבון עם אינפורמטיבית.

PK11195 ,TSPO ות עשוי שקע וכאשר הליגנדה הוספה לגביש קיים, הגביש התפרק. תוצאות אלו

את לשמר יםבתמיסת הגיבוש ובגביש מצליח יםהמשובט להעיד על כך שחלק מהחלבונים

, אך תוצאות אלה עדיין לא מהוות PK11195 של הליגנדות מסוג הפונקציונאליות שלהם בקישור

במצב TSPOלא הצלחנו למצוא עדויות לפעילות של הוכחה משמעותית לכך אלא השערה בלבד.

להמשיך ולסרוק שילובים נוספים, חדשים ואחרים של דטרגנטים לעתיד, יש מבחינת נתיבים. מומס

כמו כן . יחד עם החלבון בכדי לנסות ולהגיע לשילוב המנצח שייצור מבנה מספיק מסודר לדיפרקציה

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

3

אך הפעם ממקור חיידקי ולא אנימלי, ייתכן כי ביטוי TSPO-עלינו לנסות ולשבט חלבון הומולוגי ל

ישפיע על אופן הקיפול של החלבון הן בממברנה E. coli -ממקור חיידקי ב TSPO-לחלבון הומולוגי

דטרגנט במצב מומס ובעיקר בהתארגנותו בקופלקס הגבישי כך השל החיידקים, הן במיצלות של

כיוונים אלה שהגבישים שיתקבלו יהיו מסודרים יותר ברמה שיניבו דיפרקציה אינפורמטיבית.

.TSPO-תנו יותר אל עבר האפשרות לקבל מבט פנימי אל תוך חלבון העשויים בעתיד לקדם או

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

4

TSPOהמיטוכונדרי הקולטן -מבוא

מבנה וארגון

TSPO -המקודד ל TSPO. cDNAהמכונה 18kDa translocator protein, -מחקרנו עוסק בחלבון ה

. רצף חומצות האמינו מכיל 84עכברמו 84חולדהמ, 48בקרמ, 47אדםמבודד ושובט ממגוון יצורים כולל

חומצות אמינו 964 -ורכב מאחוז גבוה של חומצות בעלות אופי הידרופובי. בסך הכל הרצף מ

. בדומה לרוב 08-05( בין היונקים השונים48%בטריפטופן, עם הומולוגיה גבוהה )מעל העשירות

מקודד בגרעין התא, מתורגם בציטופלזמה ואז מכוון אל תוך TSPOים, המיטוכונדרהחלבונים

. 08-06המיטוכונדריה

:אנושי הינו TSPOחומצות האמינו של 012רצף

MAPPWVPAMGFTLAPSLGCFVGSRFVHGEGLRWYAGLQKPSWHPPHWVLGPV

WGTLYSAMGYGSYLVWKELGGFTEKAVVPLGLYTGQLALNWAWPPIFFGARQ

MGWALVDLLLVSGAAAATTVAWYQVSPLAARLLYPYLAWLAFATTLNYCVW

RDNHGWHGGRRLPE

צהובות מתחת -(. העמודות החומותR( ומחולדה )Hמאדם ) TSPO: השוואה בין רצף חומצות אמינו של 0איור

להשוואה מתארות את קרבת ההתאמה בין חומצות האמינו של שני היצורים. העמודות בשחור מצביעות על חומצות

MUSCEL -האמינו השמורות/ הזהות בין שני היצורים. ההשוואה בוצעה בתוכנת ה

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle.)

Fig 1: Amino acid sequence alignment of TSPO from Human (H) and Rat (R). The columns in yellow-

brown indicate the quality of the identity of the residues and the columns in black indicate the

conservation of the biochemical character of the side chains. The alignment was performed using

MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

5

TSPO ממוקם בממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, בעיקר באזור נקודת המגע בין שתי

Vladimir M. Korkhov, הציעו 0898בשנת הממברנות של המיטוכונדריה, החיצונית והפנימית.

57-מודל המתאר פרופיל מתאר כללי של חלבון ה ושותפיוTSPO החוקרים השתמשו בחלבון .

החלבון החיידקי מכונה, . Rhodobacter sphaeroidesאנושי ממקור חיידקי, TSPO -הומולוגי ל

TspO ,tryptophan-rich sensory protein המבנה הראשוני של .TspO מאוד דומה למבנה הראשוני

בין שני הרצפים כיסוי 33.5%אנושי, עם TSPOשל חיידקי TspOחוקרים הציעו כיהזאת ועוד, ,58

רמת התאמה זו נחשבת דיי משמעותית. במהלך , 04האנושי TSPO -זה בעל מבנה ופעילות דומים ל

של החלבון בסביבה ליפידית ובאמצעות הדמיית גלילייםהמחקר הצליחו החוקרים ליצור גבישים

EM ,electron cryomicroscopy , 10מדי ברזולוציה של מקיבלו פרופיל תלתÅ המערכת של

הינו דימר כאשר היחידה החוזרת בגביש הגלילי היא מערכת של TspO -הגבישית. ההדמיה הראתה ש

חוצים את TspOבכל מונומר. על פי צפיפות האלקטרונים נראה כי הדימרים של סלילי אלפאחמישה

כדימר מתפקד בעצם כשני אתרי TspO -הממברנה הליפידית. אחת ההשערות של החוקרים הייתה ש

קישור במהלך העברת סובסטרט אל תוך המיטוכונדריה, כלומר מתקיים שיתוף פעולה בין

צפי בין החלבון החוקרים הייתה, שמפאת הדמיון הרי המונומרים במהלך פעילות החלבון. הסברה של

אנושי הינו TSPOיידקי לחלבון האנושי ומכיוון שמדובר בשני חלבונים טרנס ממברנלים, אזי גם הח

. מודל שפותח בשנת 57דימר כך שכל מונומר מורכב מחמישה אלפא הליקסים היוצרים מבנה גלילי

טרמינלי של N-כך שהקצה המצביעים על in vitroניסויים ו ,hydropathy analysisבאמצעות 9444

ממוקם TSPO -טרמינלי של ה C -והקצה הממברנלי של המיטוכונדריה -החלבון ממוקם בתווך הבין

ת בחלק החשוף לציטופלזמה, אזור זה מכיל דומיין של חומצות אמינוממברנה המיטוכונדרילמחוץ

CRAC- cholesterolקישור לכולסטרול ) כאתר(, המשמש ATVLNYYVWRDNSבעל הרצף )

recognition amino acid consensus .)חומצות אמינו 09-כל אלפא הליקס במונומר מורכב מ

. 60בקירוב, כך שבוודאות כל הליקס ארוך דיו בכדי לחצות את הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה

עשוי לתפקד כמעין תעלה אשר מעבירה כולסטרול מהציטופלזמה, כאשר TSPO -המודל מציע ש

טרמנלי משמש כאתר קישור, דרך התעלה הנוצרת על ידי חמשת האלפא הליקסים אל C -הקצה ה

בעל פני שטח הידרופילים אך לא טעונים בחלק הפנימי של TSPOתוך המיטוכונדריה. על פי המודל,

התעלה, מה שמאפשר למולקולות כמו כולסטרול לחצות את הממברנה של המיטוכונדריה אל החלק

. 16, כאשר כולסטרול עובר מודיפיקציות כימיות תוך כדי המעברההפנימי של הממברנ

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

6

טופולוגיה של המדמה: אנימציה 2איור

R. sphaeroides TspO

hydropathy analysisהמתבססת על

(M. Korkhov 2010).

: תמונות צפיפות 1איור

על TspOאלקטרונים של

-EM( .Kפי מיקרוסקופית

H)- דימרים של החלבון((M.

Korkhov 2010.

: מודל המתאר פרופיל 4איור

על פי מפת TspOכללי של

צפיפות אלקטרונים ניסיונית

שהתקבלה מתוך מיקרוסקופית

EM(M. Korkhov 2010.)

Fig 2: Cartoon of the predicted

topology of R. sphaeroides TspO

based on hydropathy analysis and the

“positive inside” rule (M. Korkhov

2010).

Fig 3: Grayscale Density

Slices of the TspO 3D

Reconstruction. (H-K)

The TspO dimer viewed

perpendicular to ther

membrane plane (M.

Korkhov 2010).

Fig 4: Interpretation of the

experimental density map

(M. Korkhov 2010).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

7

מצוי בממברנה החיצונית של המיטוכונדריה ונושק לממברנה TSPO: 5איור

. ANT -ואת ה VDAC -מהווה חלק ממערך חלבוני הכולל את ה TSPOהפנימית.

סינתזת סטרואידים בכך שכולסטרול שנקשר קשירת ליגנדה משפעלת את תהליך

ועובר דרך CRACבדומיין המכונה TSPO -טרמינלי של ה C-לאתר קישור בקצה ה

התעלה שיוצרים חמשת האלפא הלקסים של החלבון אל תוך המיטוכונדריה.

הכולסטרול עובר שרשרת תהליכים אנזימתים המתחילה בתגובה עם ציטוכרום

054P ואיד סטר-ליצירת הנוירוpregnenolone אשר בדיפוזיה עובר בחזרה

.R. Rupprecht et al. 2010)לציטופלזמה )

: מודל תלת ממדי של 1איור

פוטנציאל אלקטרוסטאטי של

TSPO מעכבר. מונומר של

TSPO יוצר תעלה של חמישה

אלפא הליקסים, מעביר דרכה את

מולקולת הכולסטרול )הצבועה

בצהוב( מהציטופלזמה אל

המיטוכונדריה דרך הממברנה.

הכולסטרול נכנס לתעלה דרך פתח

טעון שלילית )צבע אדום( ונדחף

לכוחות הודותבתוכה

הידרופוביים )צבע לבן( או דרך

מנגנון אחר לא ידוע. צבע אדום

מסמל אזור טעון שלילית

((R. Rupprecht et al. 2010.

Fig 5: Mitochondrial localization of TSPO in the outer mitochondrial

membrane, where it associates with the voltage-dependent anion

channel (VDAC) and the adenine nucleotide transporter (ANT) of the

inner mitochondrial membrane. Binding of a TSPO ligand favours the

transport of cholesterol to the inner mitochondrial membrane. The

cholesterol side-chain-cleaving cytochrome P450 enzyme, which is

located at the inner mitochondrial membrane, converts cholesterol to

pregnenolone, which is a neurosteroid (R. Rupprecht et al. 2010).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

8

ם נוספים ציה עם מספר חלבונים מיטוכונדריאינטראקב מצוי TSPOכמו כן, מחקרים מראים כי

ממברנה הפנימית של מערך חלבוני כולל הממוקם הן בממברנה החיצונית והן ב היוצרים

-הו VDAC, voltage-dependent anion channel -המיטוכונדריה. מבין החלבונים הנוספים נמנים ה

ANT, adenine nucleotide transporter.69-65 זאת ועוד, חלבונים ציטופלזמטים הראו אינטראקציה

. סיגנלים תוך תאיים למיטוכונדריה משמש כעוגן המעביר TSPO -, דבר המרמז על כך שTSPOעם

פולימרים )בעיקר דימרים וטרימרים( עולה כאשר פעילות -ליצור הומו TSPOהיכולת של

. הרכב החלבונים 4,68במהלך סינתזת סטרואידים המיטוכונדריה עולה, למשל במהלך חלוקה תאית או

ת ברקמה ספציפית ובתא ספציפי עשוי להשפיע ואף להגדיר את נה מיטוכונדריהליפידים של ממברו

מיטוכונדריה. בממברנת ה TSPOהפעילות של

פריסה, פעילות והגדרת התפקיד הפיזיולוגי

. תצפית זו יחד עם כך 1מביאה לפנוטיפ קטלני בעכברים עובריים TSPOנמצא כי עיכוב הפעילות של

בהתפתחות TSPO, מאירים על החשיבות של 2,4שמור היטב לאורך האבולוציהינו חלבון ה TSPO -ש

מבוטא באיברים רבים, הרמות הגבוהות ביותר שלו TSPO -תקינה של רקמות תאיות. למרות ש

מצויות ברקמות המכילות תאים האחראים לסינתזה של סטרואידים כמו האדרנל, בלוטות מין ותאי

5,8בדרך כלל מבוטא בתאי מיקרו גליה TSPO(, CNS)מוח. במערכת העצבים המרכזית

. כמרכיב 8,4נמצא גם בחלק מתאי עצב כדוגמת הנוירונים TSPO. כמו כן, ביטוי של 0,6ובאסטרוציטים

בעל מספר תפקידים הכוללים העברה של TSPOעיקרי בממברנה החיצונית של המיטוכונדריה,

של ממברנת המיטוכונדריה, מוות תאי החדירותוי כולסטרול, סינתזת הורמונים, נשימה תאית, שינ

מעביר כאמור כולסטרול TSPO. בתאים המסנתזים סטרואידים, 5,8,4,98-90)אפופטוזיס( וחלוקה תאית

. שלב זה הינו שלב קובע מהירות בסינתזת המחוץ ממברנת המיטוכונדריה אל הממברנה הפנימית של

. כאשר הכולסטרול מגיע לאזור הממברנה הפנימית של 95,98,90סטרואידים ונויטרוסטרואידים

אשר עוזב pregnenoloneצר היו P450המיטוכונדריה, הוא מעורב בתהליך אנזימתי עם ציטוכרום

את המיטוכונדריה ועובר טרנספורמציה אנזימתית ברשתית האנדופלזמתית בה בסופו של תהליך

לבין סינתזת סטרואידים. TSPOיה בין רמות הראו קורלצ in vivoמחקרים ייוצרו הסטרואידים.

-למרות שסטרואידים בכמות גדולה נדרשים לאספקה עבור כל הגוף, רק כמות קטנה של נוירו

הוא האפקטור TSPOסטרואידים נוצרת במוח ותפקידם לווסת ולבצע רגולוציה למערכת העצבים.

Fig 6: Three-dimensional model of the electrostatic potential of the mouse TSPO indicates that

cholesterol enters the TSPO channel from the top (cytosolic) surface and is then pulled down

by an internal negatively charged patch (R. Rupprecht et al. 2010).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

9

TSPOם. כמו כן, נמצא כי ביטוי סטרואידי-היחידי הידוע כיום אשר אחראי על סינתזה של נוירו

.96עולה במהלך חלוקה תאית ובעקבות פגיעה או הפרעה למערכת העצבים כפי שיפורט בהמשך

במהלך הפרעות נוירופסיכיאטריות TSPOביטוי

TSPOליגנדות מסומנות רדיואקטיבית משמשות כסמנים דיאגנוסטיים לתהליכים נוירולוגים.

דגנרטיבים, במיוחד בדלקות ובפגיעה -מהווה סמן ביולוגי רגיש לפגיעה מוחית ולתהליכים נוירו

עולות באופן TSPO. במהלך פגיעה שכזו רמות הביטוי של 17בנוירונים במערכת העצבים המרכזית

ניכר, ברמה שמאפשרת זיהוי רגיש וממוקד של אזור הפגיעה ומאפשרת מעקב אחר התפתחות

in vivoמאפשרות מעקב חזותי וכמותי על ידי הדמיה TSPO-שור של ליגנדות מסומנות להדלקת. קי

SPECT (photon emission computed tomography.) -ו PETבשיטות טכנולוגיות כמו

גוברות באופן משמעותי TSPO: בתגובה לפגיעה, רמות הביטוי של פגיעה במערכת העצבים ההיקפית

חוזר TSPO. ביטוי 94,94,08רונים ובתאי שוואן של מערכת העצבים ההיקפיתבתאי המקרופאג', נוי

בעל תפקיד TSPO -לרמת מנוחה רק כאשר תהליך התחדשות העצבים מושלם, דבר המרמז על כך ש

.08מפתח בתהליכי שיקום עצביים

לפגיעה גליה ואסטרוציטים בתגובה-גובר בתאי מיקרו TSPO: נמצא כי ביטוי יתר של פגיעה מוחית

נהפך לכלי חשוב בגילוי פגיעות מוחיות בנוסף לתופעות TSPOור גם אחת הסיבות שניט מוחית. זו

ישמשו TSPOפיזיולוגיות האופייניות לפגיעה שכזו. מחקרים ניסיוניים מציעים שליגנדות של -פתו

וגם אחריהתפתחות הפגיעה אחרי, כך ניתן לעקוב 09כסמנים להתקדמות פגיעה טראומטית במוח

.00ניסיונות השיקום של תאי המוח מפגיעה זו

מופתה לאחרונה במוח האדם הן בתנאים TSPO: התפוצה התאית של מחלות נוירודגנרטיביות

inבניסויים TSPO-. נצפתה עליה משמעותית בקישור ליגנדות ל05פתולוגיםתקינים והן תחת תנאים

vivo סובלים ממחלות של ניוון עצבי המאופיינות בהרס במהלך פגיעה עצבית ודלקתית בחולים ה

08, אנטינגטון08-06נוירונים במערכת העצבים המרכזית. מחלות אלה כוללת את האלצהיימר

. 04,04ופרקינסון

מבוטא ביתר במספר סוגים של סרטן, כולל סרטן המוח. מכאן, כי ניתן להשתמש TSPO: גידול מוחי

. עדיין לא ידוע האם ביטוי יתר של 58,59ישמש כסמן ביולוגי לאבחנות קליניות TSPO -בו לניטור, כך ש

TSPO ית של תאים סרטניים הוא זה שגורם לסרטן או שהוא תוצאה במהלך הפעילות המיטוכונדר

של הסרטן.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

10

סטרואידים כמווסתים תופעות של דיכאון ומתח, -: למרות החשיבות של נוירוהפרעות פסיכיאטריות

. מתוך מעט המחקרים 50-58במהלך הפרעות פסיכיאטריות TSPOעטים בדקו את ביטוי מחקרים מ

ת בעת גילויי חרדות, טראומות, מתח, פאניקה, ובמוח יורד TSPOשנעשו נמצא כן רמות הביטוי של

דיכאון וסכיזופרניה.

(Rupprecht et al., 2010) במערכת העצבים TSPO: שינויים בביטוי 0טבלה

Table 1: Changes in TSPO expression patterns in the nervous system

TSPOרמות ביטוי הפרעות נוירולוגיות

-בתאי מיקרו TSPOעלייה משמעותית ברמות ביטוי אלצהיימר

גליה שבאזור הקורטיקל שבמוח

בסטריאטום TSPOעלייה משמעותית ברמות ביטוי אנטינגון

קורטיקלי במוח-שבחלק התת

-במעברי ה TSPOעלייה משמעותית ברמות ביטוי פרקינסון

nigrostriatalים של דופאמין, מעברים נוירוני

באזור הפגיעה TSPOעלייה משמעותית ברמות ביטוי פגיעה מוחית

גידול סרטני במוח עצמו

הפרעות פסיכיאטריות

בטסיות דם TSPOירידה משמעותית ברמות ביטוי פוביה חברתית

בלימפוציטים TSPOירידה משמעותית ברמות ביטוי חרדה

בטסיות דם TSPOירידה משמעותית ברמות ביטוי סכיזופרניה

נטייה להתאבדות בקרב בני נוער

דיכאון

TSPOליגנדות קושרות

-מולר בדומיין שבקצה ה-באפיניות של ננו TSPO -נקשר ל כולסטרול: TSPOליגנדות אנדוגניות של

C ידועים כמולקולות הממתנות פעילות אנזימתית של פרופרינים. 65-67טרמינלי המכוון לציטופלזמה

, DBI ,diazepam binding inhibitor. 68םם מרכיב בכמה חלבונים מיטוכונדרימספר אנזימים ומהווי

חומצות אמינו אשר יכול לעורר ולהמריץ סינתזת 46-, המורכב מ10KDaפפטיד שמסתו -הינו פולי

. אינטראקציה זו מקדמת את הטרנסלוקציה של TSPOסטרואידים על ידי אינטראקציה עם

.08,09,64,88הכולסטרול ובכך מאתחלת את סינתזת הסטרואידים במיטוכונדריה

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

11

פפטידים -מהווים משפחה של נוירוכוללות, אנדוזיפינים, ה TSPOליגנדות אנדוגניות נוספות של

יתר CRAC,65,72בדומיין TSPOטרמינלי של C-. בעוד כולסטרול נקשר לקצה ה71המצויים במוח

אנדוזיפינים מיוצרים על ידי TSPO.65,73,74טרמינלי של N-הליגנדות האנדוגניות נקשרות לקצה ה

. בתגובה לפציעה, מיוצרים באופן מקומי אנדוזיפינים בכמות תאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית

.TSPOמוגברת במקביל לעלייה בביטוי

קיימת היכולת להקשר לליגנדות סינטטיות, יכולת TSPO-: נמצא שלTSPOליגנדות סינטטיות של

IQs (isoquinolineזו זוהתה ואופיינה באפיניות גבוהה עבור שתי קבוצות של תרכובות, נגזרות של

carboxamide כדוגמת )PK-11195 ([(2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methyl-propyl)-3-

isoquinoline carboxamideו ]- BZs (benzodiazepines כדוגמת )RO5-4864 (4’-

chlorodiazepam.)75 BZs משתמשים בהם לצרכים קליניים כמו , הם בין התרופות הנרשמות ביותר

.4,50,51,52,65,76היפנוטיהרפיית שרירים, מדכאי בחילות, הפחתת חרדות וכסם הרגעה

, מכיוון שזוהי הליגנדה בה נשתמש בהמשך המחקר לבחינת הפעילות של PK-11195 -נתמקד באנו

TSPO .PK-11195 נקשר באופן בלעדי ל-TSPO דרך הקצה ה-C .טרמינלי

.8מאות לליגנדות ניתן לראות באיור דוג

TSPO-ים של מבחר ליגנדות הנקשרות לימבנים מולקולאר :1איור

Fig 7: Various ligands of TSPO

עקרונות הגיבוש

לרוב יש להם גיאומטריה גניים ובעלי סידור פנימי מחזורי, גבישים הינם מוצקים תלת ממדים הומו

בעלת פאות ופינות מוגדרות ושקיפות מסוימת. המניע להתגבשות הוא השאיפה למינימום אנרגיה

. תמיסה בה המולקולות מומסות לחלוטין היא תמיסה בעלת אנרגיה חופשית 50חופשית של המערכת

. אם מולקולות נוספות לתמיסה, המערכת עוברת שינויים מינימאלית המצויה במצב של שיווי משקל

ון עד לנקודה בה אין מספיק ממס בכדי לייצב את המולקולות. תחת תנאים אלה המכונים "מצב רווי

דינמי ליצירת -(, המערכת איננה עוד בשיווי משקל. כך, נוצר מניע תרמוsupersaturated state" )יתר

ות את חופשית מינימאלית. מולקולות אינדיבידואליות מאבד מצב שיווי משקל חדש בעל אנרגיה

ציה שלהם על ידי יצירת קשרים בין מולקולאריים יציבים חדשים דרגות חופש הרוטציה והטרנסל

RO5-4864 פרופרין PK11195 כולסטרול

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

12

)לא קוולנטים(, ובכך האנרגיה החופשית של המערכת יורדת. תהליך הגיבוש ידוע כתהליך בו האנרגיה

3-6ת החופשית של חלבונים יורדת בסביבו

. 36ביחס למצב המומס של החלבונים בתמיסה

הפאזה המוצקה יכולה להופיע במצב של משקע אמורפי או במצב של גרעיני גיבוש. משקעים אמורפים

בדרך כלל מועדפים יותר מבחינה קינטית, ולכן הם המצב הדומיננטי יותר בפאזה המוצקה ובכך

מעכבים את יצירת הגבישים.

