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Bull. Fr. Pêche Piscic. (1998) 350-351 :597-607 — 5 9 7 —

DISTRIBUTION OF GLUCOCORTICOID RECEPTORS IN THE BRAIN OF RAINBOW TROUT (ONCORHYNCHUS MYKISS) :

POSSIBLE RELATIONSHIPS WITH THE NEUROENDOCRINE SYSTEMS CONTROLLING REPRODUCTION.

C.A.TEITSMA, I. ANGLADE,T. BAILHACHE, M.TUJAGUE, G.TOUTIRAIS, B. DUCOURET and O. KAH

E n d o c r i n o l o g i e Moléculaire d e la R e p r o d u c t i o n , C N R S U P R E S - A 6 0 2 6 , C a m p u s d e B e a u l i e u , 3 5 0 4 2 R e n n e s C e d e x , F r a n c e .

ABSTRACT

T h e d i s t r i b u t i o n o f t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r ( G R ) w i t h i n t h e f o r e b r a i n of r a i n b o w t r o u t h a s b e e n s t u d i e d b y m e a n s of in situ h y b r i d i z a t i o n ( I S H ) a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( I C C ) u s i n g p r o b e s a n d a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t t h e A B - d o m a i n o f t h e r a i n b o w t rou t G R ( r t G R ) .

B o t h r t G R m R N A a n d p r o t e i n e x h i b i t e d t h e s a m e p a t t e r n o f d i s t r i b u t i o n . A s t r o n g l a b e l l i n g w a s o b s e r v e d in a i l s u b d i v i s i o n s o f t h e p r e o p t i c n u c l e u s , in t h e t h a l a m i c région a n d in t h e m e d i o b a s a l h y p o t h a l a m u s ( n u c l e u s r e c e s s u s l a t e r a l i s , n u c l e u s l a te ra l i s t u b e r i s ) . It w a s n o t a b l y f o u n d t h a t a i l m a g n o c e l l u l a r n e u r o n s o f t h e n u c l e u s p r e o p t i c u s p a r s m a g n o c e l l u l a r i s ( N P O m c ) w e r e p o s i t i v e w i t h b o t h I S H a n d I C C . F u r t h e r m o r e , n u m e r o u s c e l l s o f t h e a n t e r i o r l o b e of t h e p i t u i t a r y w e r e p o s i t i v e l y s t a i n e d .

D o u b l e s t a i n i n g s t u d i e s a l l o w e d t o i d e n t i f y p a r t o f t h e r t G R e x p r e s s i n g c e l l s . A t t h e t e l e n c e p h a l i c l e v e l , it w a s f o u n d t h a t G n R H n e u r o n s f r e q u e n t l y e x p r e s s r t G R in v i t e l l o g e n i c f e m a l e s . V i r t u a l l y a i l t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( T H ) c e l l s in t h e a n t e r o v e n t r a l p a r t o f t h e p r e o p t i c n u c l e u s ( N P O a v ) w e r e r t G R - p o s i t i v e . In t h i s s a m e a r e a , a c o l o c a l i z a t i o n b e t w e e n r a i n b o w t r o u t e s t r a d i o l r e c e p t o r ( r t E R ) a n d T H h a s a l r e a d y b e e n d o c u m e n t e d , i n d i r e c t l y d e m o n s t r a t i n g t h a t r t E R a n d r t G R a r e c o l o c a l i z e d . T h e s a m e h o l d s t r u e f o r t h e G T H - I I c e l l s of t h e a n t e r i o r p i t u i t a r y w h i c h e x p r e s s b o t h t y p e s o f r e c e p t o r s .

Thèse r e s u l t s p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n t h e p o t e n t i a l s i t e s of c o r t i s o l a c t i o n o n t h e r e p r o d u c t i v e a x i s d i r e c t l y a t t h e p i t u i t a r y l eve l o r i n d i r e c t l y o n n e u r o e n d o c r i n e S y s t e m s c o n t r o l l i n g G T H - I I sécrétion, p o s s i b l y v i a G R - E R i n t e r a c t i o n s .

DISTRIBUTION DES RÉCEPTEURS AUX GLUCOCORTICOÏDES DANS LE CERVEAU DE LA TRUITE ARC-EN-CIEL (ONCORHYNCHUS MYKISS) :

RELATIONS POSSIBLES AVEC LES SYSTÈMES NEUROENDOCRINIENS CONTRÔLANT LA REPRODUCTION.

RÉSUMÉ

L a d i s t r i b u t i o n d u récepteur a u x glucocorticoïdes ( G R ) d a n s le c e r v e a u d e la t r u i t e a r c - e n - c i e l a été étudiée p a r l e s t e c h n i q u e s d ' h y b r i d a t i o n in situ ( H I S ) e t d ' i m m u n o c y t o c h i m i e ( I C C ) u t i l i s a n t d e s s o n d e s e t d e s a n t i c o r p s dirigés c o n t r e le d o m a i n e A B d u G R d e t r u i t e ( r t G R ) .

L e s s i t e s d ' e x p r e s s i o n d e l ' A R N m e t d e la protéine r t G R s o n t très s i m i l a i r e s . L e s d e u x méthodes o n t p e r m i s d e m e t t r e e n évidence u n m a r q u a g e a u n i v e a u d e s différentes s o u s -d i v i s i o n s d u n o y a u préoptique ( N P O ) , e n p a r t i c u l i e r a u n i v e a u d e s n e u r o n e s

Article available at http://www.kmae-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/kmae:1998028

http://www.kmae-journal.org

http://dx.doi.org/10.1051/kmae:1998028


m a g n o c e l l u l a i r e s ( N P O m c ) . U n f o r t m a r q u a g e a également été observé a u n i v e a u d u t h a l a m u s e t d e l ' h y p o t h a l a m u s médiobasal ( n u c l e u s r e c e s s u s l a te ra l i s , n u c l e u s l a t e ra l i s t u b e r i s ) . D e n o m b r e u s e s c e l l u l e s d u l o b e antérieur d e l ' h y p o p h y s e e x p r i m e n t également le r t G R .

