ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf ·...
Transcript of ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf ·...
![Page 2: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/2.jpg)
تنقــية الفيروسات
Virus Purification
![Page 3: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/3.jpg)
تنقية الفيروس
:التنقيةعمليةتعني
الفيروسجزيئاتعلىالحصول
.منفردةبحالة•
.عاليبتركيز•
.اإلصابةعلىالقدرةمنعاليةدرجةعلىيكونأن•
![Page 4: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/4.jpg)
بالخلية(الفيروسيةالجزيئات)الفيروسإلرتباطنظرا 1.
منصهاستخالالفيروسعلىللحصوليلزمفأنهدائما
.اتيالنببالعصيرمعلقصورةفيالنباتيةالخاليا
فيتتواجدالتيواألصباغالبروتيناتلكثرةنظرا 2.
لتنقيةاعملياتمنسلسلةأجراءيلزمالنباتيالعصير
الجزيئاتعلىالمحتويالنباتيالعصيرعلى
.الفيروسية
![Page 5: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/5.jpg)
ظةالمحافمعمنفردةالفيروسجزيئاتعلىالحصولهوهذهالتنقيةعملياتمنالهدف
إصابةدثتحالالتيالمكوناتعناإلمكانبقدرخالصشكلوفياإلصابةفيفعاليتهاعلى
المادةعلىالالزمةالعملياتأجراءمنالبدالفيروسيةالجزيئاتعلىالحصوليمكنوحتى
.والكيميائيةالطبيعيةخواصهاالستنتاجالفيروسية
![Page 6: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/6.jpg)
خطوات تنقية الفيروس
أختيار الـــعائل
Selection of Host Plant
أختيار الـــساللة الفيروسية
Selection of Virus Strain
التنقية المناسبةأختيار طريقة
Selection of Purification Method
![Page 7: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/7.jpg)
:اآلتيراءاألجيلزمالكيميائيةأوالطبيعيةخواصهدراسةيرادمافيروسجزيئاتلتنقية
Selectionالــأختيار1. of Host Plantـعائل:
العصيرعلىللحصولوذلكللفيروسالمالئمالعائليختارأنالدراسةفيالبدءقبليجب
.نقيةالتعملياتعليهاستجرىالتي(الفيروسيةالجزيئات)الفيروسعلىالمحتوي
:هيالعائلفيتوفرهاالواجبالشروطاهم
.العائلالنباتتكاثرسهولة•
.فيهالمعدوىإجراءسهولة•
.الورقيالمحصولوفرة•
![Page 8: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/8.jpg)
:هيالعائلفيتوفرهاالواجبالشروطاهم
.العصيرمنمحتوياتهزيادة•
.الوعائيةأنسجتهخصوصا المختلفةأنسجتهداخلالفيروسأنتقالسهولة•
Darkالقاتمةالصبغاتمنخلوه• pigmentsيوالتالنباتيالعصيرفيتنتشرالتي
.استخالصهاويصعبالفيروسيةالجزيئاتمعمرتبطةكثيرا تكون
خروجهابعدخاصةالفيروسنشاطفيتؤثرالتيinhibitorsالمثبطاتمنخلوه•
.الخليةمنواستخالصها
![Page 9: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/9.jpg)
جماوحشكالالمتشابهةالجزئياتذاتنشطةالغيرالبروتيناتمناإلمكانبقدرخلوه•
.الريبوسوماتمثلاستخالصهاالمرادالفيروسيةالجزيئاتمع
.أخرىبفيروساتالتلوثمنخاليأيالفيروساتمنفقطواحدنوععلىيحتويأن•
![Page 10: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/10.jpg)
Selectionالــأختيار2. of Virus Strainالفيروسيةـساللة:
تحديداستهادرفيالبدءقبليلزمفيروسيةساللةمنأكثرلهايكونالتيالفيروساتحالةفي
.الدراسةعليهاسيجرىالتيالساللة
![Page 11: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/11.jpg)
:التاليةالشروطتوفرالفيروسيةالساللةاختيارحالةفييشترط
تلفتخحيثالنباتيالعائلداخلتضاعفهاسرعةآخربمعنىأوالفيروسيةالجزيئاتمنإنتاجهاغزارة•
.الخليةداخلتركيزهازيادةسرعةفيالفيروسيةالسالالت
متهامقاومثلعليهاالمختلفةالدارسةوعملياتالتنقيةعملياتإجراءعلىتساعدالتيالصفاتتوفر•
.الطبيعيةخواصهاوثباتلألنحالل
Geomaticsالوراثيثباتها• stabilityغيرتبدونالوراثيةبصفاتهااالحتفاظعلىقدرتها:بذلكوالمقصود
.والدراسةالتنقيةفترةأثناءطفراتحدوثأو
الجزيئاتعنحرةتحضيرهاسهولةآخربمعنىأوالريبوسوماتأوللعائلالنوويةبالبروتيناتارتباطهاعدم•
.الفيروسيالنشاطالتحتملالتيالبروتينية
.صيبهاتالتيالعوائقعلىاإلصابةلمظاهرتكوينهاوسرعةالمختلفةالعوائلإصابةعلىالعاليةقدرتها•
![Page 12: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/12.jpg)
![Page 13: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/13.jpg)
Selectionطريقةأختيار3. of Purification Methodالمناسبةالتنقية:
أيمتجانسرتحضيعلىللحصولالبروتينكيمياءعلىأساسهافيتعتمدمختلفةطرقعدةالفيروساتلتنقية
أمالتفصطرقبإتباعالكيميائيالتركيبموحدةجزيئاتمنمكونةفيهحدهعلىكلواحدمكونعلىيحتوي
أواحدومنهاوالذيمختلفةمحتوياتالىالمخلوطتفصلأوالمخلوطمنالفيروسجزيئاتأماوالغريبةالمواد
.الفيروسيحتويأكثر
![Page 14: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/14.jpg)
:التاليةالنقاطالمختلفةللفيروساتالتنقيةعملياتتشمل
.Extractionالعائلنسيجفيالفيروسعلىالمحتويالمصابالخامالعصيراستخالص•
.Clarificationالمصابالعصيرترويق•
(الفيروسوتجميعترسي).Purificationالفيروسعلىالحصول•
Pu
rifi
cati
on Extraction
Clarification
Purification
![Page 15: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/15.jpg)
:(الفيروسبروتين)مابروتينتنقيةعندمراعاتهايجبمهمةقواعدهناك
.المختلفةpHالولدرجاتالمختلفةالحرارةلدرجات(الفيروس)البروتينثباتدرجةمعرفة•
.الكيميائيةوالطبيعيةخواصهفيتغيرأيحدوثدونالبروتينيترسبأنيمكن(الماءغير)المذيباتمنأيفي
![Page 16: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/16.jpg)
:اوال
:العصيرأستخالص
النسبةتكونوبذلكالمنظمالمحلولمنمل6إليهايضافثمالمثلجةالمصابةاألوراقمنجم1وزنيتم-1
(6:1).