האסטרטגיה הבסיסית בכדי להביא את המערכת למצב בו נוצרים גרעיני גיבוש ולא משקע אמורפי

בראגנטיהיא להגיע אל גבול הרוויה של התמיסה על ידי שינוי תכונות הממס באמצעות שימוש

טמפרטורה. למשל על ידי שינוי , או באמצעות שינוי התכונות הפיזיקאליות של הממס כמושיקוע

נפוצים עבור כל המערכות: התגרענות, גדילה והפסקה של הגדילה. התגבשותשלבים של שלושה

כאשר נוצרים גרעיני הגיבוש, עליהם להגיע לגודל מינימאלי המכונה, גודל קריטי, המוגדר על ידי

. כאשר מגיעים לגודל הקריטי, הגרעינים מסוגלים 37היחס בין פני השטח של גרעין הגיבוש לנפחו

לגדול על ידי יצירת קשרים בין מולקולאריים עם מולקולות חלבון נוספות המומסות להמשיך

סקופים ממצב התחלתי של גרעיני גיבוש מושפע מאוד מאפקטי -בתמיסה. גדילה של גבישים מאקרו

דיפוזיה והסעה. אזורים המצויים בסמיכות לגביש הגדל, בעלי ריכוז נמוך של חלבון ביחס ליתר

רת אזורים אלה יוצרת גרדיאנט צפיפויות בתמיסה אשר מכתיב את קצב הדיפוזיה של . יצי38התמיסה

סקופי. הסבר קלאסי -החלבונים המומסים אל עבר גרעין הגיבוש וכך מתחילה יצירת הגביש המאקרו

-סקופים ניתן על ידי תרשים המסיסות הדו-ליצירת גרעיני גיבוש וצמיחתם לכדי גבישים מאקרו

האזור הלא רווי -. עקומת המסיסות מחלקת את אזורי המסיסות לשני חלקים8ור ממדי המוצג באי

והאזור הרווי. כל נקודה על העקומה מייצגת את הריכוז בו התמיסה מצויה בשיווי משקל עם ראגנטי

השיקוע. כל הנקודות על עקומת המסיסות מייצגות מצב בו הגביש סיים לגדול מתמיסה רוויה או

ומס בתמיסה לא רוויה. באזור שמתחת לעקומת המסיסות, התמיסה לא רוויה ולא מצב בו הגביש ה

ייווצרו בתחום זה גבישים כלל. מעל עקומת המסיסות נמצא האזור הרווי, כאן בהתאם לריכוז

, ריכוז החלבון יהיה גבוה מאשר במצב שיווי המשקל.ועקישראגנטי ה

ל וברמת הרוויה של התמיסה, אזור זה מחולק כתלות בקינטיקה להגעה בחזרה למצב של שיווי משק

:בעצמו לשלושה חלקים

אזור השיקוע בו החלבון מופרד מיידית מהתמיסה ונוצר משקע אמורפי. .9

-אזור ההתגרענות בו עודף החלבון יוצר גבישים. בקרבת אזור השיקוע, נוצרים מיקרו .0

גבישים.

אלא רק כאשר התמיסה תעבור סטבילי: בתמיסה רוויה לא יגדלו גבישים, -האזור המטא .5

גבישים מסודרים, התנאים -זעזוע מכאני או אם יהיו בה גרעיני גיבוש. בכדי שיגדלו מאקרו

האופטימאליים יהיו עם יצירת גרעיני גיבוש בודדים באזור ההתגרענות, טיפה מעל לאזור

וצרו סטבילי ולא ייו-סטבילי. ברגע שגבישים גדלים, התמיסה תחזור לאזור המטא-המטא

יותר גרעיני גיבוש. גרעיני הגיבוש שנוצרו יתחילו לגדול בקצב הולך וקטן, עובדה המסייעת

במניעת היווצרות פגמים בגביש, עד חזרה לשיווי משקל.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

13

גיבוש חלבונים

. כיוון שחלבונים ידת ההומוגניות של תמיסת החלבוןיבוש חלבונים הוא מהגורם החשוב ביותר בג

מוצאים מסביבתם הטבעית ונשמרים בריכוז שהוא גבוה בהרבה מהסביבה הפיזיולוגית שלהם, תהיה

להם נטייה לשקוע באופן בלתי הפיך. היבט הכרחי נוסף הינו רמת ניקיון דוגמת החלבון. כל זיהום,

עלולה לעכב את יצירת הגביש או להוביל לזיהום של הסריג הגבישי. כפי שצוין גם עם כמות קטנה,

סטבילי. ראגנטי שיקוע הם חומרים בהם -קודם לכן, מולקולות מתגבשות מתמיסה רוויה במצב מטא

מולקולות בכדי לעודד התגבשות של חלבונים. -משתמשים לרוב להשגת תמיסה רוויה של מאקרו

היא בעיקר על הממס, מים, ולא על המומס, החלבון. ראגנטי שיקוע ההשפעה של ראגנטים אלה

נפוצים מתחלקים לכמה קטגוריות עיקריות: מלחים, פולימרים בעלי מסה מולקולארית גבוהה

וממסים אורגניים.

: מלחים מגדילים את החוזק היוני של תמיסה מימית ובכך מקטינים את האקטיביות של מלחים

מסיסות חלקיקים טעונים. לחלופין, ניתן לומר שבהעדר נים בתמיסה וכך משיגים הגברה של היו

לכוחות המשיכה החשמליים בין מטענים מנוגדים הודות יתריונים ממלחים, החלבון ישקע בקלות

שעל גבי החלבונים. יונים ממלחים, ימסכו את המשיכה בין הקבוצות המנוגדות שעל גבי החלבונים

גדילו את מסיסות החלבונים. כאשר נפח הממס קטן, החוזק היוני של התמיסה גדל עד לנקודה ובכך י

בה מתרחשת תחרות רבה בין יוני המלח לבין החלבון על מולקולות הממס )המים( בכדי לייצב את

הצגה סכמטית של -: דיאגרמת גיבוש8איור

דיאגרמת פאזות דו ממדית המדגימה את

השינוי בריכוז מולקולות החלבון כפונקציה

יכוז החומרים המשקעים. אזורי הריכוז של ר

מחולקים על ידי עקומת המסיסות לשני

אזורים עיקריים: האזור הלא רווי והאזור

הרווי. האזור הרווי מורכב משלושה תת

סטאבילי, אזור -האזור המטא -אזורים

.Ducruix, A)ההתגרענות ואזור השיקוע

and Giege, R, 1992.)

Fig 8: Crystallization phase diagram. Schematic representation of a two-dimensional phase

diagram, illustrating the change of protein molecules concentration against precipitating agent

concentration. The concentration space is divided by the solubility curve into two areas

corresponding to under saturated and supersaturated state of a protein solution. The supersaturated

area comprises of the meta stable, nucleation and precipitation zones (Ducruix, A. and Giege, R,

1992).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

14

עצמם מבחינה אלקטרוסטאטית. במקרה כזה של העדר כמות מספקת של מולקולות ממס, החלבונים

ר אינטראקציות אחד עם השני.יאלצו ליצו

(, נמצא כראגנט המשקע היעיל ביותר מבין הפולימרים polyethylene glycol) PEG: פולימרים

קיימת במגוון רחב של משקלים PEGs -. משפחת ה54הליניאריים בעלי מסה מולקולארית גבוהה

מתחרים עם החלבונים PEGsדלתון. בדומה למלחים, 9,888,888 -ל 088מולקולאריים, הטווח נע בין

מורידים את הקבוע הדיאלקטרי של PEGsהמומסים על מולקולות המים. אולם, בניגוד למלחים,

את המרחק האפקטיבי בו מתרחש האפקט האלקטרוסטאטי בין מקטיןדבר אשר התמיסה,

החלבונים.

: ממסים אורגניים קושרים מולקולות מים ובכך מונעים מהם ליצור אינטראקציות ממסים אורגניים

עם החלבונים. כמו כן, ממסים אורגניים מפחיתים את הקבוע הדיאלקטרי של התמיסה, ובכך

מגבירים את כוחות המשיכה בין החלבונים. אפקטים אלה מפחיתים את היכולת של המערכת להמיס

בכך גורמים לחלבונים לצאת מפאזת התמיסה. באופן מלא את החלבונים ו

:בנוסף לראגנטי השיקוע, פקטורים נוספים וחשובים לא פחות המשפיעים על גיבוש חלבונים הם

pH לכל חלבון טווח , התמיסהpH .ייחודי לו בו החלבון מסוגל להתגבש

ת נמוכות שונות משפיעות על מסיסות חלבונים בתמיסה. בטמפרטורו , טמפרטורותטמפרטורה

מסיסות חלבונים בתמיסות עם מלח עולה בעוד שבתמיסות עם פולימרים, מסיסות החלבונים יורדת

עם הירידה בטמפרטורה.

על יכולת יםשפיעמהחלבון המומס, שונה של כמו גם ריכוז ראגנטי שיקוע שונים בריכוזים שונים

הגיבוש, אלא אומנות של ניסוי החלבון להתגבש כהלכה. כיום אין אסטרטגיה אחת מוכחת להצלחת

וטעייה.

טכניקת גיבוש

, קיימות שלוש שיטות . ביניהן40,41מספר טכניקות פותחו בכדי להביא את תמיסת החלבון למצב רוויה

. למרות שניתן להשיג רוויה בכל אחת dialysis -ו micro-batch, vapour-diffusionנפוצות יותר:

מהשיטות הללו, קיימת השפעה של עקרון השיטה על מהלך הגיבוש. בחלק זה של ההקדמה נתאר את

.TSPOהשיטה בה בחרנו להשתמש לגיבוש

: טכניקה זו מנצלת את תופעת האידוי (vapour-diffusion techniqueטכניקת "דיפוזיה באידוי" )

בין תמיסות בריכוזים שונים כגישה להשגת רוויה של חלבונים. בדרך כלל, תמיסת והדיפוזיה של מים

עם תמיסה המכילה את ראגנטי השיקוע בריכוז הדרוש להשגה לאחר 9:9חלבון מעורבבת ביחס

שתהליך האידוי מתרחש. טיפת התערובת מורחפת ונאטמת כ"טיפה יושבת" מעל תמיסה המכילה את

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

15

מטרה )רזרוואר(. ההבדל בריכוז הראגנטים המשקעים בין הטיפה ותמיסת ראגנטי השיקוע בריכוז ה

הרזרוואר הוא הכוח המניע אשר גורם למים להתאדות מהטיפה עד שריכוז ראגנטי השיקוע בטיפה

משתווה לריכוז ראגנטי השיקוע ברזרוואר. כיוון שנפח הרזרוואר גדול בהרבה מהנפח בטיפה

תעבים בה מהטיפה היושבת זניח. במהלך ההתאדות בדיפוזיה, היושבת, מיהולה על ידי המים המ

( עד שריכוז החלבון מגיע Cip, ריכוז A, נקודה 9ריכוז החלבון מתחיל לעלות ממצב לא רווי )באיור

(. כאשר הגבישים הראשונים מתחילים להיווצר, ריכוז החלבון B, נקודה 9למצב של רוויה )באיור

יש מתחיל לגדול עד שריכוז החלבון המומס בטיפה מגיע לערך המומס בטיפה מתחיל לרדת. הגב

(. טכניקת "אידוי בדיפוזיה" הינה שיטה Cfp, ריכוז Cהמתאים על גבי עקומת המסיסות )נקודה

אופטימאלית בסריקת מספר רב של תנאים. זאת ועוד, שיטה זו מאפשרת העלה או הורדה של ריכוז

החלבון המצוי במצב של שיווי משקל ביחס לריכוזו ההתחלתי באמצעות קביעת יחס בין החלבון

לממס )מים + ראגנטי השיקוע( בטיפה היושבת.

המתארת את הקורלציה בין חלבון גיבושאגרמת י: ד2איור

בשיטת "דיפוזיה לחומרים משקעים בעת התגבשות החלבון

של החומרים םיהם הריכוזים ההתחלתי Cip, Ci. באידוי"

הם הריכוזים הסופיים Cfp, Cfשל החלבון בהתאמה. ו המשקעים

(Chirgadze 2001.)

: שיטת "דיפוזיה 01איור

באידוי" לגיבוש חלבונים

Chirgadze)בטיפה יושבת

2001.)

Fig 10: Crystallization set up in terms of phase diagrams. Schematic

representation of solubility phase diagram and correlation between

protein and crystallizing agent concentration by the vapour-diffusion

technique. Cip and Ci are the initial concentrations of protein and

crystallizing agent respectively, Cfp and Cf are their final

concentrations (Chirgadze 2001).

Fig 10: Protein

crystallization techniques.

Schematic representation

of vapour-diffusion sitting

drop techniques

(Chirgadze 2001).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

16

X-rayעקרונות קריסטלוגרפית

מולקולות. בניסויי קריסטלוגרפיה -נקבעו עד היום רוב המבנים של מאקרו X-rayבאמצעות קרינת

בעקבות כך, . X-rayמולקולות מוקרנים עם שטף של גלי -, גבישים של מאקרוX-rayבאמצעות

הקרינה מפוזרת על ידי המולקולות והמידע המתקבל מפיזור הקרינה מעובד לתיאור המבנה התלת

ממדי של המולקולה. בכדי שגביש ייתן דיפרקציה )פיזור קרינה(, אסור שאורך הגל של האור יהיה

ת מבנה רחב יותר מהדוגמה המוקרנת. ניתן להיעזר במיקרוסקופים המשתמשים באור הנראה לקביע

של דוגמאות בסדר גודל של כמה מיקרונים, אך לא ניתן להיעזר בהם לקבלת הדמיה ברמה אטומית

מאפשרים X-ray -של מולקולות חלבון למשל. קרינה אלקטרומגנטית של אורכי גל קצרים בתחום ה

-X -ני המולקולה בודדה חלש מידי לזיהוי, כי רוב קר -של מאקרו X-rayהדמיה שכזו. פיזור קרינת

ray .יעברו דרך מולקולה בודדה מבלי להתפזר. אנליזת דיפרקציה מגבישים מתמודדת עם בעיה זו

גביש של חלבון מכיל מולקולות מסודרות רבות באופן סימטרי באוריינטציה היוצרת סריג תלת ממדי,

וכך דיפרקציה של כל המולקולות יחדיו מתגברת לכדי יכולת זיהוי.

ו האטומים או המולקולות ארוזים באופן מחזורי ליצירת מבנה תלת ממדי. היחידה גביש הוא חומר ב

הבסיסית של גביש החוזרת על עצמה בסריג התלת ממדי באוריינטציות שונות מכונה תא יחידה.

( ושלוש זוויות a, b, cהממדים של תא היחידה מוגדרים על ידי שישה פרמטרים: שלושה צירי אורך )

סימטריות היא הרכיב -סימטריות. היחידה הא-כל תא יחידה מורכב מיחידות א(. α, β, γבין הצירים )

הקטן ביותר של הגביש, אשר באמצעות אופרציה של סימטריה, ניתן לגלות את התוכן של תא היחידה

סימטרית ניתן לקבוע את המבנה הכללי. הגבישים מחולקים לשבע -השלם. בזכות היחידה הא

ל הסימטריה של תא היחידה. השילוב של סימטרית תא היחידה ומספר תאי מערכות המבוססות ע

". בסך הכל Bravais latticesסוגי סריגים אפשריים המכונים " 98היחידה שהסריג מכיל, יוצרים

-סוגים שונים של יחסי סימטריה אפשריים בין היחידות הא 60מולקולות ביולוגיות קיימים -במאקרו

". באופן מתומצת, איסוף מידע מבני space groupיחסים אלה מכונים " סימטריות בתא היחידה,

כרומטית ומדידת -מונו X-rayטיפוסי מגבישים מתבצע על ידי מיקום גביש החלבון אל מול קרן

ההחזרות של קרני הדיפרציה.

". במתקן synchrotron radiation" -בהם נשתמש הוא ה X-rayאחד המקורות הנפוצים של קרינת

זה אלקטרונים מואצים במהירות רבה מאוד במסלול מעגלי. מסלול זה מכיל מספר שווה של אזורים

. אודות להאצה של החלקיקים הטעונים, קרינה אלקטרומגנטית נפלטת בזווית ומעוגלים ישרים

. היתרון העיקרי שלbeamlineהמשיקה למסלול המעגלי. הקרינה הנפלטת מכוונת למה שמכונה

נפלטת X-ray -היא עוצמתו הגבוהה במיוחד. זאת ועוד, קרינת ה X-rayמתקן זה עבור דיפרקצית

בטווח ספקטרום רחב של גלים. המתקן בו השתמשנו במחקרנו היה במאיץ החלקיקים האירופי

(. אנרגיה גבוהה של פוטונים European Synchrotron Radiation Facility) ESRFבגרנובל שבצרפת,

גורמת ליצירה של רדיקאלים חופשיים בגביש וכתוצאה מכך גורמת X-ray -י אורך גל בתחום הבעל

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

17

להרס הסדר הגבישי. נזק קרינתי זה גורם לירידה ברזולוציה של הדיפרקציה ובזמן החיים של הגביש.

בכדי להתגבר על בעיה זו, הגבישים מוקפאים תחת זרם של חנקן נוזלי ומוחזקים בטמפרטורה של

-137oC.

מכוונת על אטומים בגביש, השדה החשמלי של הקרינה יגרום X-ray: כאשר קרינת חוק בראג

לאלקטרונים באטומים אלה לבצע תנועת אוסילציה באותה תדירות. כתוצאה מכך הם יפלטו קרינה

מפוזרת. הקרינה המפוזרת של כל האטומים האינדיבידואלים בגביש תוביל להתאבכות בונה רק

פר מצומצם מאוד של כיוונים. בראג הראה שהזוויות בהן הקרינה מוחזרת מהגביש ניתנות במס

לחישוב אם נתייחס לדיפרקציה כאילו הייתה מוחזרת מסדרת מישורים של אטומים מקבילים

. כדי לתאר באופן חד משמעי סריג תלת "אינדקס מילר"בגביש. סדרת המישורים מוגדרת על ידי

נקודת הראשית, ואז לבחור לסריג בסיס. הבסיס כולל שלוש נקודות במרחב, ממדי, יש לקבוע את

והחצים המוליכים מן הראשית לנקודות אלה הם וקטורי בסיס. מישורים אלה קיימים כתוצאה מכך

שתאי היחידה מסודרים במערך קבוע בגביש החלבון. בראג הראה שדיפרקציה מתרחשת רק כאשר

בסדרת המישורים המקבילים שווה לזווית החזרה של הקרינה X-rayזווית הפגיעה של קרינת

המוחזרת.

: גביש הינו מערך תלת ממדי של מולקולות. בכדי למדוד את כל ההחזרות איסוף מידע דיפרקציוני

האפשריות, אנו חייבים לאסוף את תבניות הדיפרקציה מכל האוריינטציות הייחודיות של הגביש

. מסיבה זו, במהלך איסוף הנתונים, גביש החלבון חייב להיות מסובב X-rayבעקבות הקרנתו בקרינת

1 -בזוויות קטנות )כo סביב ציר ניצב לקרן. השינויים בזווית בה הקרן פוגעת בגביש, מאפשרים לכל )

הסוגים השונים של המישורים בסריג לעבור דיפרקציה על פי חוק בראג. כתלות בתכונות הייחודיות

סימטריה של הגביש והאוריינטציה שלו תחת הקרן, הגביש מסתובב במהלך ההקרנה לתא היחידה, ה

45בין o-180

o הסריג התלת ממדי של הגביש יוצר סריג תלת ממדי של נקודות דיפרקציה המכונים .

reciprocal lattice נתונים אלה מהווים חומר מוצא לקביעת המבנה של החלבון בגביש. תוכנות .