D e s études d e d o u b l e m a r q u a g e e n I C C ont p e r m i s d ' i den t i f i e r la n a t u r e d e s c e l l u l e s e x p r i m a n t le r t G R . L e s c e l l u l e s à T H ( t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ) situées d a n s la p a r t i e antéroventrale d u N P O ( N P O a v ) , où n o u s a v i o n s précédemment détecté u n e f o r t e e x p r e s s i o n d u récepteur à l ' o e s t r a d i o l d e la t r u i t e ( r t E R ) , e x p r i m e n t le r t G R . C e t t e c o l o c a l i s a t i o n apparaît d ' a u t a n t p l u s i m p o r t a n t e q u e le r t G R e t l e r t E R s o n t exprimés p a r l e s mêmes c e l l u l e s d a n s le N P O a v . E n c e q u i c o n c e r n e l 'axe g o n a d o t r o p e , c e r t a i n s n e u r o n e s à G n R H d u télencéphale v e n t r a l a i n s i q u e d e s ce l l u l es à G T H - I I d e l ' h y p o p h y s e o n t été m i s e n évidence c o m m e étant p o s i t i f s p o u r le r t G R . D e p l u s , il e x i s t e également u n e c o l o c a l i s a t i o n r t G R / r t E R d a n s c e s c e l l u l e s à G T H - I I .

C e s résultats a p p o r t e n t d e s i n f o r m a t i o n s s u r les s i t es d ' a c t i o n d u c o r t i s o l le l o n g d e l ' a xe r e p r o d u c t e u r , i n d i q u a n t q u e c e t t e h o r m o n e p o u r r a i t a g i r d i r e c t e m e n t a u n i v e a u h y p o p h y s a i r e o u a u n i v e a u d e systèmes n e u r o e n d o c r i n i e n s c e n t r a u x contrôlant l a sécrétion d e G T H - I I . P a r a i l l e u r s , c e s modalités d ' a c t i o n s p o u r r a i e n t m e t t r e e n j e u d e s i n t e r a c t i o n s G R - E R .

INTRODUCTION

In v e r t e b r a t e s , s t r e s s h a s a n e f f e c t o n m a n y f u n c t i o n s , in p a r t i c u l a r i m m u n i t y , g r o w t h a n d r e p r o d u c t i o n ( W A L K E R et al., 1 9 9 7 ) . T h e s t r e s s r e s p o n s e s a r e m e d i a t e d b y c o r t i c o s t e r o i d s , w h i c h b i n d t o spécifie n u c l e a r r e c e p t o r s ( F U N D E R , 1 9 9 2 ) . C o r t i c o s t e r o i d s c a n b e d i v i d e d i n t o t w o t y p e s : t y p e I, t h e m i n e r a l o c o r t i c o i d s a n d t y p e I I , t h e g l u c o c o r t i c o i d s ( J O E L S a n d D E K L O E T , 1 9 9 4 ) . In f i s h , h o w e v e r , it h a s g e n e r a l l y b e e n a c c e p t e d t h a t b o t h t y p e s o f f u n c t i o n s a r e e x e r t e d b y t h e g l u c o c o r t i c o i d c o r t i s o l . E a c h c o r t i c o s t e r o i d b i n d s t o i ts o w n r e c e p t o r c l a s s : m i n e r a l o c o r t i c o i d r e c e p t o r s ( M R ) o r g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s ( G R ) . N e v e r t h e l e s s , c o r t i c o s t e r o n e c a n b i n d t o b o t h t y p e s of r e c e p t o r s a c c o r d i n g t o t h e c i r c u m s t a n c e s ( D E K L O E T et al., 1 9 8 7 ) .

In s a l m o n i d s , t h e e f f e c t s o f s t r e s s on r e p r o d u c t i o n h a v e b e e n l a r g e l y s t u d i e d . E x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t (Oncorhynchus mykiss) to i n c i d e n c e s o f a c u t e s t r e s s d u r i n g r e p r o d u c t i v e d e v e l o p m e n t r e s u l t s in d e l a y e d o v u l a t i o n a n d r e d u c e d e g g s i z e in f e m a l e s , s i g n i f i c a n t l y l o w e r s p e r m c o u n t s in m a i e s a n d , c o n c e r n i n g t h e p r o g e n y o f thèse f i s h , s i g n i f i c a n t l y l o w e r s u r v i v a l r a t e s c o m p a r e d t o p r o g e n y f r o m u n s t r e s s e d c o n t r o l f i sh ( C A M P B E L L et al., 1 9 9 2 ) . A l s o f e m a l e b r o o k t r o u t e x p o s e d t o a c i d s t r e s s h a v e a d e l a y e d o v u l a t i o n ( T A M a n d P A Y S O N , 1 9 8 6 ; M O U N T et al., 1 9 8 8 ) . R e d u c e d e g g s i z e c o u l d b e d u e t o i m p a i r e d v i t e l l o g e n i n p r o d u c t i o n a n d u p t a k e , a s it h a s b e e n s h o w n t h a t r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a c i d s t r e s s h a v e l o w e r p l a s m a l eve l s o f v i t e l l o g e n i n ( R O Y et al., 1 9 9 0 ) . F u r t h e r m o r e , a c i d s t r e s s in b r o o k t r o u t r esu l t s in a d v e r s e e f f e c t s o n c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m a n d l iver p h y s i o l o g y r e d u c i n g t he l i ve r ab i l i t y t o m e t a b o l i z e c a r b o h y d r a t e s a n d s y n t h e s i z e v i t e l l o g e n i n ( T A M et al., 1 9 8 7 ) . S u b l e t h a l e x p o s u r e of A t l a n t i c s a l m o n t o c y a n i d e i n h i b i t s y o l k déposition b y s u p p r e s s i n g u p t a k e a t t h e o v a r i a n leve l ( R U B Y et al., 1 9 8 7 ) . It is d i f f i cu l t t o e x p l a i n t h e e f f e c t s o f a c i d s t r e s s on v i t e l l o g e n i n l e v e l s a n d s y n t h e s i s , b e c a u s e in b o t h r a i n b o w t r o u t ( W E I N E R et al., 1 9 8 6 ) a n d b r o o k t r o u t ( T A M a n d P A Y S O N , 1 9 8 6 ) n o s i g n i f i c a n t c h a n g e in e s t r a d i o l l e v e l s h a s b e e n r e p o r t e d . It is t h e r e f o r e p o s s i b l e t ha t i m p a i r m e n t t a k e s p l a c e a t a h i g h e r l eve l of t h e r e p r o d u c t i v e a x i s a s , f o r i n s t a n c e , l o w p H s u p p r e s s e s g o n a d o t r o p i n ( G T H ) sécrétion in b r o o k t r o u t ( T A M et al., 1 9 9 0 ) . R a i n b o w t r o u t s u b j e c t e d t o e m e r s i o n s t r e s s h a v e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p l a s m a c o r t i s o l l e v e l s t h a n u n s t r e s s e d c o n t r o l f i s h ( C A M P B E L L et al., 1 9 9 2 ) . A l s o b r o w n t r o u t , w h i c h u n d e r w e n t a c u t e h a n d l i n g s t r e s s , s h o w a r i se in c o r t i s o l leve ls 1-2 h o u r s p o s t - s t r e s s ( P I C K E R I N G et al., 1 9 8 2 ) . Thèse r e s u l t s i n d i c a t e t h a t e f f e c t s of s t r e s s in s a l m o n i d s a r e , a t l e a s t in pa r t , m e d i a t e d b y c o r t i s o l . I n d e e d , évidence ex is ts t h a t e x o g e n o u s c o r t i s o l p r o d u c e s i n h i b i t o r y