יות מיוחדות מסוגלות להמיר את הנתונים הניסיוניים למידע מבני של תא מחשב ביואינפורמט

יה אטומית של מבנה החלבון.להעניק לנו הדמהיחידה ובסופו של דבר

האתגר בהפקה וגיבוש חלבונים ממברנלים

. אולם, בעוד שמספר הרצפים הגנומים 80מהחלבונים שהאדם מייצר הינם חלבונים ממברנלים 58%

המקודדים לחלבונים ממברנלים הידועים גדל עם השנים, יש באופן יחסי מעט מאוד מידע אודות

המבנה התלת ממדי ואופן הפעילות של חלבונים אלה בתוך הממברנות. ייתכנו מספר סיבות לחוסר

ל חלבונים ממברנלים הוא היכולת במידע מבני אודות חלבונים אלה. הקושי העיקרי במחקר מבני ש

להפיק כמות גדולה ונקייה של חלבון. חלבונים ממברנלים בדרך כלל מבוטאים ברמה נמוכה

בממברנות ביולוגיות, וזה נדיר שחלבון בודד מהווה מרכיב דומיננטי בממברנה ולכן לא ניתן להשתמש

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

18

ת שלהם מאוד קטנה ורמת הניקיון בחלבונים נטיבים ממברנות ביולוגיות לצרכי מחקר מכיוון שהכמו

מאוד נמוכה. אחד הפתרונות לאתגר זה הוא בביטוי יתר של חלבון משובט. הבעיה העיקרית בביטוי

, היא האגרגציה של החלבון E. coliיתר של חלבון ממברנלי משובט בחיידק מארח כדוגמת

, חלבונים אנימליים דורשים . זאת ועוד43בציטופלזמה, וכתוצאה מכך נדיר לקבל חלבון פעיל ויציב

שינויי מודיפיקציה לאחר התרגום, שינויים שלא מתרחשים במערכת החיידקית. קושי נוסף, חלבונים

ממברנלים באופן טבעי ממוקמים בשכבה כפולה של ליפידים. סביבה ליפידית זו הינה סביבה

פיזיקאליות לקביעת מבנה -ומורכבת, הטרוגנית ודינמית. עובדה זו מגבילה את השימוש בטכניקות בי

וניתוח יחסי מבנה ופעילות של החלבון. לא ניתן לחקור מבנה של חלבון המצוי X-ray -החלבון ב

. בכדי לבודד את החלבון, בעל אחוז הידרופוביות גבוה, עלינו X-rayבתוך ממברנה נטיבית באמצעות

כל לעבור מהסביבה הממברנלית בכדי שהחלבון יו in vitroליצור סביבה מימית המכילה דטרגנט

ולהתמוסס בתמיסה המימית מבלי לאבד את מבנהו הפונקציונאלי. בידוד וניקוי חלבונים ממברנלים

מהסביבה הנטיבית שלהם הוכח כתהליך שאינו טריביאלי כלל וכלל.

ם גם במידה וההפקה, הבידוד והניקוי של חלבון ממברנלי בכמות גדולה הצליח, לא הסתיימו האתגרי

בדרך לפענוח מבנה החלבון. ייצור גביש של חלבון ממברנלי בעל איכות דיפרקציונית גבוהה מהווה

אתגר בפני עצמו, הסיבה לכך נעוצה בעובדה שפני השטח של החלבון הממברנלי ברובו הידרופובי ולכן

מאשר מבנה גבישי. משקעיםמהרגיל ליצור ההוא בעל נטייה גבוה

דטרגנטים

ראגנטים בהם נשתמש בניסויים ביוכימיים עם חלבונים ממברנלים. התנהגותם דטרגנטים הם

. השימוש הנפוץ ביותר בדטרגנטים הוא בייצוב חלבונים ממברנלים מבחינה תבתמיסה דיי מורכב

פונקציונאלית ומבנית בהעדר ממברנה. בכדי לנקות ולבודד את החלבון לצורכי גיבוש עלינו כאמור

מברנלית וזאת נוכל לעשות באמצעות דטרגנטים. התסכול הנפוץ ביותר במהלך להוציאו מהסביבה המ

חלבונים מתוך היציבות יה של החלבונים. ניתן להעריך את חשיבות הניסוי הוא דנטורציה ואגרגרצ

העובדה שרוב החלבונים הממברנלים משמרים את הפונקציונאליות שלהם כאשר הם ממוקמים

ונים ממברנלים עלולים לאבד את פעילותם ולשקוע באופן בלתי הפיך בממברנה הנטיבית שלהם. חלב

בתמיסה מימית. ברור אם כך, שדטרגנט המסוגל לחקות בקירוב את התכונות הפיזיקאליות של

הממברנה המקורית יתאים טוב יותר בשימור המבנה של חלבון ממברנלי במהלך הוצאתו מהסביבה

סיביים לא מסוגלים לחקות בצורה יעילה ממברנות ולכן לא הליפידית הנטיבית שלו. דטרגנטים אגר

מסוגלים לשמר את הפעילות של החלבון. מכאן, כי אחת הסוגיות החשובות היא למצוא תנאים בהם

הסביבה הפיזיקאלית של החלבון מופרעת כמה שפחות למרות ההמסה של הממברנה למיצוי החלבון

אלית לייצוב בדרך כלל מתנגשת עם הדרישה מתוכה. הדרישות לדטרגנט בעל יכולת מקסימ

שהדטרגנט חייב להיות בעל תכונות פיזיקאליות כמה שיותר דומות לסביבה הממברנלית.

: דטרגנטים שונים מליפידים ביולוגים בכך שהם מתארגנים לכדי ליות של דטרגנטיםאתכונות פיזיק

יני לשכבות של ליפידים. בצורה מיצלות קטנות ומוגדרות היטב במקום יצירת מבנה מורכב האופי

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

19

ועד למאות מולקולות. מספר המולקולות 5-8הטהורה שלהם, מיצלות של דטרגנטים מכילות בין

במיצלה, המכונה גם מספר אגרגציה, מהווה תכונה של הדטרגנט. תכונה אופיינית נוספת של דטרגנט

CMC (critical micelleהיא הריכוז המינימאלי הדרוש ליצירת מיצלות, תכונה זו מכונה

concentration בגלל אופיים האמפיפטי, למונומרים של דטרגנט מסיסות מוגבלת במים ולכן הם .)

-. באופן כללי, דטרגנט חייב להיות בריכוז הגבוה מהCMC -מתארגנים כמיצלות בריכוז הגבוה מה

CMC של הדטרגנטים, נובעים בכדי לשמש כמייצב חלבונים ממברנלים יעיל. התכונות הפיזיקאליות

מאופי "קבוצת הראש" ואופי שרשרת הפחמנים, ה"זנב" של הדטרגנט. לקבוצת הראש קיימת השפעה

חזקה על האינטראקציה של הדטרגנט עם החלבונים, בעוד שהזנב, המורכב משרשרת אלקילית,

גורמות SDS -ועל המספר האגרגציה של הדטרגנט. שרשרות קצרות כמו ב CMC -משפיע על ה

גורמות לדטרגנט maltosides -לדטרגנט להיות דנטורטיבי לחלבון, בעוד שרשרות ארוכות יותר כמו ב

להיות עדין יותר. אולם, לא כל הדטרגנטים יעילים באותו טווח של אורך שרשרת. דטרגנטים עם

מסיסים גבוהים, ודטרגנטים בעלי שרשרות ארוכות יותר פחות CMCשרשרות קצרות בעלי ערכי

בפאזה מימית.

: מיצוי והמסה של חלבונים ממברנלים על ידי דטרגנטים מיצוי והמסת חלבונים מתוך ממברנה

(, זהו ריכוז critical solubilization concentration) CSCעקרון מפתח המכונה על מתבססים

גם בריכוז תלוי מאוד CSC -הדטרגנט המינימאלי הדרוש לשיבוש מערכת ממברנלית והמסתה. ה

הליפידים בממברנה, ריכוז זה יכתיב את קצב וטיב שיבושה. בכדי לוודא כי כל הממברנה הומסה על

וכן לווסת את הטמפרטורה בהתאם, לדוגמה, CSC -ידי הדטרגנט, עלינו לוודא כי ריכוזו יהיה מעל ה

CSC תר בתהליך המיצוי של דטרגנטים יורד כאשר הטמפרטורה עולה, אך החלבונים יהיו יציבים יו

4וההמסה בטמפרטורה של oCבדרך כלל, אנו נדרשים שריכוז הדטרגנט יהיה גם גבוה יותר מערך ה .-

CMC שלו, במיוחד עבור דטרגנטים בעלי זנב ארוך, וזאת בכדי שהם ייצבו כמיצלות את החלבונים

.88הממברנלים

יכולים להתקיים רק כחלק מקומפלקס : חלבונים ממברנלים מומסים דטרגנט-קומפלקס של חלבון

. גיבוש חלבון ממברנלי הוא תהליך קשה 45(PDC( )protein-detergent complexדטרגנט )-של חלבון

בדרך כלל לא מעדיפות יצירה PDC -חייב להתארגן לכדי גביש, אך תכונות ה PDC -בעיקר בגלל שה

החלבון. אתוהדינאמי של חגורת הדטרגנט המקיפה הגמיששל סריג מסודר היטב, בגלל האופי

בהשוואה למסה של PDC -הנוכחות של דטרגנט מכפילה בקלות את המסה המולקולארית של ה

46 -החלבון ולעיתים קרובות תכונות הדטרגנט גוברות על תכונות החלבון בPDC.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

20

ל למסך לגמרי את האזורים : במקרים מסוימים הדטגרנט לא מסוגדנטורציה ואגרגציה של חלבונים

ההידרופוביים של החלבון, כתוצאה מכך, אזורים אלה עלולים ליצור אינטראקציות אחד עם השני

ים שלהם מהסביבה המימית. תופעה זו גורמת לאגרגציה יכדי לבודד את פני השטח ההידרופוב

של החלבון הנבדק. ושיקוע, לרוב בלתי הפיך, של החלבון וכך בעצם נהרס המבנה הנטיבי והפעיל

עשויים להיות מספר סיבות לאובדן המבנה של חלבונים ממברנלים בעקבות המסה עם דטרגנט.

אפשרות אחת היא ההמסה של הממברנה בה מצוי החלבון, כנראה הממברנה חשובה לשימור המבנה

הגורם החלבוני הנטיבי ובכך אנו פוגעים בו. אפשרות נוספת היא ריכוז גבוה מידי של דטרגנט

לדנטורציה של החלבון. מכאן ניתן להבין שעלינו לבחון מספר משתנים כאשר העיקריים שבהם,

יצירת תמיסה בעלת יחס ריכוז דטרגנט לריכוז ליפידים בממברנות שיאפשר המסה מלאה של

ב את סה היעילה של הממברנות עליו לייצהממברנות ובחירת סוג מתאים של דטרגנט אשר בנוסף להמ

נים הממברנלים מבלי לגרום להם לדנטורציה. החלבו

המדויק תלוי CSC -: המסה של ממברנות על ידי דטרגנט. ממברנות מכילות ליפידים וחלבונים. ערך ה00איור

חלבון המטרה עלול ורה, הבופר וכו'... יש לשים לב שבאופי הדטרגנט, אופי וריכוז הליפידים, ריכוז החלבון, הטמפרט

.(Gilbert G. Prive 2007דנטורציה בריכוז דטרגנט גבוה )לעבור

Fig 11: Solubilization of membranes by detergents. Membranes contain lipid and protein. The exact

critical solubilization concentration depends on the nature of the detergent, the nature and

concentration of the lipid, the protein concentration, the temperature, the buffer, etc. Note that the

target membrane protein may be prone to denaturation at very high detergent concentrations (Gilbert

G. Prive 2007).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

21

בדיקת פעילות

ל לקשור ננצל את העובדה שחלבון זה במצב הפעיל שלו מסוג TSPO -כדי לבדוק את פעילות חלבון ה

כאשר היא . נוכל למדוד את מידת הקישור של הליגנדהPK11195טית באופן ספציפי ליגנדה סינת

]מסומנת רדיואקטיבית עם איזוטופ טריטיום של מימן, 3H]PK11195, לחלבון באמצעות מכשיר

LSC (liquid scintillation counterו ) נטיבי להסיק על מידת פעילות החלבון ביחס לקישור חלבון

לליגנדה שכזו.

מועברת בין חלקיקים יכולה להיות שאנרגיה ההנחה על מבוסס LSC -מכשיר העקרון הפעולה של

מבלי לגרום ליוניזציה. חלקיקי בטא הנפלטים ממולקולות מסומנות רדיואקטיביות מסוגלים לאבד

ובכך LSC -על ידי האנרגיה באמצעות עירור חלקיקים אחרים המצויים בסביבתם. תכונה זו מנוצלת

מאפשרת לנו למדוד כמה חלקיקים רדיואקטיביים קיימים בתמיסה.

הנפלטים : תהליך המדידה מסתמך על העברה של אנרגיה קינטית מחלקיקי בטא עקרון פעולה

ים. המעבר דרך סדרת מעברים אנרגת מחומרים רדיואקטיביים בתמיסה למרכיבים אחרים בתמיסה

אנרגיה קינטית מחלקיקי בטא למולקולות הממס, מעבר זה מביא את מולקולות הראשון הוא העברת

הממס למצב מעורר. מולקולות הממס המעוררות משחררות את האנרגיה מהר מאוד באורך גל

הקיימות פלואורופורהנפלטת גורמת לעירור מולקולות UV -(. קרינת הUVבתחום האולטרא סגול )

איור המתאר את התהליכים המתרחשים במהלך ההמסה של הממברנות )סגול( על ידי דטרגנט . a: 02איור

.Martin Caffrey 2003)וייצובו במיצלות ). b(, מיצוי החלבון הממברנלי )אפור( כתום)

Fig 12: Cartoon representation of the events taking place during solubilization. (a) Isolated

biological membrane in the presence of detergent micelle solution. (b) Solubilized membrane

proteins exist as mixed micelles in solution (Martin Caffrey 2003).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

22

-300לתחום הנראה ) UV -ישחררו אנרגיה בתחום שבין ה פלואורופורבממס. מכאן, מולקולות

450nm( תפקיד המפתח של הממס המכונה נוזל סנטילציה .)liquid scintillation) הוא ליצור תמיסה

לשם מעבר ופיזור יעיל של האנרגיה הנפלטת פלואורופורלמולקולות הדוגמה הומוגנית בין מולקולות

. דוגמת המדידה ותמיסת הסנטילציה )מכונה גם פלואורופורהמולקולות מאותם חלקיקי בטא אל

המכיל את התערובת ממוקם בין הבקבוקון. 20mlבעל נפח של בבקבוקוןקוקטייל( מעורבבים יחד

מקרינת 988%(. סידור שכזה מאפשר קליטה של כמעט photomultiplier) PMפוטונים, -שני מכפילי

עוררת פולטות את הקרינה המ פלואורופור. מולקולות הPM -של ה התמיסה הנפלטת על פני השטח

כיוון שיותר ממולקולה אחת מעוררת עבור כל חלקיק בטא שעבר דעיכה, באופן שווה לכל הכיוונים.

באותו זמן, אזי קיימת וודאות מסוימת שהבזק מהבקבוקוןיקלטו הבזק אור PM -אם שני גלאי ה

חלקיקי בטא. עוצמת האור הנקלטת בגלאי פרופורציונאלית האור מקורו מאירוע הדעיכה של

, כפונקציה של ריכוז LSC -לאנרגיה ההתחלתית של חלקיקי בטא. הפלט המתקבל ממכשיר ה

ספרי המייצג את , זהו ערך מCPM ,counts per minuteבתמיסה הוא ליגנדות הרדיואקטיביות ה

זמנית לדקה. אות זה מתורגם בסופו של דבר נקלטו על ידי שני הגלאים בו מספר הבזקי האור ש

( בדוגמה אשר נקשרו לליגנדות הרדיואקטיביות.TSPOלריכוז הרצפטורים )

מידת קישור ליגנדה לרצפטור עשויה לספק לנו מידע על מספר אתרי קישור, והאפיניות אנליזה ל

אקטיבית מבוססת -יווהזמינות שלהם לליגנדה. האנליזה שלנו למדידת קישור ליגנדות מסומנות רד

". המודל מבוסס על מספר רעיונות פשוטים:The law of mass actionעל מודל פשוט המכונה "

רצפטור היא תגובה -התגובה הכימית בין ליגנדה לרצפטור ליצירת קומפלקס ליגנדה

המקיימת שיווי משקל דינמי.

נכונה ובאנרגיה באוריינטציהורצפטור מתנגשים אסוציאציה מתרחשת כאשר ליגנדה

מתאימה.

כאשר מתרחש קישור, הליגנדה והרצפטור נותרים קשורים יחדיו לאורך זמן מסוים התלוי

באפיניות של הרצפטור והליגנדה זה לזה.

.לאחר דיסוציאציה, הליגנדה והרצפטור יוותרו בדיוק כפי שהיו לפני הקישור

ב היווצרות הקומפלקס ליגנדהשיווי משקל דינמי בין הליגנדה לרצפטור מושג כאשר קצ-

רצפטור שווה לקצב דיסוציאצית הקומפלקס.

Kd מוגדר מתמטית כמנה בין קבוע קצב הדיסוציאציה לקבוע קצב האסטוציאציה של

הקשורה למחצית ממספר הוא בעצם הריכוז של ליגנדה nM .Kdהקומפלקס ביחידות

נמוך Kdשור של הרצפטור. הוא מהווה מדד לאפיניות הליגנדה לאתר הקיהרצפטורים ו

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

23

גבוה משמעותו Kd-משמעותו שלרצפטור יש אפיניות גבוהה לליגנדה באתר הקישור ו

שלרצפטור יש אפיניות נמוכה לליגנדה באתר הפעיל.

Bmax כמספר הרצפטורים המקסימלים הפעילים בדוגמה. מוגדר

ריכוז הרצפטורים הקשורים לליגנדות מסומנות , מדדנו את TSPOבכדי למדוד את מידת הקישור של

ביחידות של

בתחילה מדדנו ריכוז הליגנדות המסומנות החופשיות בתמיסה.כתלות

קישור ליגנדות מסומנות לאתר הפעיל ברצפטור )קישור ספציפי( וגם לאתרים אחרים ] קישור כללי

ר מכן, מדדנו רק את הקישור הלא ספציפי, תמיסת הדוגמה . לאח[בדוגמה )קישור לא ספציפי(

כתוצאה מכך, התרחשה החלפה של הליגנדות , PK11195הרוותה בליגנדות חופשיות לא מסומנות,

המסומנות הקשורות לאתר הפעיל בליגנדות לא מסומנות, כאשר יתר הליגנדות המסומנות נותרו

מה. באופן כזה אנו מקבלים שני סוגי קריאות. קשורות באופן לא ספציפי לאתרים האחרים בדוג

קריאה אחת, מדידה של קישור כללי )קישור לאתר הפעיל + קישור לאתרים אחרים(, קריאה שנייה,

מדידה של קישור לא ספציפי )קישור לאתרים האחרים בלבד(. החסרה של שתי הקריאות תיתן לנו

מבחינה תרמודינמית החלפת . 83-85 (TSPO -מדד לקישור הספציפי )קישור לאתר הפעיל בלבד ב

ליגנדות באתרים לא ספציפיים מועדפת על פני החלפת ליגנדות באתר הקישור, אך מבחינה קינטית

החלפה ספציפית מועדפת על פני החלפה לא ספציפית ולכן אנליזה זו תקפה.

לרצפטור. בתחילה נמדד הקישור : סכמה המתארת את השלבים השונים במדידת קישור ליגנדות01איור

.)האיור אינו מתאר קנה מידה( הכולל ולאחריו הקישור הלא ספציפי

Fig 01: Scheme describing the various steps in measuring receptor-ligand interactions. During

the first step the total binding is measured followed by a measurement of the non-specific

binding (The figure does not describe true scale).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

24

לרצפטור : דיאגרמת קישור ליגנדות מסומנות04איור

-Totalכפונקציה של ריכוז הליגנדות החופשיות בתמיסה.

של הקישור הספציפי לאתר הקישור קריאה -כלליקישור

יחד עם הקישור הלא ספציפי לאתרים אחרים בתמיסה.

NSB- קישור לא ספציפי, קישור זה הינו בקירוב ליניארי

NSBהחסרה של ערכי בליעת -Specificבין המשתנים.

יתנו לנו את הקישור הספיציפי אשר Total קריאתמערכי

קיימים בתמיסה מגיע לרוויה כאשר כל הרצפטורים ה

Bmaxקשורים. מתוך הרוויה ניתן למצוא את ערך

(Steven J 1996).

, הציר הניצב מתאר יחס Scatchard plotדיאגרמת : 05איור

בין מספר הרצפטורים אליהם קשור הליגנד לריכוז הליגנד

החופשי בתמיסה,

. הציר המאוזן מתאר של ריכוז

. מתקבל עקום Bound הרצפטורים אליהם קשור הליגנד,

ליניארי שמתוך משוואת השיפוע ניתן למצוא את קבוע הפירוק

X -ונקודת החיתוך עם ציר ה האופייני של הרצפטור לליגנד.

.Bmax (Steven J 1996)מייצגת את

[Radioligand]

Fig 04: Saturation isotherm for the binding of increasing concentrations ligand to

receptor. The amount of radioactivity bound to the receptors, measured in CPM by

beta counting, has been converted to fmol of ligand per mg of protein present in the

incubation mixture.Non-specific binding (NSB) was subtracted from the total to

give the amount of specific binding. An approximate value of the Bmax can be

estimated from the ordinate and Kd from the abscissa (Steven J 1996).

Fig 05: Scatchard transformation of the data from fig 24. The slope the line is equal to the

negative reciprocal of the Kd and the intercept of the line with the abscissa is an estimate of

Bmax (Steven J 1996).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

25

X-rayבשיטת קריסטלוגרפית TSPO-המוטיבציה לחקור את מבנה ה

היא רחוקה מאוד מלהיות מלאה. TSPO -ההבנה שיש בידנו כיום לגבי המבנה והפעילות של חלבון ה

מבנה החלבון הידוע כיום הוא פרופיל מודל כללי מאוד אשר אינו מאפשר הבנה מבנית משמעותית

מבנה TSPO-לגבי הפעילות של חלבון זה ומכאן על חשיבותו הרבה לקיום התאים. עדיין אין ל

כקולטן עדיין מוגבלים. אנו TSPOאטומית ולכן הידע לגבי התהליכים הפיזיולוגים של נח ברמה מפוע

לליגנדות האנדוגניות והסינטטיות אך איננו מבינים לגמרי TSPOמשערים מהם אתרי הקישור של

קולות מחוץ הממברנה את אופן הקישור, את תהליך השפעול של החלבון ואת אופן העברת מול

חיונית TSPO-ית אל תוך המיטוכונדריה. כאמור, הבנת מנגנון הקישור של הליגנדות לדרהמיטוכונ

עד מאוד לצורך עיצוב תרופות חדשות כנגד אותם תופעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות שפורטו לעיל.

לנו מבט מעמיק יותר אל תוך המבנה האטומי של לספקאמורה X-ray -שיטת הקריסטלוגרפיה ב

החלבון הנובעת מהמבנה האטומי ו להציע מנגנון מדויק יותר לגבי פעילות שיאפשר לנ החלבון מה

שלו.

מטרות המחקר

TSPO הינו חלק ממערך חלבוני הממוקם בעיקר בממברנה החיצונית של המיטוכנדריה ביצורים

היתר ביולוגים בגוף, בין אאוקריוטים. מחקרים הראו כי חלבון זה מעורב במספר רב של תהליכים

הינו TSPOשל סטרואידים, במהלך תגובה אימונולוגית, חלוקה תאית ואפופטוזיס. בנוסף, בסינתזה

-דגנרטיביות והפרעות פסיכיאטריות. כיוון ש-שחקן מרכזי במספר מחלות כמו סרטן, מחלות נוירו

TSPO מעורב בתהליכים מגוונים, ניתן יהיה להשתמש בו לצרכי ניטור ומעקב אחר תהליכים

ריות ובגידולים סרטניים. , בהפרעות פסיכיאטהמרכזיתפיזיולוגים במערכת העצבים -פיזיולוגים ופתו

הוא חלבון TSPOההבנה לגבי חשיבות חלבון זה לאורגניזם רק הולכת ומתחזקת בעקבות העובדה כי

י גורמת לאפקט קטלנ TSPOשמור היטב לאורך האבולוציה וכיוון שנמצא כי עיכוב הפעילות של

חיונית עבור התאים. פענוח מבנה ברזולוציה TSPOפעילות תאים בו הוא קיים, ניתן לשער כי ב

החלבון וכיצד פן פעילותי אוהאטומית לגבתאפשר לנו הבנה טובה יותר ברמה TSPOגבוהה של גביש

הוא מעורב במחלות השונות.

בה דיפרקציה אינפורמטיבית. אך באיכות ירודה אשר אינה מני TSPOכיום יש בידינו גבישים של

:מכאן, כי מטרות המחקר שלנו היו

משובט מבלי לגרום לחלבון לעבור דנטורציה. TSPOתהליכי הביטוי והניקוי של את לשפר .9

כדי לנסות ולקבוע את המבנה התלת המשובט TSPO -תהליכי הגיבוש של חלבון ה את לשפר .0

.X-rayממדי שלו באמצעות קריסטלוגרפית

את מידת פעילותו. לבחוןכדי עם החלבון המשובט in vitroע ניסויים לבצ .5

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

26

עבודה חומרים ושיטות

חומרים כלליים

יצרן החומר

Acetic acid (CH3COOH) FRUTAROM

Acetone FRUTAROM

Acrylamide\bis-Acrylamide 40% SIGMA

Ammonium persulfate (APS) SIGMA

Ampicillin sodium crystalline SIGMA

Bacto-trypton Becton, Dickinson and Co.

Bacto yeast extract DIFCO Laboratories

Bio-Beads SM2 Bio-Rad Laboratories

Cadmium chloride (CdCl2) Spectrum chemical MFG. Corp

D,1-Dithiothreitol (DTT) SIGMA

Hydrochloric acid 37% (HCl) Carlo Erba Reagents

Imidazole FLUKA

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranonside

(IPTG)

SIGMA, ORNAT

Methanol FRUTAROM

Molecular weight markers for SDS-

PAGE

SIGMA, Bio-RAD Laboratories

[3H] PK11195 New England Nuclear

Polyethylene glycol (PEG) Hampton research Corp.

Sodium chloride (NaCl) FRUTAROM

Sodium hydroxide (NaOH) FRUTROM

Sucrose SIGMA

N,N,N’ ,N’-tetra-methylethyenediamide

(TEMED)

SIGMA

2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid MES

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

27

חומרים לביטוי ביתר של חלבון משובט ממברנלי

LB ( ליטר 0עבור ): 10gr Bacto-Tryptone, 5gr Bacto-Yeast extract,10gr NaCl

Antibiotic: Ampicillin sodium crystalline

IPTG: i-Propyl-β-D-Thiogalactopyranoside

חומרים להפרדת ממברנות מתאי חיידקים

TSC Buffer: 50mM Tris HCl pH 7.5, 140mM choline chloride, 0.25M sucrose

Additives: 2.5mM MgCl2, 1

DNase, 0.5mM DTT

חומרים לבידוד וניקוי חלבון משובט ממברנות

Lysis Buffer: 50mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl, 10mM Imidazole

Extraction Buffer: 50mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl, 10mM Imidazole, 4% DDM

Wash Buffer (WB): 50mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl, 20mM Imidazole, 0.1% DDM

Elution Buffer (E): 50mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl, 250mM Imidazole, 0.11% DDM

Nickel column Ni-NTA Agarose

SDS-PAGEחומרים עבור

Acrylamide: Acrylamide/Bis-Acrylamid 40% solution

Resolving Buffer (RB) x 8: 3M Tris pH 8.8

Stacking Buffer (S) x 4: 0.5M Tris pH 6.8

Running Buffer (RB) x 5: 125mM Tris, 960mM Glycine

Sample Buffer (SB) x 5: 6% Lauryl sulphate lithium salt, 0.15M DTT, 0.5M

Tris pH 6.8, 30% glycerol, 0.01% bromphenol blue

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

28

Staining Solution (SS): 0.25% Coomassie brilliant blue, 50% methanol,

7% acetic acid

Distaining Solution (DS): 10% Methanol, 10% Acetic acid

Resolving gel (ג'ל תחתון): 14% Acrylamide/Bis-Acrylamide, 1% APS,

0.l% TEMED, 3M Tris pH 8.8

Stacking gel (ג'ל עליון): 6% Acrylamide/Bis-Acrylamide, 2% APS,

0.2% TEMED, 0.5M Tris pH 6.8

TSPO -ון ההתמיסות בהן התגבש חלב

21% PEG400, 0.1M AcNa pH 4.6, 0.1M CdCl2

21% PEG400, 0.1M AcNa pH 7.6, 0.1M CdCl2

30% PEG400, 0.1M NaCl, 0.1M MES pH 6.5, 0.1M Li2SO4

30% PEG400, 0.1M NaCl, 0.1M MES pH 9.5, 0.1M Li2SO4

ליפוזומים-חומרים עבור יצירת פרוטאו

Egg phosphatidylchline (egg PC), 100

in chloroform.

DDM 0.1%

200mM HEPES pH 7.5

2M NaCl

SM-2 BioBeads, 20-50 mesh

Methanol

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

29

שיטות עבודה

TSPO -ביטוי יתר של חלבון ה

pET20שובט על ידי דוקטור ענת שחר לתוך וקטור שיבוט מסוג Rattus norvegicus -מ TSPOהגן

-(. כך בעצם אנחנו מסוגלים לבטא את חלבון הHis tagהמכיל בתוכו רצף של שישה היסטידינים )

TSPO היסטידינים בקצה העם שישה- C .תאי טרמינלי לצורך ניקוי החלבון בעזרת קולנת ניקל

E.coli C41וט , המכילים את וקטור השיבpET20 עם הגן המקודד ל- TSPO גודלו במשך הלילה ,

37בטמפרטורה של oC 10 -בml של תמיסתLB 0.1אמפצילין את האנטיביוטיקה המכילה

.

LB +0.1מדיום 500mlלמחרת, תמיסה זו אוחדה עם

אמפצילין ותרבית התאים גודלה עד

ותמיסת החיידקים עברה אינקובציה IPTGשל 1nMלאחר מכן, הוספנו . OD600= 0.6 לבליעה של

37שעות בטמפרטורה של 8למשך oC בתום האינדוקציה תאי החיידקים שוקעו בצנטריפוגה .

(5000rpm, 20min, 4oC)4- טמפרטורה של . משקע התאים הוקפא ב

oC.

E. coli -הפרדת ממברנות מתאי ה

מתוך ממברנות התאים ועל תהליך ניקוי ובידוד TSPO -כדי להקל על תהליך הוצאת חלבון ה

תהליך ההפרדה החל בהרחפת מיתר תכולת התאים. E.coli -החלבון, הפרדנו את ממברנות תאי ה

דקות בצנטריפוגה 98תרחיף התאים סורכז למשך . TSCבופר 10ml -התאים המוקפאים ב

(5000rpm, 4oCרו שתי פאזות, משקע ונוזל עליון. הנוזל העליון נשפה והמשקע הורחף מחדש (. נוצ

לריכוז 2.5mM ,DNaseלריכוז של MgCl2ממשקלו. לתרחיף זה הוספו 0בנפח הגדול פי TSCבבופר

1של

French pressure. התאים עברו פעמיים שבירה בלחץ על ידי 0.5mMלריכוז של DTT -ו

cell press (20,000psi, 4oC התאים שלא נשברו הורחקו על ידי סירכוז נוסף באותם תנאים .)

. נוזל עליון זה E.coli -המצוינים לעיל. כעת הנוזל העליון מכיל את הממברנות שהופרדו מתאי ה

למשך שעה Ti-70צנטריפוגה -, שיקוע הממברנות נעשה באולטראTi-70הועבר למבחנות

(35,000rpm, 4oCשיקוע הראשוני של הממברנות, בצענו שטיפה נוספת על ידי הרחפה ב(. לאחר ה-

20ml בופרTSC צנטריפוגה למשך שעה באותם תנאים המצוינים לעיל. -וסירכוז נוסף באולטרא

בתום השיקוע השני, הפרדנו את הנוזל העליון ממשקע הממברנות הצהבהב שנוצר, משקע זה הורחף

4-בטמפרטורה של 100µlשל והוקפא במנות TSCבופר 300µl -בoC.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

30

מתוך הממברנות TSPO -בידוד וניקוי של חלבון ה

Frenchועברו בפעם השלישית שבירה בלחץ על ידי lysisהממברנות הקפואות הורחפו בבופר

pressure cell press באותו אופן כפי שנעשה לעיל. לאחר מכן, לתרחיף הוספנוDDM 4% בכדי

. התרחיף עם הדטרגנט עבר אינקובציה TSPO-להמיס את הממברנות ולמצות מתוכן את חלבון ה

צנטריפוגה בכדי להפריד בין הממברנות -למשך הלילה. למחרת, התרחיף עבר סירכוז באולטרא

לחלבון המומס כך שהממברנות שוקעות והחלבון נותר מומס בבופר עם הדטרגנט. לאחר ההפרדה,

. לאחר שתי שטיפות עם בופר Ni-NTAנת קלאציה לניקל, ולבון הוטענה על גבי קולתמיסת הח

, המכיל גם EBשוחרר החלבון מהקולונה באמצעות בופר אלוציה, ,DM 0.1%, המכיל WBשטיפה,

בפרקציות האלוציה ובכדי לבחון את TSPO -. בכדי לוודא שאכן קיבלנו את חלבון ה DM 0.1%כן

. הפרקציות הנקיות SDS-PAGEה ורמת ניקיונה, הפרקציות הוטענו של גביי כמות החלבון שהופק

נת הניקל על ידי ידזול שמקורו בשטיפות החלבון בקולאוחדו, נוקו מאימ TSPO -שהכילו את חלבון ה

3-20דיאליזה ולבסוף החלבון רוכז לריכוז של

.100kDaצנטריקון של באמצעות

TSPOגיבוש

באמצעות מטריצת (vapor-diffusion) הגיבוש בוצעו תוך שימוש בשיטת "דיפוזיה באידוי"ניסיונות

חומרים משקעים 7µlחלבון, 7µl(. טיפות הגיבוש הכילו תערובת של sitting drop"טיפה יושבת" )

.1ml היה( reservoirרזרוואר )נפח הסופי של הודטרגנטים כאשר ה

Sodium dodecyl sulfat polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)88

הפרדת חלבונים בוצעה על ידי אלקטרופורזה. עקרון שיטה זו מבוסס על העובדה שקצב תנועת

תחת שדה חשמלי מתרחש בהתאם למסה המולקולארית של SDSחלבונים בג'ל דנטורטיבי המכיל

בו ,(resolving gel ; 14% acrylamideן )מורכב משני סוגי ג'לים, ג'ל תחתו SDS-PAGEהחלבון.

לתוכו נטעין את דוגמאות ,(stacking gel ; 6% acrylamide) נריץ את החלבונים, וג'ל עליון

למשך חצי החלבונים. הטענו את התערובת להכנת הג'ל התחתון במעמד מתאים וכיסינו אותו במים

העליון. כל דוגמה תערובת להכנת הג'לשעה עד תום הפולימריזציה. לאחר מכן, המים הוחלפו ב

בטרם ההטענה, כל דוגמה עברה .5µl SBתמיסת חלבון ובופר 10µlי הג'ל הכילה שהוטענה על גב

80דקות בטמפרטורה של 5אינקובציה למשך oC בכדי לבצע דנטורציה לחלבונים. לאחר

האינקובציה, כל דוגמה הוטענה על גבי הג'ל העליון במקום המיועד לה. מתקן ההרצה מולא בבופר

RB 25. הרצת החלבונים בג'ל בוצעה בטמפרטורת החדר תחת מתח קבוע שלmA עבור כל ג'ל. עם

98 למשך( תוך כדי ערבול עדין staining solutionתום האלקטרופורזה, הג'ל הוכנס לתמיסת צביעה )

דקות. לאחר מכן הוחלפה התמיסה, בתמיסה שמטרתה להוריד את הצבע מן הג'ל הצבוע למעט הצבע

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

31

חצי שעה עד שרקע הג'ל למשך( תוך כדי ערבול עדין distain solutionשנקשר לחלבונים שהופרדו )

היה נקי מצבע.

TSPO -קביעת ריכוז חלבון ה

-שלד הפוליפפטידי של החלבון בתחום ההריכוז החלבון נקבע באמצעות מדידת הבליעה אופטית של

UV במכשיר ה- nano drop מסוגND-1000 דוגמת הבלנק שלנו הייתה בופר .lysis עםDM 0.1% .

1µl 280.דוגמת חלבון הוטענה והוקרנה באורך גל שלnm המתקבל הינו ביחידות שלהריכוז

.

86ליפוזומים-לתוך ליפוזומים ליצירת פרוטאו TSPOהרכבה מחדש של

3.5mg ,מביצי תרנגולת( ליפידיםPhosphatidylcholine הומסו בשלמות עם )2ml שלDDM 1%

2.5החדר. בטמפרטורת RBבבופר

עורבבו בעדינות עם תמיסת הלפידים ליצירת TSPOשל

אשר נשטפו היטב, התמיסה SM-2בידים מסוג 200mgדטרגנט. לאחר הוספת -ליפיד -תמיסת חלבון

" בטמפרטורת end-over-end rotatorשעות תוך כדי ערבול עדין על גביי " 5עברה אינקובציה למשך

והתמיסה עברה SM-2של בידים מסוג 400mgשעות, הוספה מנה נוספת של 5החדר. כעבור אותם

4אינקובציה נוספת והפעם למשך הלילה בטמפרטורה של oC י אותו מערבל. בשלב זה נוצרו על גב

ליפוזומים הופרד בזהירות מהבידים. -ליפוזומים. התרחיף שמכיל את אותם פרוטאו-הפרוטאו

(, במהירות של .Beckman Coulter Inc) TL-100צנטריפוגה מסוג -התרחיף עבר סירכוז באולטרא

355,000rpm ליפוזומים. התרחיף הופרד -דקות. המשקע שנוצר מכיל את הפרוטאו 80למשך

. לאחר 50mM Tris pH 8.0 100mM NaCl -ליפוזומים הורחפו מחדש ב-מהמשקע והפרוטאו

RBבופר ליפוזומים הורחף בנפח קטן של -צנטריפוגה, המשקע של הפרוטאו-סירכוז נוסף באולטרא

4ואוחסן בטמפרטורה של oC.

] -ל TSPOבדיקות קישור 3H]PK11195

84,84-49,48-40,

]מידת הקישור של ליגנדות בכדי לקבוע את 3H]PK11195 ל- TSPO חלבון עברה אינקובציה , דוגמת

פעם אחת .(0.2-6nMעם הליגנדות המסומנות באיזוטופ טריטיום רדיואקטיבי )ריכוז סופי של

total)קישור כולל, PK11195בהעדר ליגנדות לא מסומנות רדיואקטיבית, האינקובציה הייתה

binding 10( ופעם שנייה יחד עם הליגנדות הלא מסומנות רדיואקטיבית בריכוז שלµM קישור לא(

קישור ספציפי הושג באמצעות החסרה של הקישור הלא ספיציפי .(non specific bindingספציפי,

] -, חושבו מתוך עקומת הרוויה של קישור החלבון לKd -ו, Bmax. הכוללשור מהקי3H]PK11195

4ה של , בטמפרטור50mM Tris pH 7.4. הניסוי בוצע בבופר של Scatchard באנליזתתוך שימוש oC

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

32

ליגנדות מסומנות 25µlחלבון, 400µl. תערובת התגובה הכילה 500µlכאשר הנפח הסופי הוא

ליגנדות לא מסומנות רדיואקטיבית עבור הניסוי של הקישור הכולל או מים 75µl -רדיואקטיבית ו

. לאחר אינקובציה של שעה, הדוגמה עברה פילטרציה ספציפימזוקקים עבור הניסוי של הקישור הלא

-הספוג בפולי Whatman GF/C glass fiber filtersמהירה בעזרת מערכת וואקום ודרך מסנן מסוג

ולאחר מכן 50mM Tris buffer pH 7.4של 3mlהדוגמה נשטפה שלוש פעמים עם אימין-אתילן

(. הקריאות הרדיואקטיביות של scintillation liquidשל נוזל סנטילציה ) 4mlהוכנסה לוייל המכיל

שעות. 90כעבור liquid scintillation analyzer -הליגנדות המסומנות נקראו על ידי מכשיר ה

אחסון ושינוע גבישים

(, למדידת דיפרקציה במאיץ sitting dropsשגדלו במטריצת "טיפות יושבות" ), שינוע הגבישים

( בגרנובל שבצרפת, European Synchrotron Radiation Facility, ESRF) החלקיקים האירופאי

הונחו בצידנית מרופדת להגנה עלנעשה בשני אופנים, דרך אחת, הגבישים נותרו במטריצה, אך

דרך שנייה הייתה בהקפאת הגבישים על גבי לופים בחנקן נוזלי. רגע לפני ההקפאה, הגבישים.

.cryoprotectantהגבישים עברו אינקובציה של מספר שניות בתמיסת

MUSCLE -תוכנה ביואינפורמטית

המשובט בו השתמשנו אינו חלבון ממקור אנושי אלא ממקור של חולדה, היינו TSPO-כיוון שחלבון ה

צריכים לברר את ההומולוגיה בין שני החלבונים, לשם כך נעזרו בתוכנה ביואינפורמטית המכונה

MUSCLE (multiple sequence comparison by log-expectation) אשר משווה ובודקת התאמות ,

.(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle) של שני החלבונים בין רצף חומצות האמינו

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

33

תוצאות ודיון

R. norvegicus -מ TSPOשיבוט הגן המקודד לחלבון

בכדי להעמיד חלבון לגיבוש יש צורך בכמות גדולה של חלבון. הדרך הנפוצה והמקובלת ביותר כיום

להפיק כמויות גדולות של חלבון ללא צורך בהקרבה של מאות חיות מעבדה היא לשבט גן המקודד

מערכת חיידקית בכמות מוגברת. במעבדתנו באמצעותלחלבון המבוקש בווקטור ביטוי אשר יבוטא

מערכת זו מאופיינת היטב .E. coliכת הביטוי של חלבונים משובטים היא מערכת חיידקית מסוג מער

כמו כן, מערכת זו קלה לגידול ובכמויות גדולות. מחקרים קל לעשות בה מניפולציות גנטיות, ולכן

אבולוציוניים מצביעים על כך שממברנת מיטוכונדריה של יצורים אנימלים דומה מאוד באופייה

יבוטא TSPOמכאן כי קיימת האפשרות שחלבון . E. coliלממברנה של חיידקים אירובים כדוגמת

חשוב אשר עשוי לייצב את המבנה של החלבון ולשמר בסביבה הקרובה לסביבה הנטיבית שלו, גורם

-השלב הראשון אותו בצענו בתהליך הארוך עד גיבוש החלבון היה שיבוט הגן המקודד ל את תפקודו.