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e f f e c t s o n r e p r o d u c t i o n s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d in f i s h e x p o s e d t o s t r e s s , f o r i n s t a n c e in t r o u t ( C A R R A G H E R et al., 1 9 8 9 ; P O T T I N G E R et al., 1 9 9 1 ) . S e x u a l l y m a t u r i n g m a i e a n d f e m a l e b r o w n t r o u t h a v e s m a l l e r g o n a d s , r e d u c e d p l a s m a l eve l s o f g o n a d a l s t e r o i d s a n d a l o w e r p i t u i t a r y G T H c o n t e n t a f t e r c o r t i s o l i m p l a n t a t i o n ( C A R R A G H E R et al., 1 9 8 9 ) . C o r t i s o l t r e a t m e n t o f m a t u r i n g m a i e r a i n b o w t r o u t s i g n i f i c a n t l y s u p p r e s s e d p l a s m a G T H l e v e l s ( C A R R A G H E R et al., 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , a i l thèse d a t a a b o u t t h e e f f e c t s o f s t r e s s o n r e p r o d u c t i o n d o n o t p r o v i d e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e p o s s i b l e t a r g e t s i t e s o f c o r t i s o l a t t h e r e p r o d u c t i v e a x i s . In a d d i t i o n , it h a s b e e n s h o w n i n s e v e r a l t e l e o s t s t h a t c o r t i s o l d o e s n o t a f f e c t o v a r i a n s t e r o i d o g e n e s i s ( P A N K H U R S T et al., 1 9 9 5 ) , f u r t h e r i n d i c a t i n g tha t h i g h e r l e v e l s o f t h e r e p r o d u c t i v e a x i s a r e a f f e c t e d b y s t r e s s .

T h e c l o n i n g o f t h e r a i n b o w t r o u t g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r ( r t G R ) ( D U C O U R E T et al., 1 9 9 5 ) m a d e it p o s s i b l e t o s t u d y t h e d i s t r i b u t i o n of t h e r t G R a n d t h e r e f o r e t o iden t i f y t h e p o s s i b l e t a r g e t s i t e s o f c o r t i s o l a c t i o n . T h e d i s t r i b u t i o n o f r t G R m R N A c a n b e d e t e r m i n e d b y m e a n s o f in situ h y b r i d i z a t i o n a n d t h a t o f r t G R p r o t e i n b y m e a n s of i m m u n o c y t o c h e m i s t r y . P r e v i o u s e x p e r i m e n t s , u s i n g a p r o b e a g a i n s t r t G R i n N o r t h e r n b lo t a n a l y s i s , a l l o w e d t h e détection o f a s i n g l e m R N A s p e c i e s of 7 . 5 k b o u t o f p o l y A * m R N A p r e p a r e d f r o m a n t e r i o r r a i n b o w t r o u t b r a i n ( T E I T S M A et al., 1 9 9 7 ) . A s t u d y p e r f o r m e d b y K N O E B L et al. ( 1 9 9 6 ) a l r e a d y d e m o n s t r a t e d a s i n g l e c l a s s o f h i gh -a f f i n i t y , l o w c a p a c i t y g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s in t h e b r a i n o f C h i n o o k s a l m o n (Oncorhynchus tshawytscha). B i n d i n g a n d d i s p l a c e m e n t s t u d i e s f o r t h e G R s of r a i n b o w t r o u t ( D U C O U R E T et al., 1 9 9 5 ) a n d C h i n o o k s a l m o n ( K N O E B L et al., 1 9 9 6 ) s h o w e d t h a t t h e r e c e p t o r s o f b o t h s p e c i e s h a v e a h i g h a f f in i t y f o r d e x a m e t h a s o n e a n d c o r t i s o l , d e m o n s t r a t i n g t h a t thèse a r e t r u e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s .

G l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s a c t a s l i g a n d dépendent t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s a n d a r e t h e r e f o r e a b l e t o r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f t a r g e t gènes ( E V A N S a n d A R R I Z A , 1 9 8 9 ) . F o r t h i s r e a s o n , i d e n t i f i c a t i o n o f t h e p h e n o t y p e o f t h e c e l l s e x p r e s s i n g t h e r t G R w i l l p r o v i d e a f i rs t i n d i c a t i o n a b o u t t h e n a t u r e o f t h e p o s s i b l e gènes i n v o l v e d in c o r t i s o l a c t i o n . To s t u d y t h e n a t u r e o f t h e r t G R e x p r e s s i n g n e u r o n s , w e u s e d d o u b l e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l r e a c t i o n s a n d w e f o c u s e d o u r a t t e n t i o n o n t h e c e l l s i m p l i c a t e d in t h e c o n t r o l of t h e r e p r o d u c t i v e a x i s : G n R H ( g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e ) a n d d o p a m i n e n e u r o n s , a n d t h e G T H - I I ( g o n a d o t r o p i c h o r m o n e - l l ) c e l l s o f t h e p i tu i t a ry . W e a l s o l o o k e d a t t h e p o s s i b l e c o e x i s t e n c e of r t G R a n d r t E R ( r a i n b o w t r o u t e s t r a d i o l r e c e p t o r ) .

MATERIAL AND METHODS

Animais

T h e r a i n b o w t r o u t (Oncorhynchus mykiss) u s e d , w e r e s u p p l i e d b y t h e I N R A f i s h f a r m ( L e D r e n n e c , Finistère, F r a n c e ) a n d k e p t in t h e l a b o r a t o r y in a r e c i r c u l a t i n g w a t e r S y s t e m a t 1 2 - 1 5 °C u n d e r a n a r t i f i c i a l l i gh t régime m i m i c k i n g t h e n a t u r a l p h o t o p e r i o d . T h e a n i m a i s w e r e f e d a t r o u t d i e t ad libitum. O n l y f e m a l e t r o u t a t différent v i t e l l o g e n i c s t a g e s h a v e b e e n u s e d .

In situ hybridization

T h e m e t h o d f o r in situ h y b r i d i z a t i o n u s e d h a s b e e n d e t a i l e d in T E I T S M A et al. ( 1 9 9 7 ) .