TSPO שיבוט זה בוצע על ידי דוקטור ענת שחר. גן הביטוי לחלבון .TSPO הושג מתוך ווקטורpPBR

על ידי פרופסור משה גביש סופקכליה של חולדה אשר מתאי RNAשל RT-PCR -)מקור הגן הוא מ

עם כמות מתאימה polymerase chain reaction (PCR) -מהפקולטה לרפואה בטכניון(. השתמשנו ב

. גן זה שובט במספר סוגים של TSPO -את הגן המקודד ל נוקלאוטידים בכדי להגביר-של אוליגו

טרנספורמציה, -באמצעות אלקטרו .pQE60, pET28b, pET28bHMT, pET20bווקטורי ביטוי:

E. coliלתוך מספר סוגים של חיידקי TSPO -החדרנו את הפלסמיד המכיל את הגן המקודד ל

. בכל המקרים, הוסף לגן המשובט, M15, BL21, C41(DE3), C43(DE3)המשמשים כמארחים:

חומצות כששקבוצה , TSPO -טרמינלי של חלבון ה C -רצף נוקליאוטידים אשר יבוטא בקצה ה

אמינו מסוג היסטידין למטרות ניקיון החלבון על גבי קולונת ניקל.

TSPO: סיכום השיבוטים של 2טבלה

Table 2: Summary of the TSPO clones

E. coliסוג ווקטור שיבוט הגן מספר השיבוט

1 TSPO pQE60 M15, BL21

2 TSPO-malE pET28bHMT C41, C43

3 TSPO pET28b C41, C43

4 TSPO pET20b C41, C43

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

34

TSPO-חלבון הביתר של ביטוי

לשם אופטימיזציה. TSPO -חלבון ה שונים עבורסריקת תנאי ביטוי הואצענו יהשלב השני אותו ב

השונים. כמו כן, סרקנו עבור כל E. coliהמשתנים אותם סרקנו היו ווקטורי השיבוט וסוגי חיידקי

ומכת heat shock -אחד מווקטורי השיבוט והחיידקים תנאים שונים של טמפרטורה )כולל מכת חום

ומשך זמן האינדוקציה. התנאי האופטימלי ביותר בו קיבלנו את IPTG, ריכוז (cold shock -קור

pET20bוקטור והמשובט ב TSPOעבור גן היההכמות הגדולה ביותר של חלבון מבוטא ביתר

37. טמפרטורת האינדוקציה הייתה C41מסוג E. coliבחיידקי oC

במהלך כאשר לאורך כל התהליך.

בריכוז IPTG הוספנו 600nmבאורך גל של 0.6של O.D -גדילת החיידקים בליעת התמיסה הגיעה ל

25nM שעות. 5. הפסקת האינדוקציה בוצעה לאחר

TSPO-הבידוד וניקוי חלבון

לרמת והבאתובוטא ביתר היה בידודו מתוך תאי החיידקים TSPO -השלב השלישי לאחר שחלבון ה

ובכדי E. coli -מתוך ממברנת ה TSPOניקיון מספיק גבוהה לשם גיבוש. בכדי להקל על מיצוי

להפריד את הממברנות מיתר תכולת החיידקים. צעד היה עלינולהגדיל את רמת הניקיון של החלבון

זה בוצע באמצעות הפרוצדורה להפרדת ממברנות המפורטת תחת קטגוריה של "חומרים ושיטות",

במהלך תהליך זה הממברנות ניתקו מהחיידקים ו"נקרעו" לפרקציות קטנות. לאחר שיקוע

, "נקרעו" בשנית על ידי הפעלת lysisהממברנות והפרדתם מיתר תכולת התאים, הן הורחפו בבופר

למשך הלילה דטרגנט" ולבסוף הורחפו עם French Pressבאמצעות " psi 20,000לחץ של

4בטמפרטורה של oCבכדי לאפשר לדטרגנט להמיס את הממברנות ולמצות מתוכן את ה ,- TSPO .

כחלבון ממברנלי. TSPOאחד האתגרים כאמור בתהליך הבידוד והניקוי הוא האופי ההידרופובי של

היה עלינו לבחור דטרגנטים מתאימים אשר יהיו E. coliבכדי למצות את החלבון מתוך ממברנת

למצות ממנה את החלבון ולייצב אותו באופן מיטבי המשמר את ,מסוגלים להמיס את הממברנה

כיום הזמינותות הרבות ת המסחרייולמרות הכמו המבנה ואת הפעילות שלו מבלי לגרום לדנטורציה.

של דטרגנטים, אין "דטרגנט אוניברסאלי" אידיאלי לכל היישומים הביוכימיים. לכן, בחירת

הדטרגנט היא אחת מההחלטות הבסיסיות שיש לעשות לצורך פיתוח פרוטוקול חדש עבור בידוד,

ניקוי וגיבוש חלבונים ממברנלים.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

35

וגים לפי המבנה שלהם והם מחולקים לשלוש קטגוריות : דטרגנטים מסודטרגנטים סריקת סוגי

יוניים. -עיקריות: דטרגנטים טעונים, דטרגנטים טעונים ודטרגנטים צוויטר

: דטרגנטים אלה מכילים קבוצת ראש טעונה חיובית או שלילית. כמו כן הם דטרגנטים טעונים

שלהם נקבע כתלות בשילוב שבין אפקט המטען CMC -מכילים שרשרת פחמנים הידרופובית. ערך ה

של קבוצות הראש והאינטראקציות ההידרופוביות של קבוצות הזנב. דטרגנטים אלה נחשבים

כדטרגנטים אשר ממסים בקלות ממברנות אך גורמים לדנטורצית חלבונים.

TSPO -עד כה להמיס את הממברנה החיידקית ולמצות ממנה את הדוקטור ענת שחר הצליחה

דטרגנט זה מורכב מ"זנב" בעל שניים עשר פחמנים בלבד. SDS (Sodium dodecyl sulfate)בעזרת

דטרגנט אגרסיבי הממיס ממברנות אך בד הינווסופלאט כקבוצת "ראש" טעונה שלילית. דטרגנט זה

היר כי היתרון בשימוש בדטרגנט זה הוא במיצוי קל ומ ,בבד גורם לדנטורציה של חלבונים. מכאן

אך החיסרון המובהק שלו הוא בהרס המבנה השלישוני של E. coli -ממברנות ה TSPOיחסית של

נטורציה מחדש על ידי שימוש בדטרגנט עדין יותר מאפשר -החלבון דבר המוביל לאובדן פעילותו. רה

לחלבון להתקפל מחדש אך אין הכרח שהחלבון ישוב למבנה הנטיבי שלו כפי שהיה בממברנה ומכאן

מקטגוריות אחרות ולכן החלטנו לסרוק דטרגנטים פוטנציאליים חדשים .כי גם הפעילות עלולה לאבד

:SDS -בעלי סבירות נמוכה יותר לדנטורציה בהשוואה ל

אוקסילן -: דטרגנטים אלה מורכבים מקבוצת ראש הידרופילית כדוגמת, פולידטרגנטים לא טעונים

(polyoxyethylene או ) קבוצה גליקוזידית. דטרגנטים אלה בדרך כלל נחשבים כדטרגנטים עדינים

ליפיד -אשר לא גורמים לדנטורציה של חלבונים. הם מסוגלים בריכוז מתאים לשבור קשרי ליפיד

חלבון מבלי לגרום לחלבון לשקוע. בכך, דטרגנטים מסוג זה -חלבון וליצור קשרי דטרגנט-וליפיד

: יכולת הדטרגנט לבצע דנטורציה 01איור

חלבונים ממברנלים מושפעת מגודל של

ומטען קבוצת הראש כמו גם אורך שרשרת

הפחמנים בקבוצת הזנב. משתנים אלה

וגם על גודל CMC -משפיעים גם על ה

.(Gilbert G. Prive 2007) המיצלות

Fig 16: The tendency of a detergent to

denature membrane proteins can be

qualitatively understood by considering

the size and charge of the polar

headgroup, as well as the length of the

alkyl tail. These parameters also

affect the CMC and the size of the

micelle (Gilbert G. Prive 2007).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

36

ת תוך שימור תכונותיהם המבניות אך ם להתמוסס בסביבה מימימאפשרים לחלבונים ממברנלי

ת התורפה של דטרגנטים אלו ויש לשים לב לנקודסרון הוא בקושי להמיס לחלוטין ממברנות. יהח

( עלולים לגרום לדנטורציה של C7-C10הבאה לידי ביטוי בכך שדטרגנטים בעלי שרשרות קצרות )

ככל שהשרשרת ארוכה יותר כך יכולת (. מצד שני,C12-C14שרשרות ארוכות יותר )להחלבון בניגוד

ייצוב הדטרגנט נמוכה יותר.

דטרגנטים שונים בריכוזים שונים מקטגוריה זו לצורך המסת בחרנו לנסות להשתמש בשלושה

: הדטרגנטים שנבחנו היו מתוכן. TSPO-הממברנות ובידוד ה

OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside:) שימושי מאוד אך מכיוון שהוא מכיל שמונה דטרגנט זה

פחמנים בקבוצת הזנב הוא נחשב כאגרסיבי יחסית מבין הדטרגנטים הלא טעונים.

Triton X-100 , דטרגנט זה גם כן מסוגל לשבש מערכת ממברנלית ולהמיס חלבונים ממברנלים מבלי

לגרום להם לדנטורציה.

DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside :) דטרגנט זה הוא אחד מהדטרגנטים העדינים ביותר

והוא ידוע כאחד שמסוגל לשמר פעילות של חלבונים ממברנלים, כלומר הוא ממיס חלבונים

מסוגל ליצור מיצלות DDMממברנלים מבלי לגרום להם לדנטורטציה בטווח מסוים של ריכוזים.

בונים ממוסכים זה מזה באופן יעיל יחסית גדול בו כל החל PDCיחסית גדולות, וכך נוצר מבנה

שאינו גורם לאגרגרציה.

ם ולא טעונים.שילוב של תכונות של דטרגנטים טעוני :(zwitterionicיונים )-דטרגנטים צוויטר

LDAO (lauryl dimethylamine oxide ,)ניסינו לבחון גם יכולות ההמסה של מתוך קטגוריה זו

גודל המיצלות שהוא יוצר יחסית קטנות, הוא נחשב יעיל בהמסה פחמנים, 90דטרגנט זה, בעל זנב של

לעבור 80% -של ממברנות אך הוא יחסית אגרסיבי כלפי חלבונים ממברנלים ועלול לגרום ל

דנטורציה.

Fig 17: Molecular structure of detergents : מבנה מולקולארי של דטרגנטים01איור

SDS

LDAO

n= 10

Triton X-100

DDM

OG

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

37

TSPO -תכונות הדטרגנטים בהם השתמשנו בכדי להמיס ממברנות ולייצב את הסיכום : 1טבלה

Table 3: Summary of the detergents we used to dissolve membranes and stabilize the TSPO

של Mw סוג דטרגנט

מונומר

CMC

nM

מספר

אגרגציה

מסה ממוצעת

של מיצלה

kDa

SDS 94 60 6-4 044 טעון שלילית

LDAO 98 86 9-0 004 יוני-צוויטר

OG 4 08 05-08 040 לא טעון

Triton X-100 48 988 8.08 688 לא טעון

DDM 08 44 8.90 099 לא טעון

להוציא את החלבון מתוך הממברנות באמצעות כל אחד מהדטרגנטים הללו נעשו מספר ניסיונות

כל כמו גם שילובים שונים של דטרגנטים בו זמנית. 4%עד 1%בטווח שבין בריכוזים עולים

, עימו הצלחנו לקבל כמות 4%בריכוז של DDMהניסיונות לא הניבו תוצאות משביעות רצון למעט

בתמיסה DDMהצלחנו למצות את החלבון מתוך הממברנה, ריכוז לאחר שגדולה יחסית של חלבון.

מומס בתמיסה מבלי לגרום לו TSPO -שזהו הריכוז המינימאלי המסוגל להותיר את ה 0.1% -הורד ל

הריכוז ההתחלתי בו ניסינו לסרוק תנאי גיבוש שונים עבור זה היווה גם את DDMלשקוע. ריכוז

ת הצלחנו לגבש פרוטוקול אשר על פיו ניתן לקבל כמות גדולה לאחר מספר רב של ניסיונו החלבון.

ונקייה יחסית של חלבון.

TSPO: תהליך בידוד 4טבלה

Table 4: The TSPO purification procedure

אופי הטיפול שלב

E. coli (Membrane Extraction) -הפרדת ממברנות מתוך חיידקי ה 0

" French Press" באמצעותממברנות" קריעת" 2

DDM 4%המכיל דטרגנט lysisבופר אינקובציה למשך הלילה של הממברנות עם 1

צנטריפוגה-אולטראהפרדת החלבון המומס מיתר המשקעים שבתמיסה באמצעות 4

DM 0.1%ניקל תוך שימוש בדטרגנט קולונתקלאציה ל כרומטוגרפיתבשיטת TSPOניקוי 5

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

38

צנטריפוגה בכדי לשקע את -סורכזה התמיסה של החלבון והממברנות באולטראעם תום האינקובציה,

(. פאזה זו הוטענה על גבי SUPהממברנות כך שהחלבון שמוצה מתוכן נותר מסיס בפאזה המימית )

.TSPO -קולונת ניקל לשם ניקוי ה

איכותי . ניתן לראות באופןSDS-PAGEנבחנו על גבי TSPO-מידת הבידוד והניקיון של חלבון ה

שהתקבלה כמות משמעותית של חלבון ברמת ניקיון יחסית גבוהה.

: פרקצית תמיסה שיצאה מקולונת FT למסות מולקולאריות. סמן - SDS-PAGE. Markerעל גבי TSPO: 08איור

: WB2 : פרקצית תמיסה שיצאה מקולונת הניקל לאחר שטיפה ראשונה.WB1 לניקל. TSPOהניקל לאחר קשירת

מקולונת הניקל. TSPO: אילוציות של E1-E5 פרקצית תמיסה שיצאה מקולונת הניקל לאחר שטיפה שנייה.

Fig 08: SDS-PAGE of TSPO purification. Marker- Molecular weight marker, FT: Unbound proteins, WB1-

WB2: Column washes, E1-E5: Column elutions.

על ידי ספקטרומטר מסות TSPOזיהוי

, בצענו אנליזה TSPOהנקי אשר הופק בתהליך שתואר לעיל הוא אכן המשובטבכדי לאשש שהחלבון

(. אנליזה זו בוצעה במרכז לפרוטאומיקה בפקולטה לביולוגיה בטכניון MSספקטרומטר מסות ) על ידי

Sequestשה ע"י תוכנת הזיהוי נע. LC-MS/MS on the Orbitrap (Thermo)מסוג MS באמצעות

קה אנליטית זו מודדת את היחס בין המסה המולקולארית טכני .TSPO -כנגד רצף חלבון ה 3.31

בשיטה זו בכדי לקבוע את המסה המולקולארית של השתמשנולמטען של פרגמנטים טעונים.

ה מספר עברהפפטידים בכדי לזהות את הרצף ממנו מורכבת דוגמת החלבון. תחילה דוגמת החלבון

ים שאחרי חומצות האמינו ליזין בקשרים פפטיד מסוג טריפסין ם על ידי פרוטאזהחיתוכים אנזימתי

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

39

תחת שדה וליוניזציית הפפטידים גרם MS -פפטידים, מכשיר הלוארגנין. לאחר שהחלבון נחתך

הפרדה לפי יחס מסה מולקולארית / מטען. בסופו התבצעהובדרך זו הואצואלקטרומגנטי הפפטידים

פפטידים המרכיבים את החלבון התקבל ספקטרום של מסות מולקולארית של כל אותם של תהליך ה

למאגר נתונים ידוע בכדי לזהות את החלבון אותו פפטידים אלה הושוותההשלם. מפת הפפטידים

עים מחלבונים ממברנליים אינם מואצים היטב מרכיבים. יש לציין כי לעיתים קרובות, פפטידים הנוב

MSאנליזת תוצאות , ועל כן יתכן שלא כל הפפטידים האפשריים יתקבלו באנליזה. MS -במכשיר ה

רצף של בהשוואה ל 05%של כיסויעם מוצגת באיור הבא SDS-PAGE -של דוגמת החלבון מה

TSPO חלבוןאכן הבון הנבדקת הינה מעידה כי האפשרות הסבירה ביותר שדוגמת החל. תוצאה זו

:שלנו

MPESWVPAVGLTLVPSLGGFMGAYFVRGEGLRWYASLQKPSWHPPRWTL

APIWGTLYSAMGYGSYIVWKELGGFTEDAMVPLGLYTGQLALNWAWPPIF

FGARQMGWALADLLLVSGVATTLAWHRVSPPAARLLYPYLAWLAFATVLN

YYVWRDNSGRRGGSRLPE

(, 9. רצף הפפטידים שזוהו מסומנים באדום )פפטיד SDS-PAGEשל דוגמת חלבון הבודדה מג'ל MS: אנליזת 02איור

(. הרצפים שלא זוהו מסומנים בשחור.5( וירוק )פפטיד 0כחול )פפטיד

Fig 02: MS analysis of sample of isolated TSPO. The identified peptides of the TSPO sequence are colored

in red (peptide 1), blue (peptide 2) and green (peptide 3). The unidentified ones are colored in black.

TSPO -גיבוש חלבון ה

לקבל גבישים השלב הרביעי שלנו הוא לנסות לגבש את החלבון בתנאים שונים שיפורטו בהמשך בכדי

באיכות טובה אשר יאפשרו קבלת מידע מבני. לאחר שהתקבלה כמות חלבון גדולה יחסית ברמת

באמצעות דיאליזה מתמיסת סליקנו, TSPO -ניקיון המתאימה לגיבוש ובטרם ההעמדה לגיבוש של ה

ת את שיירי האימידזול הקיימים בתמיסה עוד משלב הכרומטוגרפיה בכדי למנוע אפשרוהחלבון

לריכוז בר גיבוש. באמצעות TSPO -שהאימידזול יפריע לגיבוש. לאחר הדיאליזה ריכזנו את ה

3ריכזנו את החלבון לטווח ריכוזים שנע בין 10,000Dצנטריקון של

20עד

, טווח ריכוזים זה

-vaporבאידוי" )החלבון הנקי גובש בשיטת "דיפוזיה גבישים. נוצרונמצא ניסיונית כטווח בו

diffusion technique) ( "בתוך "טיפה יושבתsitting drop.) כאשר אנו מגבשים את חלבון ה- TSPO ,

הגביש שייווצר הינו קומפלקס של חלבון + דטרגנט )ללא דטרגנט החלבון ישקע בתמיסה ולא יתגבש

לסרוק תנאי גיבוש שונים בכדי להשיג גביש איכותי אשר יוכל לספק עבורנו מידע מבני עלינו כלל(.

בעלי מספר משתנים, בתקווה ונמצא את השילוב המנצח אשר יצור את הגביש המושלם לשלב הבא

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

40

(. בסריקות הראשונות בחנו תנאים פירוט התנאים שנסרקו מופיעים בנספח)מבנה הבתהליך פענוח

את השילוב אשר ב"טיפה היושבת" בכדי למצוא DDM, וריכוז pHשונים של פולימרים, מלחים,

להתגבש יחדיו. ריכוז החלבון ב"טיפה היושבת" היה קבוע וטמפרטורת DDM -ול TSPO -יאפשר ל

22הגיבוש הייתה oC שלושה סוגי תנאים נוצרו גבישים וביתר התנאים שנבדקו לא נוצרו . תחת

, הם הופיעו בדרך כלל לאחר יומיים שלושה בלבד. TSPOלרוב, כשהופיעו גבישים של גבישים כלל.

, ניתן לראות צילומים של הגבישים שהתקבלו בתנאים המצוינים בסמיכות לכל צילום.98באיור

( reservoirאשר נוצרו בשיטת "דיפוזיה באידוי" בתוך "טיפה יושבת". תנאי תמיסות הגיבוש ) TSPO: גבישי 21 איור

השונות מצוינות בסמיכות לכל צילום.

Fig 21: TSPO crystals which were obtained by the sitting drop vapor diffusion method. The reservoir

conditions are showed next to each photo.

30% PEG400 , 0.1M NaCl

0.1M MES pH=6.5 , 0.1M Li2SO4 , 1% DDM

T=22oC

21% PEG400 , 0.1M AcNa pH=4.6

0.1M CdCl2 , 1% DDM, T=22oC

21% PEG400 , 0.1M AcNa pH=4.6

0.1M CdCl2 , 0.5% DDM, T=22oC

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

41

אנליזה זו נוספת אך הפעם לגבישים מומסים. MSאכן התגבש ביצענו אנליזת TSPOבכדי לוודא כי

LC-MS/MS on theמסוג MS בוצעה במרכז לפרוטאומיקה בפקולטה לביולוגיה בטכניון באמצעות

Orbitrap (Thermo) הזיהוי נעשה ע"י תוכנת .Sequest 3.31 כנגד רצף חלבון ה- TSPO . בהתחשב

אותדוגמאחת משל MSאנליזת מתאר את תוצאות 94איור בעובדה שמדובר בחלבון ממברנלי,

התאמה המאפשרת להסיק כי , TSPOלרצף של כיסוי בהשוואה 54%מקבלים . מהאנליזה גבישיםה

. מדובר בחלבון שלנו

MPESWVPAVGLTLVPSLGGFMGAYFVRGEGLRWYASLQKPSWHPPRWTL

APIWGTLYSAMGYGSYIVWKELGGFTEDAMVPLGLYTGQLALNWAWPPIF

FGARQMGWALADLLLVSGVATTLAWHRVSPPAARLLYPYLAWLAFATVLN

YYVWRDNSGRRGGSRLPE

( וכחול 9פפטיד מסומנים באדום ) ו. רצף הפפטידים שזוהשל דוגמת חלבון שהומסה מגבישים MS: אנליזת 20איור

הרצפים שלא זוהו מסומנים בשחור. (,0פפטיד )

Fig 21: MS analysis of TSPO crystals.. The identified peptides of the TSPO sequence are colored in red

(peptide 1)’ blue (peptide 2) and the unidentified ones are colored in black.