B r ie f l y , r a d i o a c t i v e sensé a n d a n t i s e n s e p r o b e s h a v e b e e n s y n t h e s i z e d , d i r e c t e d a g a i n s t t h e A B - d o m a i n s , r e s p o n s i b l e fo r t r a n s a c t i v a t i o n , of t h e r a i n b o w t r o u t G R . Trou t b r a i n s w e r e f i x e d b y m e a n s o f p e r f u s i o n w i t h 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e ( in 0 .1 M p h o s p h a t e bu f fe r ) a n d t h e n e m b e d d e d in p a r a f f i n . T h e p a r a f f i n s e c t i o n s o f 6 \im w e r e p r e - t r e a t e d w i t h p r o t e i n a s e K t o p e r m e a b i l i z e t h e m a n d w i t h a c e t i c a n h y d r i d e t o r e d u c e b a c k g r o u n d l a b e l l i n g . T h e n , t h e s e c t i o n s w e r e h y b r i d i z e d w i t h t h e r a d i o a c t i v e p r o b e a t 5 0 °C o v e r n i g h t .

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1998)350-351 : 597-607 — 6 0 0 —

A f t e r i n c u b a t i o n , s e v e r a l w a s h i n g s t e p s w e r e p e r f o r m e d w i t h S S C bu f f e r of différent c o n c e n t r a t i o n s a n d R N A s e in N T E bu f fe r . To v i s u a l i z e t h e s i g n a l , t h e s e c t i o n s w e r e d r i e d a n d c o v e r e d w i t h l l f o r d K 5 n u c l e a r t r a c k e m u l s i o n . A f t e r a u t o r a d i o g r a p h y fo r o n e m o n t h a n d d e v e l o p m e n t o f t h e e m u l s i o n , t h e s l i d e s w e r e c o u n t e r s t a i n e d a n d a n a l y z e d u s i n g a n O l y m p u s P r o v i s p h o t o m i c r o s c o p e . F o r a i l a n i m a i s , s e c t i o n s w e r e a l t e r n a t e l y t r e a t e d w i t h t h e sensé a n d t h e a n t i s e n s e p r o b e t o e n s u r e s p e c i f i c i t y of t h e s i g n a l .

Immunocytochemistry

T w o a n t i b o d i e s , p r o d u c e d in rabb i t a n d g u i n e a p i g a n d d i r e c t e d t o w a r d s t h e N - t e r m i n a l p a r t o f t h e r t G R , w e r e u s e d . T h e i r spec i f i c i t y h a s b e e n c h e c k e d b y W e s t e r n b l o t t i n g ( T U J A G U E et al., 1 9 9 8 ) a n d i m m u n o c y t o c h e m i s t r y f o l l o w i n g p r e i n c u b a t i o n w i t h t h e a n t i g e n ( T E I T S M A et al., in p r e s s ) .

I m m u n o c y t o c h e m i s t r y w a s e x e c u t e d o n f r o z e n s e c t i o n s ( 1 4 u m ) m a d e f r o m t r o u t b r a i n s f i x e d b y p e r f u s i o n w i t h a s o l u t i o n of 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e a n d 0 .2 % p i c r i c a c i d . P r i o r t o i n c u b a t i o n o v e r n i g h t w i t h t h e p r i m a r y a n t i b o d y , t h e s e c t i o n s w e r e p r e - t r e a t e d w i t h 0 . 5 % m i l k p o w d e r in v e r o n a l b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 2 % t r i t o n X - 1 0 0 ( T X ) . A f t e r e x p o s u r e t o t h e p r i m a r y a n t i b o d y , t h e s e c t i o n s w e r e r i n s e d in v e r o n a l bu f f e r c o n t a i n i n g T X a n d i n c u b a t e d w i t h t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t t h e s p e c i e s o f p r o d u c t i o n of t h e p r i m a r y a n t i b o d y . T h i s s e c o n d a r y a n t i b o d y w a s l a b e l l e d w i t h e i t h e r a p e r o x i d a s e o r a f l u o c h r o m e .

In t h e c a s e o f a p e r o x i d a s e c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y , v i s u a l i z a t i o n o c c u r r e d by u s i n g e i t h e r d i a m i n o b e n z i d i n e , r e s u l t i n g in a b r o w n p r e c i p i t a t e , o r t h e g l u c o s e o x i d a s e m e t h o d a c c o r d i n g to S H U et al. ( 1 9 8 8 ) , r e s u l t i n g in a d a r k b l u e p r e c i p i t a t e . F l u o c h r o m e c o u p l e d a n t i b o d i e s c o u l d d i r e c t l y b e a n a l y s e d u s i n g a f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e .

D u r i n g d o u b l e s t a i n i n g , t w o r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d s e q u e n t i a l l y u s i n g différent c h r o m o g e n s o r f l u o r o p h o r e s . W e u s e d r t G R a n t i b o d i e s r a i s e d in g u i n e a p i g s in o r d e r t o r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y o f c r o s s - r e a c t i o n o f t h e s e c o n d a r y a n t i b o d i e s w i t h t h e p r i m a r y a n t i b o d i e s a g a i n s t G n R H , G T H - I I o r r t E R , r a i s e d in rabb i t , a n d t h o s e a g a i n s t T H r a i s e d in m o u s e .

F o r f l u o r e s c e n c e détection o f t h e e s t r a d i o l r e c e p t o r ( r t E R ) , a n a m p l i f i c a t i o n procédure u s i n g b i o t i ny l t y r a m i d e ( D U P O N T , N E N ) h a s b e e n e m p l o y e d .

A n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s : a n t i - r a i n b o w t r o u t g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r ( r t G R ; T U J A G U E et al., in p r e s s ) 1 / 2 0 0 0 , a n t i - s a l m o n g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e ( s G n R H ; N A V A S et al., 1 9 9 5 ) 1 / 1 5 0 0 , a n t i - t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( T H ; L I N A R D et al., 1 9 9 6 ) 1 / 1 0 0 0 , a n t i - g o n a d o t r o p i n - l l ( p - G T H - l l ; B R E T O N et al., 1 9 9 7 ) 1 / 1 0 0 0 , a f f i n i t y - p u r i f i e d a n t i - r a i n b o w t r o u t e s t r a d i o l r e c e p t o r ( r t E R ; N A V A S et al., 1 9 9 5 ) 1 / 5 0 .