Europeanנלקחו למדידה במאיץ החלקיקים האירופי בגרנובל שבצרפת ) TSPO-גבישי ה

Synchrotron Radiation Facility, ESRFב )- Beamline 14ID-4 לצערנו לא התקבלה תבנית .

.94כפי שניתן לראות באיור בית כלל עבור אף אחד מהגבישים שנמדדודיפרקציה אינפורמטי

, גרנובל, צרפתID14-4, ESRF -ב TSPO: תבניות דיפרקציה של גבישי 22איור

Fig 22: Diffraction pattern of TSPO crystal at ID14I, ESRF, Grenoble, France

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

42

לכך שלא קיבלנו תבנית דיפרקציה כלל, היא שהגבישים שנוצרו היו גבישים אחת הסיבות האפשריות

רכים יחסית, עובדה זו עשויה להעיד על כך שהגביש אינו מסודר דיו, כנראה המבנה הפנימי של הגביש

(TSPO +DDMב )פשרה את יצירת הגביש אך מנעה ממנו על מידה כזו של פלקסביליות אשר א

להעניק תמונת דיפקרציה אינפורמטיבית. זאת ועוד, החלבון שלנו התגבש להיות מספיק מסודר בכדי

קצב התגבשות מהיר יחסית פוגם , קצב התגבשות זה הוא יחסית מהיר.כאמור תוך יומיים שלושה

באיכות סדר הגביש.

:יתה לנסות ולשפר את איכות הגבישים בכמה אופניםיעל כן, הניסיונות הבאים שעשינו, מטרתם ה

אופן הגיבוש של חלבונים : ם שונים, בריכוזים שוניםבעזרת דטרגנטי TSPOש גיבו .0

ממברנלים במערך הגבישי מושפע באופן משמעותי מהבדלים כימיים ואפילו הקטנים ביותר

בין הדטרגנטים בהם משתמשים בגיבוש ולכן עלינו להתמקד במאמץ לסרוק מגוון רחב של

מיציבות לא פחותהדטרגנט הוא פקטור חשוב דטרגנטים לשיפור המערך הגבישי. בחירת

כיוון שמיצלות הדטרגנט חייבות להיות מותאמות הומוגניות החלבון בתמיסת הגיבוש ו

סריג הגבישי של החלבון. אינטראקציות פולאריות בין מיצלות הבאופן אופטימאלי בתוך

להיווצר כאשר שכנות מסייעות ותורמות ליציבות הסריג. קשרים כאלה לא יכולים

. בספרות ידועים שני או קבוצות ראש גדולות מידי הדטרגנטים הם בעלי שרשרות קצרות

9אופני סידור נפוצים של החלבון הממברנלי יחד עם הדטרגנטים ליצירת הסריג הגבישי: סוג

(type 1ו ) 0סוג (type 2)82 הסריג הגבישי מורכב מחלבונים שיוצרים אינטראקציות 9. בסוג

דרופוביות והידרופיליות זה עם זה וגם אינטראקציות הידרופוביות עם הדטרגנטים באופן הי

, כל חלבון עטוף 0, כאשר רוב הדטרגנטים אינם מאורגנים כמיצלות. בסוג 08המתואר באיור

במיצלה וכך הסריג הגבישי מורכב מאינטראקציות פולאריות בין החלקים ההידרופיליים של

ציות פולאריות בין קבוצות הראש של הדטרגנטים באופן המתואר החלבונים ואינטראק

מתארגן בנוכחות הדטרגנטים TSPOאין לנו דרך וודאית לדעת כיצד לצערנו הרב, .08באיור

מתוך הספרות נמצא ניסיונית כי יותר השונים ללא ידיעת המבנה הקריסטלוגרפי של החלבון.

ופחות מסריגים 0התקבלו מסריגים מסוג מבנים קריסטלוגרפים של חלבונים ממברנלים

ממדיים כאשר -מורכבים ממישורים דו 9. אחת הסיבות לכך היא שסריגים מסוג 9מסוג

האינטראקציות בין המישורים הן אינטראקציות חלשות יחסית ולכן עלולות לגרום לגביש

, 0יגים מסוג להיות יותר פלקסבילי ופחות מסודר ומכאן פחות דיפרקציוני. לעומת זאת, סר

ית באריזה של החלבונים עשויים להניב דיפרקציה טובה כאשר קיימת התאמה אופטימאל

לכן הסריג מסודר יותר. יות שנוצרות חזקות יותר ומכאן שהאינטראקצוהמיצלות,

הייתה האסטרטגיה שלנו לשיפור איכות הגבישים הממברנלים אשר אינם נותנים דיפרקציה

בעלי תכונות פיזיקאליות שונות. השוני בגודל המיצלות שייווצרו לסרוק דטרגנטים שונים

מערך שכזה עשוי לאפשר דטרגנט בסריג הגבישי. -עשוי לשפר את איכות אריזת מערך חלבון

יצירה של יותר קשרים בין פני שטח פולארים של החלבונים וכך מקבלים סריג חזק יותר

ומסודר יותר.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

43

)בופר, על בסיס אותם תנאי אופטימיזציה של המשתנים המובילים בהם הופיעו גבישים

הגיבוש( בחנו את pH -מלחים, פולימרים, ממסים האורגנים, טמפרטורת הגיבוש ו

זה מזה על פי אורך השרשרת הפחמנית וגודל ומטען החשמלי הדטרגנטים השונים הנבדלים

את הדטרגנטים השונים בהם השתמשנו לניסויי שיפור מפרטת 0טבלה של "קבוצות הראש".

ת ואופי קבוצת הראש של , כאשר המשתנים הם אורך השרשרTSPOתנאי הגיבוש של

.הדטרגנטים

שכבות דו ממדיות של חלבונים ממברנלים -Type 1: שני סוגים עיקריים של גבישים מחלבונים ממברנלים. 21 איור

חלבון ממברנלי העטוף במיצלות של הדטרגנטים. פני השטח הפולארים של -Type 2היוצרים מבנה תלת ממדי.

דטרגנטים כמיצלות )צבועים בכחול(.החלבונים הממברנלים )צבועים באדום(, דטרגנטים חופשיים )צבועים בוורוד(,

Fig 23: Two main types of membrane crystals. Type1: Two-dimensional layers of membrane proteins

create three-dimensional structure. Type2: membrane protein with detergents micelles. The polar

surface of the proteins colored red, free detergents painted pink and detergents micelles painted blue .

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

44

TSPO: הדטרגנטים השונים בהם השתמשנו לשיפור תנאי הגיבוש של 5טבלה

Table 5: Various detergents we used to improve the crystallization conditions of TSPO

((http://www.affymetrix.com/estore/index.jsp

נוסחה סוג נומקולטורה דטרגנט

מולקולארית

C321 Sodium cholate טעון שלילית C24H39NaO5

C316 CHAPS”" יוני-צוויטר

C32H58N2O7S

C317 CHAPSO”" C32H58N2O8S

PC Phosphatidylcholine C42H82NO8P

LDAO Lauryldimethylamine-oxide C14H31NO

A340 Anameg-7 לא טעון

C15H29NO7

C324 4-Cyclohexyl-1-Butyl-β-D-maltoside C22H40O11

C325 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside C23H42O11

C326 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside C24H44O11

D321 n-Decyl-β-D-glucoside C16H32O6

D322 n-Decyl-β-D-Maltoside C22H42O11

N330 n-Nonyl-β-D-Maltoside C21H40O11

O310 n-Octyl-β-D-maltoside C20H38O11

OG n-Octyl-β-D-glucopyranoside C14H28O6

DDM n-Dodecyl β-D-maltoside C24H46O11

בריכוזים שונים ב"טיפה היושבת" ובטמפרטורות שונות. TSPOגיבוש .2

ולדטרגנטים להתארגן בצורה מיטבית TSPO -בכדי להאט את קצב הגיבוש ובכך לאפשר ל

יותר לכדי גביש מסודר סרקנו תנאי גיבוש עם ריכוזים נמוכים יותר של חלבון וטמפרטורות

4נמוכות יותר )oC.)

יחד עם ליגנדות סינטטיות המסוגלות להיקשר אליו. TSPOגיבוש חלבון .1

מסוגל לקשור אליו ליגנדות סינטטיות המותאמות לאתר הקישור TSPO -ידוע כי חלבון ה

לליגנדות עשוי ליצור מערך חדש אשר אולי TSPOשל חלבון זה. ההנחה הייתה שקשר בין

יהיה מסוגל להתארגן לכדי גביש מסודר יותר.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

45

.X-ray -לפני ההקרנה ב TSPO -הידרציה לגבישי ה-ביצוע דה .4

קיימות גם מולקולות מים רבות, במקרים מסוימים נמצא כי כאשר TSPOבתוך גביש

, הגביש קטן משמעותית X-rayהידרציה לגביש בטרם מקרינים אותו בקרינת -מבצעים דה

בעקבות הוצאת מולקולות מים, תרחיש שכזה עשוי לגרום לגביש להיות מסודר יותר ולשפר

באופן משמעותי את תבנית הדיפרקציה.

עם DDM 0.1%י הגיבוש החדשים, הופיעו גבישים כאשר השתמשנו בשילוב של מסריקת תנא

,C324ודטרגנטים לא טעונים: C317 -ו LDAOיוניים: -הדטרגנטים הבאים: דטרגנטים צוויטר

C325, C326 ו- N330. ,כלומרDDM יוניים או -כדטרגנט לא טעון בשילוב עם דטרגנטים צוויטר

להתארגן בסריג גבישי אשר PDCs-מאפשרים ל maltosides -ת הדטרגנטים לא טעונים ממשפח

ית יותר בשונה ממבט כללי על גבישים אלה, ניתן לראות שהמורפולוגיה שלהם הייתה מוגדרת וצורנ

מתוצאות אלה עדיין במבחן התוצאה, לא התקבלה תבנית דיפרקציה מהגבישים הקודמים.

אינפורמטיבית כלל לאף אחד מגבישים אלה.

עם תערובות של דטרגנטים. אשר נוצרו בשיטת "דיפוזיה באידוי" בתוך "טיפה יושבת" TSPO: גבישי 24 איור

Fig 24: TSPO crystals which were obtained by the sitting drop vapor diffusion method.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

46

., גרנובל, צרפתID23-2, ESRF -ב TSPO: תבניות דיפרקציה של גבישי 25איור

Fig 25: Diffraction pattern of TSPO crystal at ID23-2, ESRF, Grenoble, France

יחד עם הליגנדות הסינטטיות שלו גרמו לחלבון לשקוע. זאת TSPOמעניין לציין כי ניסיונות גיבוש

, גרמו לפירוקו. תופעות אלו עשויות לרמז על TSPOועוד, הוספת ליגנדות סינטטיות לגביש קיים של

מומס כאשר הוא מיוצב עם דטרגנט. שימר את פעילותו במצב גבישי ובמצב TSPO -כך שחלבון ה

יגנדות סינטטיות, מתרחש שינוי בקונפורמציה של החלבון באופן ייתכן וכאשר החלבון בא במגע עם ל

מומס שיוצר אינטראקציות עם הליגנדות מונע מהדטרגנט לייצב את TSPOכזה שבמקרה הראשון,

בגביש TSPOהקומפלקס החדש שנוצר ולכן החלבון שוקע ובמקרה השני, שינוי הקונפורמציה של

לא ניתן לראות בתופעות אלה הוכחה אלא השערה ביש.מעלה את האי סדר ובכך גורם לפירוק הג

בלבד, מכיוון שלנוכח רגישות תנאי הגיבוש של החלבונים הממברנלים, ייתכנו גורמים מרובים

לא סיפקו לנו TSPOלצערנו הרב, שינויי טמפרטורה וריכוזי שייגרמו לשיקוע או להמסת הגביש.

יצענו לגבישים טרם ההקרנה, אומנם הקטינו את נפח הידרציה שב-גבישים טובים יותר. כמו כן, הדה

הגבישים אך לא שיפרו את תבנית הדיפרקציה שהתקבלה.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

47

TSPO-בדיקת פעילות ה

ה הינו שלב חיוני ביותר . שלב זTSPO -בדיקת פעילות חלבון ה היההשלב החמישי במחקר זה

, E. coliכיוון שבמידה והחלבון שעבר מספר שלבי טראומה )שיבוט וביטוי ביתר בחיידקי במחקרנו

הוצאה מתוך ממברנת החיידקים והמסה בעזרת דטרגנט, בידוד וניקוי ועד לריכוז וגיבוש( איבד את

פעילותו, אזי אין חשיבות כלל למחקר המבני, מחקר שכזה יהיה חסר תועלת. אובדן הפעילות יעיד על

ובדן המבנה הנטיבי של החלבון. מכאן, כי עלינו לנסות ולאפיין את פעילות החלבון בשיטות א

ביוכימיות.

,המייצגות את השלבים השונים בהפקה ובגיבוש החלבון לשם TSPOהכנו שלוש דוגמאות שונות של

:בדיקת הקישוריות

TSPO מבוטא ביתר בממברנות מופרדות של משובטE. coli

כחלבון קושר ליגנדה )ריכוז החלבון TSPOניתן לראות כי קיימת פעילות מסוימת של 06באיור

0.472) -שווה ל בתמיסה הנמדד

. ניתן לראות באיור השמאלי שככל שריכוז הליגנדות

הליגנדות הקשורות לרצפטורים גדל עד שניתן ריכוז הרדיואקטיביות החופשיות בתמיסה גדל כך גם

חלת מגמה השואפת לרוויה של כל הרצפטורים בתמיסה. כאשר מעבדים את הנתונים להבחין בהת

ניתן לראות כי מתקבל גרף ליניארי בעל מקדם קורלציה )האיור הימני(, Scatchard plotלדיאגרמת

(R של )מתוך נתונים אלו נמצא כי 0.94 .Bmax שלTSPO 3054 -שווה ל

וקבוע הפירוק

חשוב לציין כי ההנחה המסתמכת על גרף זה ומתוך מחקרים .3.35nM -( שווה לKd) TSPOשל

קיים אתר ספציפי אחד. TSPOקודמים כי לכל

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

48

PK11195 [3H] -ל E. coliהמצוי בממברנות מופרדות של TSPOאפיון קישור : Scatchard plot: דיאגרמת 21איור

;ריכוז ליגנדות קשורות -B(. קיצורים: nM 0.2-6)ריכוז סופי

יחס בין ריכוז ליגנדות קשורות לריכוז ליגנדות -

חופשיות.

Fig 26: TSPO binding characteristics in TSPO inside membrane. Scatchard plot of [3H] PK11195 binding

to TSPO. Abbreviations: B: concentration of bound ligand;

: concentration of bound ligand over

concentration of free ligand.

TSPO משובט מומס בבופרlysis ע"י דטרגנטDDM 0.1%

, לא הייתה עדות DDM 0.1% לליגנדות במצב מומס בבופר ע"י TSPOכאשר בחנו את הקישור של

במצב חופשי בתמיסה אינו קושר ליגנדות. TSPO, כלומר לפעילות החלבון

TSPO מומס מגבישים בבופרlysis ע"י דטרגנטDDM 0.1%

, לא הייתה DDM 0.1%מומס בבופר ע"י לליגנדות במצב TSPOכאשר בחנו את הקישור של גבישי

מומס מגבישים אינו קושר ליגנדות. TSPO, כלומר עדות לפעילות החלבון

פעיל כאשר הוא נמצא בתוך סביבה ממברנלית כיאה TSPOמתוך שלושת הממצאים הללו הסקנו כי

לחלבון ממברנלי, אך כאשר הוא מומס בתמיסה מימית הוא מאבד את פעילותו. כלומר, הסביבה בה

מצוי החלבון משפיעה על פעילות החלבון ולכן הניסוי הבא אותו ערכנו היה ליצור מערכת המדמה

ומס ולבדוק האם שבה פעילותו של החלבון. המ TSPO -סביבה ממברנלית ולהכניס לתוכה את ה

. TSPO -ליפוזומים. כלומר, ויסיקולות מלפידים אשר חוצים אותן חלבוני ה-לצורך כך, הכנו פרוטאו

הוסיקולות מהוות מודל מלאכותי לממברנה ביולוגית.

TSPO ליפוזום-משובט כפרוטאו

"חומרים ושיטות", על פי פרוצדורה ליפוזומים מפורטת בקטגוריה של-פרוצדורת ההכנה של פרוטאו

TSPO -מה 50% -חוצה את המערכת הליפידית של הליפוזום בשני אופנים, ב TSPOזו,

פונה אל החלק החיצוני של , PK11195 -טרמינלי, בו מצוי אתר הקישור ל C -בליפוזומים, הקצה ה

TSPO -האחרים של ה 50% -בהליפוזום, כלומר, קצה זה זמין לקישור ליגנדות בעת מדידת פעילות ו

50%טרמינלי פונה אל החלק הפנימי של הליפוזום, כלומר במקרה כזה, C-בליפוזומים, הקצה ה

החלבון איזו זמין לקישור ליגנדות ולכן הוא אינו פעיל כלל.מ

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

49

] -בקונפיגורציה זו לקשור את ליגנדות ה TSPOכעת בדקנו את היכולת של 3H] PK11195 . 04באיור

ליפוזום )ריכוז החלבון -כאשר הוא חלק מפרוטאו TSPOניתן לראות כי קיימת פעילות מסוימת של

0.3) -הנמדד שווה ל

שככל שריכוז הליגנדות הרדיואקטיביות ניתן לראות באיור השמאלי.

לרצפטורים גדל עד לרוויה של כל הליגנדות הקשורות החופשיות בתמיסה גדל כך גם מספר

ניתן לראות כי )האיור הימני(, Scatchard plotהרצפטורים. כאשר מעבדים את הנתונים לדיאגרמת

TSPOשל Bmaxתוך נתונים אלו נמצא כי . מ0.97מתקבל גרף ליניארי בעל מקדם קורלציה של

4804 -שווה ל

.2.94nM -שווה ל TSPOוקבוע הפירוק של

PK11195 [3H] -ל E. coliהמצוי בממברנות מופרדות של TSPOאפיון קישור : Scatchard plot: דיאגרמת 28איור

;ריכוז ליגנדות קשורות -B(. קיצורים: nM 0.2-6)ריכוז סופי

יחס בין ריכוז ליגנדות קשורות לריכוז ליגנדות -

חופשיות.

ליפוזומית הנוצרת משכבה כפולה של -: מערכת פרוטאו21איור

כך שבמחצית TSPO -ליפידים אשר נחצים על ידי חלבוני ה

טרמינלי פונה אל מחוץ לליפוזום ובמחצית C-מהחלבונים, הקצה ה

טרמינלי פונה אל פנים הליפוזום. C -השנייה של החלבונים, הקצה ה

החלבון מאויר בצבעי כחול ואדום.

Fig 27: Proteo-liposome system resulting from double layer of lipids which

being crossed by trans-membrane proteins in a way that 50% of the protein

C terminal turns out from the liposome and another 50% the proteins C

terminal turns into the liposome. Protein illustrated in blue and red

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

50

Fig 27: TSPO binding characteristics in reconstituted recombinant TSPO. Scatchard plot of [3H]

PK11195 binding to TSPO. Abbreviations: B: concentration of bound ligand;

: concentration of bound

ligand over concentration of free ligand.

מגלה פעילות כאשר הוא מהווה חלק ממערכת TSPO -על פי תוצאה זו ניתן להסיק כי חלבון ה

שר הוא במצב מומס בתמיסה מימית.ממברנלית או ליפידית ולא כא

פידית עלינו יהמשובט פעיל כאשר הוא חלק ממברנה או ממערכת ל TSPOבכדי להבין עד כמה

נטיבי הקיים בתאים אנימליים. TSPOשלו לערכים של Kd -ו Bmaxלהשוות את ערכי

נטיבי כפי שקיים ברקמות שונות בעכבר בהשוואה לערכים TSPOשל Kd -ו Bmax: ערכי 1טבלה

Dimitrova-Shumkovska) ליפוזום-וכפרוטאו E. coliמשובט בממברנה של TSPOהניסיוניים של

et al. 2010)

Table 6: Values of Bmax and Kd of native TSPO as they exist in various mouse tissues

compared with the experimental values of cloned TSPO inside E. coli membrane and as

proteo-liposome (Dimitrova-Shumkovska et al. 2010).