RESULTS

In situ hybridization of the rainbow trout glucocorticoid receptor (rtGR)

U s i n g in situ h y b r i d i z a t i o n , a spécifie s i g n a l h a s b e e n o b s e r v e d in t h e f o l l o w i n g régions o f t h e r a i n b o w t r o u t f o r e b r a i n : d o r s a l t e l e n c e p h a l o n , v e n t r a l t e l e n c e p h a l o n p a r s v e n t r a l i s a n d p a r s d o r s a l i s , a i l l e v e l s of t h e p r e o p t i c région, s u p r a c h i a s m a t i c n u c l e u s , t h e m e d i a l n u c l e i o f t h e t h a l a m u s , t h e n u c l e u s l a te ra l i s t u b e r i s , t h e n u c l e u s r e c e s s u s l a te ra l i s , t h e n u c l e u s p o s t e r i o r i s , t h e n u c l e u s s a c c u s v a s c u l o s u s a n d f i na l l y t h e n u c l e u s d i f f u s u s lob i i n f e r i o r i s . Thèse r e s u l t s h a v e b e e n s u m m a r i z e d in F i g u r e 1 . T h e m o s t r e m a r k a b l e s t a i n i n g w a s o b s e r v e d at t h e leve l o f t h e p r e o p t i c n u c l e u s ( N P O ) , w h e r e a i l t h e m a g n o c e l l u l a r n e u r o n s ( N P O m c ) w e r e i n t e n s i v e l y l a b e l l e d . W e a l s o o b s e r v e d a s t r o n g l a b e l l i n g of t h e p e r i v e n t r i c u l a r l aye r o f t h e o p t i c t e c t u m . No I S H h a s b e e n p e r f o r m e d a t t h e leve l of t h e p i t u i t a r y .

Bull. Fr. Pèche Piscic. (1998) 350-351 :597-607 — 601 —

p o s t e r i o r V v

co-existence GR-GnRH

N P O a v

co-existence GR-ER/TH

p p d

co-existence GR-ER/GTH-I

F i g u r e 1

S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e d i s t r i b u t i o n o f r t G R m R N A a n d p r o t e i n

e x p r e s s i n g c e l l s o n a l o n g i t u d i n a l s e c t i o n o f r a i n b o w t r o u t f o r e b r a i n . T h e d e n s i t y

o f t h e s h a d e d a r e a s p r o v i d e s a n e s t i m a t e o f t h e d e n s i t y o f G R - e x p r e s s i n g c e l l s .

B o x e s s h o w t h e r e g i o n s w h e r e c o l o c a l i z a t i o n s h a v e b e e n o b s e r v e d . C C = c o r p u s

c e r e b e l l i ; ER = e s t r a d i o l r e c e p t o r ; G R = g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r ;

G n R H = g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e ; GTH- I I = g o n a d o t r o p i c h o r m o n e - l l ;

M O = m e d u l l a o b l o n g a t a ; N D L I = n u c l e u s d i f f u s u s l o b i i n f e r i o r i s ; N D M = n u c l e u s

d o r s o m e d i a l i s t h a l a m i ; N H = n u c l e u s h a b e n u l a r i s ; N L T p = n u c l e u s l a t e r a l i s

t u b e r i s p a r s p o s t e r i o r i s ; N P O a v = n u c l e u s p r e o p t i c u s p a r s a n t e r o v e n t r a l i s ;

N P O m c = n u c l e u s p r e o p t i c u s p a r s m a g n o c e l l u l a r i s ; N P P v = n u c l e u s p o s t e r i o r i s

p e r i v e n t r i c u l a r i s ; N S C = n u c l e u s s u p r a c h i a s m a t i c u s ; N V M = n u c l e u s

v e n t r o m e d i a l i s t h a l a m i ; O B = o l f a c t o r y b u l b s ; O C = o p t i c c h i a s m a ; O T = o p t i c

t e c t u m ; P C = p o s t e r i o r c o m m i s s u r e ; p p d = p r o x i m a l p a r s d i s t a l i s ; r l = r e c e s s u s

l a t e r a l i s ; r p = r e c e s s u s p o s t e r i o r i s ; Tel = t e l e n c e p h a l o n ; T H = t y r o s i n e

h y d r o x y l a s e ; V C = v a l v u l a c e r e b e l l i ; V d = a r e a v e n t r a l i s t e l e n c e p h a l i p a r s d o r s a l i s

; V v = a r e a v e n t r a l i s t e l e n c e p h a l i p a r s v e n t r a l i s .

F i g u r e 1

R e p r é s e n t a t i o n s c h é m a t i q u e d e la d i s t r i b u t i o n d e s c e l l u l e s e x p r i m a n t l ' A R N m e t la

p ro té ine r t G R s u r u n e c o u p e l o n g i t u d i n a l e d u c e r v e a u an té r ieur d e la t r u i t e a r c - e n -

c i e l . L a dens i té d e s p o i n t s d o n n e u n e e s t i m a t i o n d e la d e n s i t é d e s c e l l u l e s

e x p r i m a n t le G R . L e s c a d r e s m o n t r e n t l e s rég ions o ù u n e c o l o c a l i s a t i o n a é té

o b s e r v é e . C C = c o r p u s c e r e b e l l i ; ER = récep teur à l ' o e s t r a d i o l ; G R = récepteur

a u x g l u c o c o r t i c o ï d e s ; G n R H = g o n a d o l i b é r i n e ; GTH- I I = g o n a d o t r o p i n e - l l ;

M O = m e d u l l a o b l o n g a t a ; N D L I = n u c l e u s d i f f u s u s l o b i i n f e r i o r i s ; N D M = n u c l e u s

d o r s o m e d i a l i s t h a l a m i ; N H = n u c l e u s h a b e n u l a r i s ; N L T p = n u c l e u s l a t e r a l i s

t u b e r i s p a r s p o s t e r i o r i s ; N P O a v = n u c l e u s p r e o p t i c u s p a r s a n t e r o v e n t r a l i s ;

N P O m c = n u c l e u s p r e o p t i c u s p a r s m a g n o c e l l u l a r i s ; N P P v = n u c l e u s p o s t e r i o r i s

p e r i v e n t r i c u l a r i s ; N S C = n u c l e u s s u p r a c h i a s m a t i c u s ; N V M = n u c l e u s

v e n t r o m e d i a l i s t h a l a m i ; O B = b u l b e s o l f a c t i f s ; O C = c h i a s m a o p t i q u e ; O T = t o i t

o p t i q u e ; P C = c o m m i s s u r e p o s t é r i e u r e ; p p d = p r o x i m a l p a r s d i s t a l i s

r l = r e c e s s u s l a t e r a l i s ; r p = r e c e s s u s p o s t e r i o r i s ; Te l = t e l e n c e p h a l o n

T H = t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ; V C = v a l v u l a c e r e b e l l i ; V d = a r e a v e n t r a l i s t e l e n c e p h a l

p a r s d o r s a l i s ; V v = a r e a v e n t r a l i s t e l e n c e p h a l i p a r s v e n t r a l i s .

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1998) 350-351 : 597-607 — 6 0 2 —

Immunocytochemistry of rtGR

T h e a n t i b o d y a n t i - r t G R u s e d , w a s r a i s e d in r a b b i t s b y i n j e c t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n c o u p l e d t o g l u t a t h i o n e - S - t r a n s f e r a s e . V i s u a l i z a t i o n o f t h e a n t i b o d y b y m e a n s of a s e c o n d a r y p e r o x i d a s e c o n j u g a t e d a n t i - r a b b i t a n t i b o d y a n d t h e g l u c o s e o x i d a s e m e t h o d , r e v e a l e d a h i g h l y spécifie s i g n a l , r e s t r i c t e d t o t h e n u c l e i of t h e l a b e l l e d ce l l s . T h i s s i g n a l w a s a b o l i s h e d w h e n t h e r t G R a n t i b o d y w a s p r e i n c u b a t e d w i t h t h e f u s i o n p r o t e i n .

L a b e l l i n g w a s o b s e r v e d in t h e n u c l e i o f t h e s a m e c e l l s a s t h o s e a l r e a d y m e n t i o n e d f o r in situ h y b r i d i z a t i o n ( F i g u r e 1 ) . H o w e v e r , t he leve l o f r e s o l u t i o n w a s m u c h b e t t e r a n d a l l o w e d t o o b t a i n a d e t a i l e d m a p p i n g o f t h e r t G R - p o s i t i v e ce l l s . In a d d i t i o n , n u m e r o u s r t G R - p o s i t i v e c e l l s w e r e a l s o d e t e c t e d in t h e pa rs d i s t a l i s of t h e p i tu i ta ry .

T h e o b s e r v a t i o n of r t G R m R N A a n d p r o t e i n in h y p o p h y s i o t r o p i c a r e a s a n d p i t u i t a r y régions, k n o w n t o b e i n v o l v e d i n r e p r o d u c t i o n , p r o m p t e d u s t o p e r f o r m d o u b l e i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e s in thèse b r a i n a r e a s .

Double immunocytochemistry with rtGR and GnRH, tyrosine hydroxylase, gonadotropin-ll and estradiol receptor

W e f o u n d o u t t h a t t h e b e s t w a y t o p e r f o r m a d o u b l e s t a i n i n g w i t h r t G R a n d G n R H w a s t o u s e t h e t e c h n i q u e fo r r t G R a s u s e d d u r i n g t h e m a p p i n g a n d t o u s e f o r G n R H a s e c o n d a r y a n t i b o d y c a r r y i n g a f l u o c h r o m e . In t h i s way , w e o b s e r v e d t h a t a t t h e l eve l of t h e p o s t e r i o r p a r t o f t h e v e n t r a l t e l e n c e p h a l o n p a r s v e n t r a l i s t h e m a j o r i t y of t h e G n R H n e u r o n s in v i t e l l o g e n i c f e m a l e s w a s p o s i t i v e f o r t h e r t G R ( F i g u r e 1 ) .

T o d e m o n s t r a t e t h e d o p a m i n e r g i c n e u r o n s i n t h e n u c l e u s p r e o p t i c u s p a r s a n t e r o v e n t r a l i s ( N P O a v ) , w h i c h a r e t h o u g h t t o b e r e s p o n s i b l e fo r t h e d o p a m i n e r g i c i n h i b i t i o n of G T H - I I r e l e a s e , a n t i b o d i e s a g a i n s t t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( a n t i - T H ) h a v e b e e n u s e d . T h e a n t i - T H a n t i b o d i e s h a v e b e e n v i s u a l i z e d u s i n g t h e c l a s s i c a l d i a m i n o b e n z i d i n e s t a i n i n g a n d a n t i - r t G R a c c o r d i n g t o t h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d m e t h o d . It w a s f o u n d t h a t in t h e f e m a l e t r o u t s t u d i e d , a i l T H - p o s i t i v e n e u r o n s of t h e N P O a v e x h i b i t e d a n u c l e a r s t a i n i n g f o r r t G R ( F i g u r e 1) .

A t t h e l e v e l o f t h e p i t u i t a r y , a d o u b l e l a b e l l i n g r e a c t i o n w i t h r t G R a n d P - gonado t rop i n - l l ( p - G T H - l l ) h a s b e e n p e r f o r m e d f o l l o w i n g t h e s a m e procédure a s fo r r t G R / G n R H . It a p p e a r e d t h a t t h e m a j o r i t y of t h e G T H - I I i m m u n o r e a c t i v e c e l l s w a s a l s o s t a i n e d f o r t h e r t G R ( F i g u r e 1 ) .

F ina l l y , a d o u b l e i m m u n o s t a i n i n g h a s b e e n c a r r i e d o u t fo r r t G R a n d r a i n b o w t r o u t e s t r a d i o l r e c e p t o r ( r t E R ) . B e c a u s e t h e l a b e l l i n g fo r r t E R is t o o w e a k f o r b e i n g d e t e c t e d u s i n g c o n v e n t i o n a l f l u o r e s c e n c e t e c h n i q u e s , a b i o t i ny l t y r a m i d e a m p l i f i c a t i o n S y s t e m h a s b e e n u s e d . In a d d i t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o n of t h e g u i n e a p i g a n t i - r t G R a n t i b o d y h a s b e e n r a i s e d f r o m 1 / 2 0 0 0 t o 1 / 5 0 0 . T h e p r i m a r y a n t i b o d i e s w e r e d e t e c t e d b y u s i n g s e c o n d a r y a n t i b o d i e s h a v i n g a différent f l u o c h r o m e : F I T C for r t G R a n d T e x a s r ed for r t E R . C o l o c a l i z a t i o n w a s o b s e r v e d in t w o régions ( F i g u r e 1) of i n t e r e s t c o r r e s p o n d i n g t o t h e d o p a m i n e r g i c n e u r o n s of t h e N P O a v a n d t he G T H - I I c e l l s of t h e p i tu i ta ry .

DISCUSSION

T h e f i r s t p a r t o f t h i s s t u d y c o n s i s t e d o f l o c a l i z i n g t h e r a i n b o w t r o u t g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r ( r t G R ) in t h e f o r e b r a i n of t h e r a i n b o w t r o u t , Oncorhynchus mykiss. T h e r t G R m R N A h a s b e e n l o c a l i z e d b y m e a n s of in situ h y b r i d i z a t i o n ( I S H ) a n d t h e r t G R p r o t e i n b y u s i n g i m m u n o c y t o c h e m i s t r y ( I C C ) .