רקמות העכברBmax (

)

Kd (nM)

0.4 ± 1.7 933 ± 1960 בכבד

0.9 ± 1.8 1800 ± 4387 בלב

0.3 ± 0.8 400 ± 3001 אשך

0.9 ± 1.9 860 ± 4270 כיליה

0.4 ± 1.5 82 ± 300 מוח

TSPO משובט בממברנה שלE. coli 3054 3.35

TSPO 2.94 4804 ליפוזום-משובט כפרוטאו

משובט הן בממברנה של TSPOשל Bmax -ניתן לראות כי ערכי ה 6 מתוך הערכים המוצגים בטבלה

E. coli ליפוזום מבחינת סדר גודל קרובים זה לזה ודומים בגודלם לערכי -והן כפרוטאוBmax של

TSPO ,ליה של עכבר. במבט כללי ניתן לחשוב כי רוב חלבוני הוהכ אשכיםנטיבי ברקמות הלב-

TSPO בשתי קבוצות הניסוי אכן פעילים ביחידות של

בקפידה . אך אם נבחן את הערכים

אכן יהיה באותו סדר גודל כמו E .coliמשובט בממברנת TSPOעבור Bmaxנצפה כי סדר הגודל של

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

51

Bmax שלTSPO נטיבי מכיוון שמדובר בשני המקרים בממברנות של תאים בהןTSPO הוא חלק

, לאE. coli -המשובט מבוטא ביתר ב TSPO -ממערך חלבונים נוספים הקיים בממברנה, ולמרות שה

כל החלבון המשובט שנוצר בחיידקים הגיע אל הממברנות, רובו שקע כאגרגטים בציטופלזמה של

זאת ועוד, במהלך תהליך ההפרדה של ממברנות החיידקים .החיידקים ומיעוטו התמקם בממברנה

מתאי החיידקים, חלק ממקטעי הממברנות שחברו מחדש, חוברו כך שהחלק הפנימי שלהם כעת

-טרמינלי של חלק מחלבוני ה C-וני של הממברנה ולהפך. מצב כזה גורם לקצה המשמש כחלק החיצ

TSPO ו זמין, נהמשובטים לפנות אל פנים הממברנה ולא אל החוץ, עקב כך אתר הקישור לליגנדות אי

לא מסוגלים לקשור ליגנדות בגלל האוריינטציה ההפוכה ולאו TSPO -ומכאן כי חלק מהחלבוני ה

משובט TSPOשל Bmax -דווקא מכיוון שהחלבונים לא פעילים. מכאן כי לא צריך לצפות שה

נטיבי, אלא נוכל TSPOשל Bmax -יהיה בכמה סדרי גודל גבוה יותר מ E. coliהממוקם בממברנת

של Bmaxשלהם יהיה באותו סדר גודל של Bmaxלצפות שבמידה והחלבונים אכן פעילים,

יהיה גבוה Bmax -ליפוזום, נצפה שה-משובט כפרוטאו TSPO -החלבונים הנטיבים. לעומת זאת, ב

מהחלבונים הממברנלים 50%נטיבי, למרות שרק TSPOשל Bmax -בכמה סדרי גודל יותר מ

המהווה חלק ממערכת המשובט המבוטא ביתר TSPO -פעילים. הסיבה לכך לדעתנו היא שה

יהיו גבוהים בהרבה יותר Bmaxליפוזום הינו החלבון היחידי במערכת זו ולכן נצפה שערכי -הפרוטאו

כיוון שהערכים הם באותו סדר גודל, ניתן נטיבי בממברנות של רקמות העכבר. TSPO -בהשוואה ל

עילותם. אילו כל ליפוזומית איבדו את פ-במערכת הפרוטאו TSPO -להסיק כי רוב חלבוני ה

טרמינלי שלהם פונה אל מחוץ לליפוזום( היו פעילים הינו C-החלבונים הזמינים לקישור )הקצה ה

0.3x10 -תיאורטי השווה ל Bmaxמצפים לקבל ערך 8

אחת הסיבות האפשרויות לאובדן .

רכת הממברנלית, השוני בין המערכות הפעילות היא, שלמרות הדמיון בין המערכת הליפוזומית למע

פוגע בפעילות של החלבון. במערכת הממברנלית קיימים חלבונים ורכיבים נוספים שכנראה יוצרים

TSPO -ובכך מאפשרים את פעילותו, אינטראקציה שלא קיימת ל TSPO -אינטראקציה עם ה

TSPO -התייחסות לבמערכת הליפוזומית. עדות לאינטראקציה שכזו הוצגה ברקע התיאורטי ב

. סיבה אפשרית נוספת לאובדן הפעילות ומפלקס הרב חלבוני בממברנת המיטוכונדריהכחלק מהק

עשויה להיות הטראומה שהחלבון "חווה" במהלך הפקתו והרכבתו אל תוך המערכת הליפידית של

שיטת המדידה ביןיתכנות אי התאמה הלחשוב עליה, היא ליפוזום. השערה נוספת שניתן -הפרוטאו

ליפוזומית. שיטת מדידת הקישור של לינגדות -משובט במערכת פרוטאו TSPOלבדיקת פעילות

PK11195 ל-TSPO כפי שפותחה במעבדתו של פרופסור משה גביש, מיועדת במקור לבדיקת פעילות

TSPO רקמותרקמות איברי אורגניזם אנימלי. כאמור, מ בממברנות של תאיםנטיבי כפי שמבוטא

אינו החלבון הדומיננטי שבהן. בטרם מדידת פעילות TSPOמכילות מספר רב של חלבונים, כאשר

אותו מקבלים בתום הבדיקה הוא Bmax -החלבון, יש לקבוע את ריכוז החלבון הכולל בדוגמה, ערך ה

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

52

המקסימאלי שקושר את הליגנדות ביחס לריכוז החלבון הכולל. מכאן, כי ריכוז TSPOריכוז

בדוגמה TSPO-דות החופשיות בהן משתמשים בניסויי הפעילות מותאם להנחה שריכוז ההליגנ

המשובט שלנו, במערכת TSPO-וזאת בניגוד להנבדקת הוא קטן מאוד ביחס ליתר החלבונים

ולכן ייתכן, כי השיטה בה אנו ,הוא החלבון היחידי בשכבה הליפידית TSPO בה ליפוזומית,-פרוטאוה

משובט בריכוז גבוה. יתכן וריכוזי TSPOאינה מכוילת למדידת פעילות של משתמשים במעבדה

משובט TSPOהליגנדות החופשיות בתמיסה אינם מספיקים בכדי לבדוק הגעה למצב רוויה של

אותם קיבלנו לא משקפים את הכמות הפעילה הפוטנציאלית Bmaxליפוזום, ולכן ערכי -בפרוטאו

כלומר טווח הריכוזים של הליגנדות החופשיות בדוגמה אינו האמיתית של הרצפטורים בדוגמה.

בתחום המאפשר תיאור נכון של קישור הליגנדות לרצפטור.

מבחינת ערך קבוע הפירוק, באה לידי ביטוי באותם ניסויי פעילות הייתהנקודת האור שלנו במחקר

Kd . ,ניתן לראות שבשני המקריםTSPO משובט בממברנה של ה- E. coli גם הו- TSPO המשובט

ברקמות של העכבר. TSPOשל Kd יהיו בעלי אותו סדר גודל כמו ערכ Kdליפוזום, ערכי -כפרוטאו

Scatchard plot דיאגרמתהתקבל מתוך מכיוון שקבוע הפירוק הוא גודל קבוע ומאפיין ומכיוון שהוא

בעלת קורלציה גבוהה ניתן להסיק מכך שהחלבונים המשובטים שכן הראו פעילות בניסויים אלה

מגלים את אותה האפיניות כמו חלבונים נטיבים, וזה כבר ממצא מעודד.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

53

סיכום

( הינו חלבון החוצה את הממברנה החיצונית של Translocator protein) TSPO -חלבון ה

סטרול . התפקיד העיקרי הידוע עד כה לחלבון זה הוא ההעברה של כול18KDaהמיטוכונדריה וגודלו

ת, שלב זה הינו שלב הפנימי של הממברנה המיטוכונדריית אל החלק מחוץ לממברנה המיטוכונדר

מעורב בתהליכים ביולוגים TSPOפקיד זה, זה של סטרואידים. בנוסף לתסינת-קובע מהירות בביו

, שובט, Rattus norvegicusמתאי חולדה מסוג TSPO-רבים אחרים שאינם ברורים דיו. חלבון ה

בוטא, בודד ונוקה לרמת ניקיון גבוהה בכמות גדולה יחסית מבלי להשתמש בדטרגנטים דנטורטיבים.

בר גיבוש במספר תנאים שונים, TSPOניסיונות הגיבוש של החלבון המשובט הנקי הראו כי

שגובשו בעבר אולם באף אחד מהתנאים TSPOמורפולוגית הגבישים השתפרה ביחס לגבישי

TSPOהחדשים הגבישים שנוצרו לא הניבו תבנית דיפרקציה אינפורמטיבית כלל. בדיקת פעילות

שר לליגנדות סינטטיות מעידים כי החלבון פעיל ונקE. coli משובט בתוך ממברנות מופרדות של

]מסוג 3H] PK11195 כמו כן, קבוע הפירוק של החלבון המשובט דומה בערכו לקבוע הפירוק של .

TSPO .נטיבי בתאים אנימלים

לצערנו הרב, למרות השיפור באיכות ההפקה והגיבוש, הגבישים שהתקבלו לא סיפקו : נתיבים לעתיד

בשתי TSPO -זה עלינו לנסות ולהמשיך לחקור את ה לנו מידע מבני כלל. מפאת החשיבות של מחקר

אסטרטגיות עיקריות. האחת להמשיך ולסרוק שילובים נוספים, חדשים ואחרים של דטרגנטים יחד

ובמקביל עם החלבון בכדי לנסות ולהגיע לשילוב המנצח שייצור מבנה מספיק מסודר לדיפרקציה

עלינו כמו כן. שמר טוב יותר את מבנה החלבוןלנסות לגבש את החלבון עם ליפידים אשר עשויים ל

כאמור לנסות ולהתאים את טכניקת מדידת הפעילות של החלבון בכדי לנסות ולאפיין באופן טוב

בשלבים השונים של ההפקה וגיבוש החלבון. האסטרטגיה השנייה היא TSPOואמין יותר את פעילות

ר חיידקי ולא אנימלי. כפי שפורט בהקדמה, אך הפעם ממקו TSPO-לנסות ולשבט חלבון הומולוגי ל

ממקור חיידקי TSPO-ביטוי חלבון אנימלי בחיידקים הוא בעייתי, ייתכן כי ביטוי חלבון הומולוגי ל

ישפיע על אופן הקיפול של החלבון הן בממברנה של החיידקים, הן במיצלות של דטרגנט E. coli -ב

שי כך שהגבישים שיתקבלו יהיו מסודרים יותר במצב מומס ובעיקר בהתארגנותו בקופלקס הגבי

אחד הניסיונות שנעשו במעבדתנו היה לנסות לשבט, לבטא, ברמה שיניבו דיפרקציה אינפורמטיבית.

בקטריה מסוג -, אשר מקורו בציאנוTSPO -להפיק ולגבש חלבון ממשפחת ה

Cyanobacterium, Synechocystis 6803 , חלבון זה מכונהTspO (tryptophan-rich sensory

protein .) מלאכת השיבוט נעשתה אך התגלה קושי בשלב ביטוי החלבון המשובט. ניסיונות נוספים

האפשרות לקבל מבט והמשך מחקר בשני כיוונים אלה עשויים בעתיד לקדם אותנו יותר אל עבר

.TSPO-פנימי אל תוך חלבון ה

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

54

TSPO שלסיכום ניסיונות הגיבוש -נספח

תוצאות ריכוז החלבון חלבון תוספים תנאי גיבוש30% PEG400

0.1M AcNa

pH4.6

0.1-1% DDM

20oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

14-20

נוצר משקע

30% PEG400

0.1M NaCl

0.1M MES

pH6.5

0.1M Li2SO4

0.1-0.5% DDM

20oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

14-20

לא נוצרו גבישים

1% DDM

20oC

14-20

נוצרו גבישים

ימים 1לאחר

21% PEG400

0.1M AcNa

pH4.6

0.1M CdCl2

0.1% DDM

20oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

14-20

לא נוצרו גבישים

0.5% DDM

20oC

14-20

נוצרו גבישים

1% DDM

20oC

14-20

נוצרו גבישים

20% PEG4K

0.1M HEPES

pH7.5

10% 2-propanol

0.1-1% DDM

20oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

14-20

לא נוצרו גבישים

21% PEG400

0.1M AcNa

pH7.6

0.1M CdCl2

0.1% DDM

0.1-0.5% D321

15oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% D322

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.3% LDAO

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

55

0.1% DDM

0.5% LDAO

15oC

3-7

נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1% N336

15oC

3-7

נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.3% N336

15oC

3-7

נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.5% N336

15oC

3-7

נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% O310

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

21% PEG400

0.1M AcNa

pH7.6

0.1M CdCl2

0.1% DDM

0.1-1% C316

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% C317

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% C321

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% C324

15oC

3-7

נוצרו גבישים לא

0.1% DDM

0.1-0.5% C325

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

56

0.1% DDM

0.1-0.3% C326

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.5% C326

15oC

3-7

נוצרו גבישים

21% PEG400

0.1M AcNa

pH7.6

0.1M CdCl2

0.1% DDM

0.1-0.5% A340

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% PC

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% OG

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.05% CYMAL6

15oC

3-7

התקבלו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% CYMAL6

15oC

3-7

גבישים לא נוצרו

30% PEG400

0.1M NaCl

0.1M MES

pH9.5

0.1M Li2SO4

0.1% DDM

0.1-1% C316

15oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.3% C317

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.5% C317

15oC

3-7

גבישיםהתקבלו

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

57

0.1% DDM

0.1% C321

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.3% C321

15oC

3-7

התקבלו גבישים

0.1% DDM

0.5% C321

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% C324

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.3% C325

15oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.5% C325

15oC

3-7

התקבלו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.3% D321

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.5% D321

15oC

3-7

התקבלו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% D322

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1% LDAO

15oC

3-7

התקבלו גבישים

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

58

0.1% DDM

0.3-0.5% LDAO

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% N336

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% O310

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

30% PEG400

0.1M NaCl

0.1M MES

pH9.5

0.1M Li2SO4

0.1% DDM

0.1-0.5% A340

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.5% PC

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

0.1% DDM

0.05% CYMAL6

15oC

3-7

התקבלו גבישים

0.1% DDM

0.1-0.3% CYMAL6

15oC

3-7

לא נוצרו גבישים

21% PEG400

0.1 AcNa

pH7.6

0.1M CdCl2

0.1% DDM

0.1-1% PK11195

15oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

3-7

נוצר משקע

0.5% DDM

0.1-1% PK11195

15oC

3-7

נוצר משקע

1% DDM

0.1-1% PK11195

15oC

נוצר משקע

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

59

30% PEG400

0.1M NaCl

0.1M MES

pH9.5

0.1M Li2SO4

0.1% DDM

0.1-1% PK11195

15oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

3-7

נוצר משקע

0.5% DDM

0.1-1% PK11195

15oC

3-7

נוצר משקע

1% DDM

0.1-1% PK11195

15oC

3-7

נוצר משקע

20% PEG4K

1% HT

10mM Tris

pH8

0.8% OG

20oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

3-7

התקבלו גבישים

לאחר שלושה

ימים

20% PEG4K

1% HT

10Mm Tris

pH8

20mM NaCl

0.8% OG

15oC

TSPO in

50mM Tris

pH8 and

0.1% DDM

3-7

התקבלו גבישים

לאחר שבוע

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

60

מקורות

1. Papadopoulos, V. et al. Peripheral benzodiazepine receptor in cholesterol

transport and steroidogenesis. Steroids 62, 21–28 (1997).

2. Fan, J., Rone, M. B. & Papadopoulos, V. Translocator protein 2 is involved in

cholesterol redistribution during erythropoiesis. J. Biol. Chem. 284, 30484–30497

(2009).

3. Casellas, P., Galiegue, S. & Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and

mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475–486 (2002).

4. Gavish, M. et al. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor. Pharmacol.

Rev. 51, 29–650 (1999).

5. Kuhlmann, A. C. & Guilarte, T. R. Cellular and subcellular localization of

peripheral benzodiazepine receptors after trimethyltin neurotoxicity. J

Neurochem. 74, 1694–1704 (2000).

6. Maeda, J. et al. Phase-dependent roles of reactive microglia and astrocytes in

nervous system injury as delineated by imaging of peripheral benzodiazepine

receptor. Brain Res. 1157, 100–111 (2007).

7. Anholt, R. R., Murphy, K. M., Mack, G. E. & Snyder, S. H. Peripheral-type

benzodiazepine receptors in the central nervous system: localization to olfactory

nerves. J. Neurosci. 4, 593–603 (1984).

8. Bolger, G. T. et al. Differential regulation of ‘central’ and ‘peripheral’

benzodiazepine binding sites in the rat olfactory bulb. Eur. J. Pharmacol. 105,

143–148 (1984).

9. Lacapere, J. J. & Papadopoulos, V. Peripheral-type benzodiazepine receptor:

structure and function of a cholesterol-binding protein in steroid and bile acid

biosynthesis. Steroids 68, 569–585 (2003).

10. Hirsch, J. D., Beyer, C. F., Malkowitz, L., Beer, B. & Blume, A. J. Mitochondrial

benzodiazepine receptors mediate inhibition of mitochondrial respiratory control.

Mol. Pharmacol. 35, 157–163 (1989).

11. Corsi, L., Geminiani, E. & Baraldi, M. Peripheral benzodiazepine receptor (PBR)

new insight in cell proliferation and cell differentiation review. Curr. Clin.

Pharmacol. 3, 38–45 (2008).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

61

12. Veenman, L., Papadopoulos, V. & Gavish, M. Channellike functions of the 18-

kDa translocator protein (TSPO): regulation of apoptosis and steroidogenesis as

part of the host-defense response. Curr. Pharm. Des. 13, 2385–2405 (2007).

13. Papadopoulos, V. et al. Translocator protein (18kDa): new nomenclature for the

peripheral-type benzodiazepine receptor based on its structure and molecular

function. Trends Pharmacol. Sci. 27, 402–409 (2006).

14. Papadopoulos, V., Liu, J. & Culty, M. Is there a mitochondrial signaling complex

facilitating cholesterol import? Mol. Cell Endocrinol. 266, 59–64 (2007).

15. Lacapere, J. J. & Papadopoulos, V. Peripheral-type benzodiazepine receptor:

structure and function of a cholesterol-binding protein in steroid and bile acid

biosynthesis. Steroids 68, 569–585 (2003).

16. Rainer, R., et al. Translocator protein (18 kDa) (TSPO) as a therapeutic target for

neurological and psychiatric disorders. Nature Reviews, Drug Discovery 9, 971-

987 (2010).

17. Chauveau, F., Boutin, H., Van, C. N., Dolle, F. & Tavitian, B. Nuclear imaging of

neuroinflammation: a comprehensive review of [11C]PK11195 challengers. Eur.

J. Nucl. Med. Mol. Imaging 35, 2304–2319 (2008).

18. Karchewski, L. A., Bloechlinger, S. & Woolf, C. J. Axonal injury-dependent

induction of the peripheral benzodiazepine receptor in small-diameter adult rat

primary sensory neurons. Eur. J. Neurosci. 20, 671–683 (2004).

19. Mills, C. D., Bitler, J. L. & Woolf, C. J. Role of the peripheral benzodiazepine

receptor in sensory neuron regeneration. Mol. Cell. Neurosci. 30, 228–237 (2005).

20. Lacor, P. et al. Regulation of the expression of peripheral benzodiazepine

receptors and their endogenous ligands during rat sciatic nerve degeneration and

regeneration: a role for PBR in neurosteroidogenesis. Brain Res. 815, 70–80

(1999).

21. Venneti, S. et al. The high affinity peripheral benzodiazepine receptor ligand

DAA1106 binds specifically to microglia in a rat model of traumatic brain injury:

implications for PET imaging. Exp. Neurol. 207, 118–127 (2007).

22. Papadopoulos, V. & Lecanu, L. Translocator protein (18 kDa) TSPO: an

emerging therapeutic target in neurotrauma. Exp. Neurol. 217, 53–57 (2009).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

62

23. Cosenza-Nashat, M. et al. Expression of the translocator protein of 18 kDa by

microglia, macrophages and astrocytes based on immunohistochemical

localization in abnormal human brain. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 35, 306–328

(2009).

24. Edison, P. et al. Microglia, amyloid, and cognition in Alzheimer’s disease: An

[11C](R)PK11195-PET and [11C] PIB-PET study. Neurobiol. Dis. 32, 412–419

(2008).

25. Yasuno, F. et al. Increased binding of peripheral benzodiazepine receptor in

Alzheimer’s disease measured by positron emission tomography with [11C]

DAA1106. Biol. Psychiatry 64, 835–841 (2008).

26. Papadopoulos, V., Lecanu, L., Brown, R. C., Han, Z. & Yao, Z. X. Peripheral-

type benzodiazepine receptor in neurosteroid biosynthesis, neuropathology and

neurological disorders. Neuroscience 138, 749–756 (2006).

27. Pavese, N. et al. Microglial activation correlates with severity in Huntington

disease: a clinical and PET study. Neurology 66, 1638–1643 (2006).

28. Ouchi, Y. et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early

Parkinson’s disease. Ann. Neurol. 57, 168–175 (2005).

29. Gerhard, A. et al. In vivo imaging of microglial activation with [11C](R.)-

PK11195 PET in idiopathic Parkinson’s disease. Neurobiol. Dis. 21, 404–412

(2006).

30. Vlodavsky, E. & Soustiel, J. F. Immunohistochemical expression of peripheral

benzodiazepine receptors in human astrocytomas and its correlation with grade of

malignancy, proliferation, apoptosis and survival. J. Neurooncol. 81, 1–7 (2007).

31. Bai, M., Rone, M. B., Papadopoulos, V. & Bornhop, D. J. A novel functional

translocator protein ligand for cancer imaging. Bioconjug. Chem. 18, 2018–2023

(2007).

32. Romeo, E. et al. Effects of antidepressant treatment on neuroactive steroids in

major depression. Am. J. Psychiatry 155, 910–913 (1998).

33. Rupprecht, R. Neuroactive steroids: mechanisms of action and

neuropsychopharmacological properties. Psychoneuroendocrinology 28, 139–168

(2003).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

63

34. Ströhle, A. et al., Induced panic attacks shift gammaaminobutyric acid type A

receptor modulatory neuroactive steroid composition in patients with panic

disorder: preliminary results. Arch. Gen. Psychiatry 60, 161–168 (2003).