Bull. Fr. Pèche Piscic. (1998) 350-351 :597-607 — 6 0 3 —

B o t h t y p e s o f t o o l s , i.e. t h e p r o b e f o r I S H a n d t h e a n t i b o d i e s f o r I C C , w e r e d i r e c t e d a g a i n s t t h e h y p e r v a r i a b l e A B - d o m a i n s o f t h e r t G R a n d g a v e spécifie r e s u l t s . C o m p a r i n g t h e I S H r e s u l t s t o t h o s e o b t a i n e d b y I C C , it c a n b e c o n c l u d e d t h a t t h e d i s t r i b u t i o n a l p a t t e r n s o f b o t h r t G R m R N A a n d r t G R p r o t e i n a r e v e r y s i m i l a r , i n d i c a t i n g t h a t t h e m R N A s a r e t r a n s l a t e d i n to p r o t e i n . T h e s u p e r p o s i t i o n of t h e r e s u l t s o b t a i n e d b y t h e t w o t e c h n i q u e s a l s o r e i n f o r c e s t h e s p e c i f i c i t y o f t h e l a b e l l i n g o b t a i n e d b y t h e t w o t e c h n i q u e s .

C o n t r a r y t o in situ h y b r i d i z a t i o n , w h i c h d e m o n s t r a t e s t h e r t G R m R N A i n t h e c y t o p l a s m , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a l l o w s t o détermine t h e s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f t h e m a t u r e p r o t e i n . In o u r s t u d y , w e c o n s i s t e n t l y f o u n d t h e l a b e l l i n g t o b e n u c l e a r . L i k e w i s e , t h e s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f G R h a s b e e n s t u d i e d in n e r v e c e l l s of ra t b r a i n c o r t e x b y P E K K I et al. ( 1 9 9 2 ) . Thèse a u t h o r s f o u n d t h e G R t o b e n u c l e a r i r r e s p e c t i v e o f t h e r e c e p t o r s o c c u p a n c y a n d t h e y re jec t t h e s o - c a l l e d n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n m o d e l , b y a r g u i n g t h a t a n y d i s l o c a t i o n o f t h e u n o c c u p i e d r e c e p t o r t o w a r d s t h e c y t o p l a s m is d u e t o t h e i n c r e a s e of c y t o p l a s m i c h e a t s h o c k p r o t e i n 9 0 , w h i c h s t r o n g l y b i n d s t h e G R a f t e r a d r e n a l e c t o m y .

T h e r e s u l t s of o u r s t u d y s h o w t h a t r t G R is m o s t e x p r e s s e d in t h e p r e o p t i c région a n d t h e m e d i o b a s a l h y p o t h a l a m u s , k n o w n t o b e t h e m a j o r n e u r o e n d o c r i n e régions in t e l e o s t s p r o j e c t i n g t o w a r d s t h e p i tu i t a ry . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t c o r t i s o l a c t i o n a t t h e b r a i n l e v e l , p r i m a r i l y t a k e s p l a c e o n n e u r o n a l S y s t e m s i n v o l v e d in t h e c o n t r o l o f p i t u i t a r y f u n c t i o n s . In t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y , w e o b s e r v e d t h a t t h e r t G R w a s e x p r e s s e d in s e v e r a l i n t e r e s t i n g a r e a s w i t h r e g a r d t o r e p r o d u c t i o n . O n e of thèse régions w a s t h e v e n t r a l t e l e n c e p h a l o n , w h i c h c o n t a i n s a p a r t o f t h e G n R H s y s t e m e x t e n d i n g f r o m t h e o l f a c t o r y b u l b s t o w a r d s t h e p i t u i t a r y ( B A I L H A C H E et al., 1 9 9 4 ; N A V A S et al., 1 9 9 5 ) . E f fec t i ve ly , a d o u b l e l a b e l l i n g s t u d y s h o w e d t h a t , a t t h e leve l o f t h e p o s t e r i o r p a r t o f t h e v e n t r a l t e l e n c e p h a l o n , a m a j o r i t y o f t h e G n R H n e u r o n s e x p r e s s e s t h e r t G R . S i m i l a r r esu l t s h a v e b e e n o b t a i n e d in t h e b r a i n of t h e ra t in w h i c h A H I M A a n d H A R L A N ( 1 9 9 2 ) c o l o c a l i z e d G R a n d L H R H in a s u b s e t o f G n R H n e u r o n s . In s e v e r a l s t u d i e s o n t h e G n R H s e c r e t i n g ce l l l i ne G T 1 - 7 , it h a s b e e n s h o w n t h a t t h e s y n t h e t i c g l u c o c o r t i c o i d d e x a m e t h a s o n e is c a p a b l e of r e p r e s s i n g G n R H g e n e e x p r e s s i o n a n d h e n c e r e d u c i n g G n R H sécrétion ( C H A N D R A N et al., 1 9 9 4 ; D E F R A N C O et al., 1 9 9 4 ; C H A N D R A N et al., 1 9 9 6 ; A T T A R D I et al., 1 9 9 7 ) . Thèse r e s u l t s f r o m in vitro e x p e r i m e n t s a r e c o n f i r m e d b y a n in vivo e x p e r i m e n t in r o u g h - s k i n n e d n e w t s (Taricha granulosa), d u r i n g w h i c h it a p p e a r s t h a t s t r e s s o r i n jec t i on w i t h c o r t i c o s t e r o n e s u p p r e s s e s L H R H r e l e a s e ( M O O R E a n d Z O E L L E R , 1 9 8 5 ) . In a d d i t i o n , t r e a t m e n t o f c a s t r a t e d rat w i t h d e x a m e t h a s o n e p r e v e n t s t h e p o s t - c a s t r a t i o n r i s e in G n R H r e c e p t o r s a t p i t u i t a r y l eve l ( R O S E N et al., 1 9 8 8 ) . F u r t h e r m o r e , t h e p r o m o t e r s o f t h e s a l m o n G n R H gènes I a n d II of t h e m a s u s a l m o n ( H I G A et al., 1 9 9 7 ) a p p e a r t o c o n t a i n G R E s ( g l u c o c o r t i c o i d r e s p o n s i v e éléments), i n d i c a t i n g t h a t t h e r e e x i s t p o t e n t i a l b i n d i n g s i tes f o r G R o n t h e s G n R H g e n e . W h e t h e r thèse p o t e n t i a l b i n d i n g s i t e s a r e f u n c t i o n a l r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d .

T h e s e c o n d région o f i n t e r e s t w a s t h e a n t e r o v e n t r a l p r e o p t i c n u c l e u s ( N P O a v ) , w h e r e d o p a m i n e r g i c n e u r o n s h a v e b e e n l o c a l i z e d . Thèse d o p a m i n e r g i c n e u r o n s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t o c o n t a i n t h e e s t r a d i o l r e c e p t o r a n d t o p r o j e c t t o w a r d s t h e p i t u i t a r y t o inh ib i t G T H - I I sécrétion ( L I N A R D et al., 1 9 9 6 ) . In t h i s région, w e p e r f o r m e d t w o k i n d s o f d o u b l e l a b e l l i n g s t u d i e s : o n e b e t w e e n r t G R a n d t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( T H , t h e ra te l i m i t i n g e n z y m e o f c a t e c h o l a m i n e s ) a n d t h e o t h e r b e t w e e n r t G R a n d r a i n b o w t r o u t e s t r a d i o l r e c e p t o r ( r t E R ) . D e s p i t e t h e f a c t t h a t a t r i p l e i m m u n o s t a i n i n g h a s n o t b e e n p e r f o r m e d , t h e r e is c o n v i n c i n g évidence t h a t t h e d o p a m i n e r g i c n e u r o n s o f t h e N P O a v c o n t a i n b o t h r t G R a n d r t E R . I n d e e d , a s a i l d o p a m i n e r g i c n e u r o n s o f t h e N P O a v e x p r e s s t h e r t G R a n d a s w e h a v e p r e v i o u s l y s h o w n t h a t 7 0 % of thèse c e l l s e x p r e s s t h e r t E R ( N A V A S et ai, 1 9 9 5 ) , it i s o b v i o u s that a t l e a s t 7 0 % of t h e d o p a m i n e r g i c N P O a v n e u r o n s e x p r e s s b o t h t y p e s o f s t e r o i d r e c e p t o r s . F u r t h e r m o r e , w e h a v e f o r m a l l y d e m o n s t r a t e d t h e c o e x i s t e n c e o f b o t h r e c e p t o r t y p e s in t h e s a m e c e l l s o f t h e N P O a v . T h e s i g n i f i c a n c e o f thèse r e s u l t s is u n k n o w n a n d is o p e n t o spéculation. It h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e d o p a m i n e r g i c n e u r o n s o f t h e N P O a v a r e


i n v o l v e d in t h e négative f e e d b a c k e f f ec t o f es t r ad io l o n G T H - I I r e l e a s e ( K A H et al., 1 9 9 7 ) . T h i s h y p o t h e s i s is s u p p o r t e d b y t h e fac t t h a t in t rout a n e s t r a d i o l - d e p e n d e n t d o p a m i n e r g i c i n h i b i t o r y t o n e o n G T H - I I sécrétion o r i g i n a t e s f r om t h e N P O a v a n d tha t thèse d o p a m i n e r g i c n e u r o n s e x p r e s s t h e r t E R ( L I N A R D et al., 1995 ; L I N A R D et al., 1 9 9 7 ) . A l t h o u g h t h e m o l e c u l a r t a r g e t s o f e s t r a d i o l in thèse c e l l s r e m a i n t o b e d e m o n s t r a t e d , it is l ike ly t h a t e s t r a d i o l v i a i ts r e c e p t o r modulâtes t h e a c t i v i t y of thèse n e u r o n s t o inh ib i t G T H - I I sécrétion. C u r r e n t s t u d i e s in o u r l a b o r a t o r y h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t c o r t i s o l i nh ib i t s r t E R e x p r e s s i o n in t h e l i ve r , m o s t l i ke l y at t h e t r a n s c r i p t i o n a l level ( T E I T S M A et al., 1 9 9 7 ) . T h e r e f o r e , it is p o s s i b l e t h a t c o r t i s o l a l s o interfères w i t h t h e e x p r e s s i o n of r t E R in t h e N P O a v d o p a m i n e r g i c n e u r o n s a n d t h e e s t r a d i o l - d e p e n d e n t i n h i b i t o r y t o n e o n G T H - I I r e l e a s e . S im i l a r l y , c o r t i s o l c o u l d interfère a t t h e l e v e l o f t h e p i t u i t a r y , w h e r e w e présent s t r o n g évidence t h a t t h e G T H - I I c e l l s e x p r e s s b o t h r t E R a n d r t G R . A s ER is a k e y f a c t o r in t h e c o n t r o l of G T H - l i p e x p r e s s i o n ( X I O N G et al., 1 9 9 4 ) , it is p o s s i b l e t h a t c o r t i s o l interfères v i a i ts r e c e p t o r w i t h t h e e x p r e s s i o n o f G T H - l l p by r e d u c i n g t h e E R ava i lab i l i t y .

F i na l l y , G R - E R i n t e r a c t i o n s in r a i n b o w t r o u t h a v e a l r e a d y b e e n d e m o n s t r a t e d b y D U C O U R E T a n d L E T H I M O N I E R ( u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . W h e n t h e y a d m i n i s t e r e d d e x a m e t h a s o n e t o t rou t h e p a t o c y t e s in c u l t u r e , a 5 0 % i n h i b i t i o n of t h e e s t r a d i o l - s t i m u l a t e d e x p r e s s i o n o f e s t r o g e n r e c e p t o r s c o u l d b e o b s e r v e d . O n t h e o t h e r h a n d , it h a s b e e n s h o w n t h a t e s t r a d i o l a d m i n i s t r a t i o n c o m p l e t e l y r e v e r s e s t h e o v a r i e c t o m y - i n d u c e d i n c r e a s e in G R m R N A c o n t e n t o f t h e rat a n t e r i o r p i t u i t a r y g l a n d ( P E I F F E R a n d B A R D E N , 1 9 8 7 ) .

CONCLUSION

r t G R m R N A a n d r t G R p r o t e i n a r e d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e n e u r o e n d o c r i n e régions of r a i n b o w t r o u t f o r e b r a i n . D o u b l e l a b e l l i n g s t u d i e s a l l o w e d t o i den t i f y t h r e e c e l l u l a r t a r g e t s a t t h e l eve l o f w h i c h c o r t i s o l c o u l d interfère w i t h t h e n e u r o e n d o c r i n e c o n t r o l of t h e r e p r o d u c t i v e a x i s . P h y s i o l o g i c a l a n d m o l e c u l a r b i o l o g y e x p e r i m e n t s w i l l h a v e t o b e d e v e l o p e d t o d e m o n s t r a t e t h e i m p l i c a t i o n and m o d e of a c t i o n of G R in thèse c o m p l e x r e g u l a t o r y p r o c e s s e s .

ACKNOWLEDGEMENTS

W e w o u l d l ike t o t h a n k t h e C N R S , INRA a n d E u r o p e a n U n i o n (Fa i r G T 9 5 - 2 5 4 9 ) fo r t h e i r f i n a n c i a l s u p p o r t .

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