35. Weber, P. C., Physical principles of protein crystallization. Adv. Prot. Chem. 41,

1-36 (1991).

36. Drenth, J. and Hass, C. Protein crystals and their stability. J. Cryst. Growth 122,

107-109 (1992).

37. Boistelle, R. and Astier, J. P., Crystallization mechanisms in solution. J. Cryst.

Growth 90, 14-30 (1988).

38. Feher, G. and Kam, Z., Nucleation and growth of protein crystals: general

principles and assays, Meth. Enzym. 114, 77-11 (1985).

39. McPherson, A., Crystallisation of proteins from polyethylene glycol, J. Biol.

Chem. 251, 6300-6303 (1976).

40. Ducruix, A. and Giege, R., Crystallization of nucleic acids and proteins. A

practical approach, Oxford University Press, New York (1992).

41. McPherson, A., Crystallization of biological macromolecules, Cold Spring

Harbor Press, New York (1999).

42. E. Wallin, G. von Heijne, Genome-wide analysis of integral membrane proteins

from eubacterial, archaean and eukaryotic organisms, Protein Sci. 7, 1029–1038

(1998).

43. D. Drew, Assembly and overexpression of membrane proteins in Escheria coli,

Biochim. Biophys. Acta 1610, 3– 10 (2003).

44. Gilbert G. Prive, Detergents for stabilization and crystallization of membrane

proteins, Methods 41, 388-397 (2007).

45. M. Le Maire, P. Champeil, J.V. Moller, Interaction of Membrane Proteins and

Lipids With Solubilizing Detergents, Biochim. Biophys. Acta 1508, 86–111

(2000).

46. C. Hitscherich Jr., J. Kaplan, M. Allaman, J. Wiencek, P.J. Loll, Static light

scattering studies of OmpF porin: implications for integral membrane protein

crystallization, Protein Sci. 9, 1559–1566 (2000).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

64

47. Awad M. and Gavish M., Peripheral-type benzodiazepine receptors in human

cerebral cortex, kidney and colon. Life Sci 49, 1155-1161 (1991).

48. Awad M. and Gavish M., Binding of [3H]Ro 5-4864 and [

3H]PK11195 to cerebral

cortex and peripheral tissues of various species: species differences and

heterogeneity in peripheral benzodiazepine binding sites. J. Neurochem 49, 1407-

1414 (1987).

49. Park C.H., Lukacs L.G., Mastropaolo J. and Deutsch S.I. Selective effects of

MAO inhibition on peripheral benzodiazepine receptor binding in the mouse. Isr.

J Psychiatry Relat Sci 34, 300-307 (1997).

50. Beurdeley-Thomas A., Miccoli L., Oudard S., Dutrillaux B. and Poupon M.F.,

The peripheral benzodiazepine receptors: a review, J. Neurooncol 46, 45-56

(2000).

51. Culty M. et al., In vitro studies on the role of the peripheral-type benzodiazepine

receptor in steroidogenesis, J Steroid Biochem Mol Biol 69, 123-130 (1999).

52. Joseph-Liauzun E., Farges, R. Delmas P., Ferrara P. and Loison G., The Mr

18,000 Subunit of the Peripheral-type Benzodiazepine Receptor Exhibits Both

Benzodiazepine and Isoquinoline Carboxamide Binding Sites in the Absence of

the Voltage-dependent Anion Channel or of the Adenine Nucleotide Carrie, J.

Bio. Chem. 272, 28102-28106 (1997).

53. Zhang M.R. et al., [2-11C]isopropyl-, [1-11C]ethyl- and [11C]methyl-labeled

phenoxyphenyl acetamide derivatives as positron emission tomography ligands

for the peripheral benzodiazepine receptor: radiosynthesis, uptake and in vivo

binding in brain, J. Med. Chem. 49, 2735-2742 (2006).

54. Stajanovski D., Johnston A.J., Streimann I, Hoogenraad N.J. and Ryan M.T.,

Import of nuclear-encoded proteins into mitochondria, Exp. Physiol. 88, 57-64

(2003).

55. Rehling P., Brandner K. and Pfanner N., Mitochondrial import and the twin-pore

translocase, Nat. Rev. Mol Cell Biol 5, 519-530 (2004).

56. Neupert W. and Herrmann J.M., Translocation of proteins into mitochondria,

Annu. Rev. Biochem 76, 723-749 (2007).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

65

57. M. Korkhov V., Sachse C. M. Short J. and G. Tate C, Three-Dimensional

Structure of TspO by Electron Cryomicroscopy of Helical Crystals, Cell Structure

18, 677-687 (2010).

58. Yeliseev A.A and Kaplan S., A sensory transducer homologous to the mammalian

peripheral-type benzodiazepine receptor regulates photosynthetic membrane

complex formation in Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. J. Bio. Chem. 270, 21167-

21175 (1995).

59. Yeliseev A.A and Kaplan S., TspO of rhodobacter sphaeroides, A structural and

functional model for the mammalian peripheral benzodiazepine receptor, J. Bio.

Chem. 275, 5657-5667 (2000).

60. Joseph-Liauzun E., Delmas P., Shire D. and Ferrara P., Topological analysis of

the peripheral benzodiazepine receptor in yeast mitochondrial membranes

supports a five-transmembrane structure, J. Bio Chem 273, 2146-2152 (1998).

61. McEnery, M. W., Snowman, A. M., Trifiletti, R. R. & Snyder, S. H. Isolation of

the mitochondrial benzodiazepine receptor: association with the voltagedependent

anion channel and the adenine nucleotide carrier. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89,

3170–3174 (1992).

62. Garnier, M. et al. In vitro reconstitution of a functional peripheral-type

benzodiazepine receptor from mouse Leydig tumor cells. Mol. Pharmacol. 45,

201–211 (1994).

63. Veenman, L., Shandalov, Y. & Gavish, M. VDAC activation by the 18 kDa

translocator protein (TSPO), implications for apoptosis. J. Bioenerg. Biomembr.

40, 199–205 (2008).

64. Delavoie, F. et al. In vivo and in vitro peripheral-type benzodiazepine receptor

polymerization: functional significance in drug ligand and cholesterol binding.

Biochemistry 42, 4506–4519 (2003).

65. Li H. and Papadopoulos V., Peripheral type benzodiazepine recptor function in

cholesterol transport. Identification of a putative cholesterol recongnition/

interaction amino acid sequence and consensus pattern, Endocrinology 139,

4991-4997 (1998).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

66

66. Lacapere J.J. et al., Structural and functional study of reconstituted peripheral

benzodiazepine receptor, Biochem. Biophys. Res. Commun. 284, 538-541 (2001).

67. Decaudin D., Peripheral benzodiazepine receptor and its clinical targeting,

Anticancer Drugs 15, 737-745 (2004).

68. Verma A. and Snyder S.H., Characterization of porphyrin interactions with

peripheral type benzodiazepine receptors, Mol Pharmacol. 34, 800-805 (1988).

69. Lacpere J.J. and Papadopoulos V., Peripheral-type benzodiazepine receptor:

structure and function of a cholesterol-binding protein in steroid and bile acid

biosynthesis, Steroids 68, 569-585 (2003).

70. Scarf, A.M., Ittner L.M. and Kassiou M., The translocator protein (18kDa):

central nervous system disease and drug design, J Med Chem. 52, 581-592 (2009).

71. Costa, E. & Guidotti, A. Diazepam binding inhibitor (DBI): a peptide with

multiple biological actions. Life Sci. 49, 325–344 (1991).

72. Li, H., Yao, Z., Degenhardt, B., Teper, G. & Papadopoulos, V. Cholesterol

binding at the cholesterol recognition/ interaction amino acid consensus (CRAC)

of the peripheral-type benzodiazepine receptor and inhibition of steroidogenesis

by an HIV TAT-CRAC peptide. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 1267–1272

(2001).

73. Farges, R. et al. Site-directed mutagenesis of the peripheral benzodiazepine

receptor: identification of amino acids implicated in the binding site of Ro5- 4864

Mol. Pharmacol. 46, 1160–1167 (1994).

74. Anzini, M. et al. Mapping and fitting the peripheral benzodiazepine receptor

binding site by carboxamide derivatives. Comparison of different approaches to

quantitative ligand–receptor interaction modeling. J. Med. Chem. 44, 1134–1150

(2001).

75. Garnier M. et al., Diazepam binding inhibitor is a paracrine/autocrine regulator of

Leydig cell proliferation and steroidogenesis: action via peripheral-type

benzodiazepine receptor and independent mechanisms, Endocrinology 132, 444-

458 (1993).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

67

76. Gummadi S.N., Hrafnsdottir S., Walent J., Watkins W.E and Menon A.K.,

Reconstitution and assay of biogenic membrane-derived phospholipid flippase

activity in proteoliposomes, Methods Mol Biol 228, 271-279 (2003).

77. Laemmli U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4, Nature 227, 680-685 (1970).

78. Carmel I. et al., Periperal-type benzodiazepine receptors in the regulation of

proliferation of MCF-7 human breast carcinoma cell line, Biochem Pharmacol.

58, 273-278 (1999).

79. Levin E. et al, The peripheral-type benzodiazepine receptor and tumorigenicity:

isoquinoline binding protein (IBP) antisense knockdown in C6 glioma cell line,

Biochemistry 44, 9924-9935 (2005).

80. Veenman L. et al., Peripheral-type benzodiazepine receptor density and in vitro

tumorigenicity of glioma cell limes, Biochem Pharmacol. 68, 689-698 (2004).

81. Weizman R., Burgin R. and Gavish M., Modulatory effect of antidepressants on

peripheral-type benzodiazepine receptor, Eur. J Pharmacol. 250, 289-294 (1993).

82. Ostermeier C. and Michel H., Crystallization of membrane proteins, Current

Opinion in structural biology 7, 697-701 (1997).

83. S. J. Mather. et al, Current Directions in Radiopharmaceutical Research and

Development, Developments in Nuclear Medicine 30, 169-179 (1996).

84. Gavish M. and Fares F., Solubilization of peripheral Benzodiazepine-binding

Sites from Rat Kidney, J. of Neuroscience 5, 2889-2893 (1985).

85. Awad M. and Gavish M., Solubilization of peripheral Benzodiazepine-binding

Sites from Cat Cerebral Cortex, J. of Neurochemistry 52, 1880-1885 (1989).

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

68

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

69

bacterial source. Over-expression of a bacterial protein inside a bacterial membrane

might result in more stable protein, which may produce higher quality crystals. These

directions may provide future insight into the TSPO structure and function.

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

70

stabilize it. In addition we would like to be able to preserve its structure and activity

without causing denaturation. We screened a variety of detergents that known from the

literature as gentle detergents that do not cause denaturation of proteins. The goal was to

find the most ideal detergent concentration suitable to dissolve bacterial membranes as

much as possible. After separating the membranes from the rest of the contents of cell,

we finally managed to bring out the protein and stabilized it in aqueous solution without

causing denaturation with the uncharged detergent, DDM (dodecyl β-D-maltoside) at a

concentration of 4%. After the purification step, we received a relatively large amount of

protein with high level of purity and homogeneity that enabled us to crystallize the

TSPO.

It was found that TSPO is able to bind with high affinity not only endogenous ligand

cholesterol, but also a synthetic ligand, PK11195. This synthetic ligand was used as a

substrate of TSPO to perform the activity tests. It was showed that the affinity of

recombinant TSPO for the ligand is approximately 1nM, both when the protein is inside a

lipid membrane or a liposome, and this affinity is similar to that of the native protein. In

addition, it appears from the activity assays that the Bmax values of the recombinant

protein are similar to those of the native protein.

In attempts to determine the three dimensional structure of TSPO, the protein was set up

for crystallization using the vapor diffusion method, in sitting drops. Crystals were

obtained after three days, had a soft morphology and diffracted only to a very low

resolutions. Since crystallization of membrane proteins might be significantly affected by

the smallest changes in the chemical environment of the protein during the crystallization

process, a wide screen of different detergents was carried out in order to improve the

crystal lattice, to strengthen interactions within the crystal and produce a more ordered

crystal. As such the screen included a variety of detergents differing in the length of the

carbon chain and the electrical charge of the polar group. Additionally changes in micelle

size can affect the quality of crystal packing by changing the arrangement and the ratio

between the protein and detergent in the crystalline lattice. We succeeded in slightly

improving the crystal morphology however the diffraction pattern produced by these

crystals was still not of high enough quality to provide structural information. An

interesting phenomena was observed during crystallization trials aimed at co-crystallizing

TSPO with the synthetic ligand PK11195. When the ligand was added to the protein prior

to crystallization, the protein precipitated and no crystals were obtained and when the

ligand was added to already formed TSPO crystals, the crystals immediately dissolved.

These results may indicate that the active site of TSPO in the crystalline lattice is exposed

to the surface, making it accessible to the ligand. Unfortunately, we did not succeed in

showing that TSPO is also active in solution.

The future plans of this project are to improve the stability and morphology of TSPO

crystals by further screening detergents combinations which may produce a more ordered

crystal lattice. We are also planning to clone a homologous protein to TSPO from a

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

71

Abstract

Proteins are the essential building blocks of living cells and they carry out a wide range

of important biochemical roles that support our existence. Proteins function in cells by

interactions with other macro molecules and a variety of small molecules that act as

protein ligands. The three dimensional structure of a protein dictates its activity, and

disturbing protein structure affects its functionality causing subsequent pathogenic

effects. Understanding pathogenic processes depends largely on our ability to define a

proteins involvement and participation in biochemical processes. Determining the three

dimensional structures of proteins involved in biochemical processes in general and in

particular pathogenic processes can significantly aid in understanding the function of

these proteins. Structure function investigation of proteins also supports rational drug

design aimed at inhibition and prevention of pathogenic process. One of the main

methods used to determine the three dimensional structure of protein at atomic resolution

is X-ray crystallography.

In this thesis we present research which in future might be used for structure-based drug

development. This research was carried out on a protein called TSPO (trans-locator

protein) – 18kDa in size. The protein is trans- membrane, located mainly in the outer

membrane of mitochondria. TSPO is part of a large protein complex known as PTP

(permeability transition pore). Apparently, the main role of TSPO is to move cholesterol

through the mitochondrial outer membrane to the inner membrane. This movement is the

bottleneck in the bio-synthesis of steroids and neuro-steroids. Biochemical and

pharmacological studies have shown that TSPO is also involved in various pathogenic

processes such as cancer and neurological and psychiatric disorders. To date there is very

limited information about the function and the structure of the TSPO protein. The current

model of TSPO is very general, and does not allow significant structural understanding of

the activity of this important protein. Understanding the interactions between the ligand

and TSPO might be crucial for designing new drugs to treat the neurological and

psychiatric disorders which are mentioned above. X-ray crystallography can potentially

provide a detailed description of the atomic structure of the protein, and suggest a more

precise mechanism for activity.

As a membrane protein TSPO is very hydrophobic and so expression, isolation,

purification and crystallization are very challenging. This research has focused on

overcoming these challenges without affecting protein structure and activity. The gene of

a mammalian TSPO was cloned into the pET20b vector with a 6xHis tag at the C

terminal, and over expressed in E. coli C41 cells, which are effective in over-expression

of membrane proteins. A large quantity of a recombinant membrane protein was obtained

and purified using a nickel affinity chromatography.

One of the challenges of isolation and purification process is the hydrophobic nature of

membrane protein TSPO. To extract the protein from the membrane of E. coli, we had to

choose suitable detergents that are able to dissolve the membrane, extract the protein and

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

72

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

73

Fig 19: MS analysis of sample of isolated TSPO…………….………………………….37

Fig 20: TSPO crystals which were obtained by sitting drop vapor diffusion method.…..38

Fig 21: MS analysis of TSPO crystals………………………………………...…………39

Fig 22: Diffraction pattern of TSPO crystals at ID 14I, ESRG, Gernoble, France…...…39

Fig 23: Types of arrays of membrane protein crystals…………………………………..41

Fig 24: TSPO crystals which were obtained by sitting drop vapor diffusion method…..43

Fig 25: pattern of TSPO crystals at ID 23-2, ESRG, Gernoble, France…………………44

Fig 26: TSPO binding characteristics of…………………………………………………47

reconstituted TSPO inside E. coli membrane

Fig 27: proteo-liposomes system…………………………...……………………………49

Fig 28: TSPO binding characteristics in…………………………………………………49

Fig 20: Types of arrays of membrane protein crystals…………………………………..39

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

74

List of Figures

Fig 1: Amino acids sequence alignment of TSPO from Human and Rat…………………4

Fig 2: Cartoon of the predicted topology………………………………………………….6

of R. sphaeroides TspO based on hydropathy analysis

Fig 3: Grayscale Density Slices of the TspO 3D Reconstruction…………………………6

Fig 4: Interpretation of the Experimental Density Map…………...………………………6

Fig 5: Mitochondrial localization of TSPO in the outer mitochondrial membrane……….7

Fig 6: Electrostatic potential of the mouse TSPO three-dimensional model………..…….7

Fig 7: Various ligands of TSPO………………………………………………………….11

Fig 8: Crystallization phase diagram…………………………………………………….13

Fig 9: Vapour-diffusion set up explained in terms of phase diagram……………………15

Fig 10: Vapour-diffusion technique- sitting drop………………………………………..15

Fig 11: Solubilization of membranes by detergents……………………………………..20

Fig 12: Cartoon representation of the events taking place……………………...……….21

during solubilization of proteins from membrane

Fig 13: Cartoon that describes the various steps…………………….………...………...23

in measuring receptor-ligand interactions

Fig 14: Saturation isotherm for the binding of increasing concentrations……………….24

of radioactive ligand to receptor

Fig 15: Scatchard plot……………..……………………………………………………..24

Fig 16: The tendency of a detergent to denature membrane proteins……………………35

Fig 17: Molecular structure of detergents………………………………………………..36

Fig 18: SDS-PAGE of TSPO purification……………………………………………….36

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

75

List of Tables

Table 1: Changes in TSPO expression patterns in the nervous system…………....……10

Table 2: Summary of the TSPO clones…………………………………………………33

Table 3: Summary of detergents features used to dissolve and stabilize TSPO…….….37

Table 4: TSPO purification procedure……………………………………………...…...37

Table 5: Various detergents used for improving attempt of the TSPO crystals………....44

Table 6: Values of Bmax and Kd of native protein……………………………….……..50

as it exists in various mouse tissuescompared with the experimental values

of cloned TSPO in E. coli membrane and as proteo-liposome

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

76

Crystallization solutions…………………………………………………………………82

Materials for protein reconstitution into liposomes………………...……………………82

Methods………………………………………………………………………….…….82

Over-expression of recombinant TSPO………………………………………………….82

Membrane Extraction from E. coli………………………………………………………82

Isolation and purification of recombinant TSPO………………………………………...03

TSPO crystallization………………………………..……………………………………03

Sodium dodecyl sulfat polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)………...….…30

Determination of protein concentration………………………………………………….31

Reconstitution of TSPO into proteoliposomes………………..…………………………31

Binding assay of TSPO to [3H]PK11195…………………….………………………….31

Crystal storage and transportation……………………………………………………….32

Bioinformatics program- MUSCLE……………………………………………………..32

Results and Discussion……………………………………………………….…….33

Subcloning the gene encoding the TSPO protein from R.norvegicus…………...………33

Over-expression of recombinant TSPO………………………………………………….34

Identification of TSPO by mass spectrometry…………………....………………….…..38

Crystallization of TSPO………………………………………………………………….39

Functional analysis of TSPO…………………………………………………………….47

Summary........................................................................................................................53

Appendix- Summary of crystallization trials for the TSPO protein……54

References......................................................................................................................60

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

77

Table of Contents

Abstract………………………………………………………………………...….……1

Introduction- The mitochondrial TSPO receptor……………….…........……4

Structure and organization…………………………………………...……………………4

Distribution, function and physiological role……………………..………………....……8

TSPO ligands……………………………………………………….…...……….………10

Principles of crystallization…………………………………....………….………11

Protein crystallization…………………………………………………………...……….13

Crystallization technique…………………………………………...……………………14

Principles of X-ray crystallography………………………………….…...…….61

The challenges in purification and crystallization of membrane protein…....61

Detergents……………………………………………………………………...……..62

Binding assay………………………………………………….………………..……86

The motivation to explore TSPO structure......................................................80

using X-ray crystallography

Research Goal.............................................................................................................80

Materials and Methods............................................................................................81

General materials…………………………………...………………………………...…81

Materials for Over-Expression of recombinant protein………………...……………….81

Materials for membrane Extraction………………………….………………….………81

Materials for protein isolation and purification from membranes………………………81

Materials for SDS-PAGE………………...……………………………………….……..81

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

78

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

79

The research thesis was done under the supervision of

Prof. Noam Adir in the Shulich Faculty of Chemistry

The Generous Financial Help of the Technion is Gratefully Acknowledged

Special thanks to Prof. Noam Adir

for his guidance, assistance and support

I would also like to thank for the cooperation with:

Prof. Moshe Gavish

Dr. Svetlana Leschiner

Amnon Harel's laboratory team

The Proteomics Center team at the Technion

European particle accelerator staff in Grenoble, France

And with all of Prof. Noam Adir laboratory team

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

80

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

81

Structural and functional investigation

of the mitochondrial TSPO receptor

Research thesis submitted in Partial Fulfillment of the

Requirement for the degree of Master of Science in Chemistry

Yigal Linkovsky

Submitted to Senate of

The Technion – Israel Institute of Technology

AV, 5772 HAIFA JULY 2012

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

82

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary

83

Structural and functional investigation

of the mitochondrial TSPO receptor

Yigal Linkovsky

© T

echn

ion

- Isr

ael I

nstit

ute

of T

echn

olog

y, E

lyac

har C

entra

l Lib

rary