.بالهاوناألوراقتطحن-2
أنبوبةيفالحجميكملأنويراعيالمركزيالطردأنبوبةفييوضعثمالمعقمالشاشباستخدامالعصيريصفى
.المنظمالمحلولمنمل6الىالطرد
![Page 17: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/17.jpg)
:ثانيا
:العصيرترويق
.دقائق5لمدةالدقيقةفيلفة3000عندالسابقةلألنبوبةمركزيطردعمليتم-1
مذيب)الكلورفورممنمل½لهايضافثمأخرىطردأنبوبةالىاألنبوبةمنالرائقينقلالماصةبإستخدام-2
دقائق5لمدةالدقيقةفيلفة3000عندمركزيطردلهايعملثمدقائق،5لمدةالشديدالرجيتمثم(عضوي
.الرجبعدمباشرة
أنبوبةيفالحجميكملأنويراعيالمركزيالطردأنبوبةفييوضعثمالمعقمالشاشباستخدامالعصيريصفى
.المنظمالمحلولمنمل6الىالطرد
![Page 18: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/18.jpg)
:أهمهامنالكيميائيةالطرقأحدباستخدامالفيروسوتجميعترسيب:ثالثا
Salting)التمليحطريقة Out)
![Page 19: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/19.jpg)
:ثالثا
:أهمهامنالكيميائيةالطرقأحدباستخدامالفيروسوتجميعترسيب
Salting)التمليحطريقة Out)
علىالدخانموزيكفيروسفصلمنتمكنحيثStanly,1935هوالطريقةهذةاستخدممنأول
حيثالبروتينعلىطبيعيتأثيرمنلهالما%100األمونيومكبريتاتمحلولباستخدامبللوريشكل
الىيضافحيث،%50عندفيترسبالجلوبيولينأما،%100تشبععنديترسباأللبيومينأنوجد
لجزيئاتترسيبفيحدثيتركثمدقيقة15لمدةويقلبالفيروسيةالجزيئاتعلىالمحتويالراشح
إضافةعمليةتكررثم.أخرىمرةمحلولليكونماءفيالراسبويعلقالراشحيستبعدثمالفيروس،
![Page 20: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/20.jpg)
.وترشيحهتعليقةإعادةيمكنالذيالفيروسجزيئاتترسيبفيتكرراالمونيومكبريتاتمحلول
:المشبعةاألمونيومكبريتاتإضافة•
.ثلجيحمامفيالمشبعةاألمونيومكبريتاتتحضيريتم
أخرىطردأنبوبةالىالترويقعمليةفيالسابقةاألنبوبةمنالرائقينقلالماصةبإستخدام1.
لمدةتركتثمالمشبعةاألمونيومكبريتاتمنحجمهنصفإليةيضافالمصابالعصيرمنالرائقحجمحسبوعلى
.الثالجةفيساعة24
.دقيقة20لمدةالدقيقةفيلفة9000عندمركزيطردعمليتمالفترةهذةبعد.2
حتىعةسافترةويتركمعلومةبكميةالمنظمالمحلوللهفيضافالراسبأماالرائقمنالتخلصيتمذلكبعد.3
طردعمليثماالمونيومكبريتاتسطحعلىادمصاصهابعدالمحلولفيأخرىمرةالفيروسجزيئاتانتشاريعاد
.دقيقة30لمدةالدقيقةفيلفة6000عندمركزي
![Page 21: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/21.jpg)
.الكبريتاتأمالحمنكمية+نقيفيروسعنعبارةهوالناتجالرائقالمحلول.4
استخدامبالمحاليلفيمنفذةالشبةاألغشيةخاللاألنتشار)األسموزيةخاصيةطريقعنمنهاالتخلصيتم.5
.(متعادلةpHدرجةذوفوسفاتيمنظممحلول
![Page 22: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/22.jpg)
:النباتإصابةفيالتنقيةعمليةكفاءةمدىأختبار
وتدونالصوبةيفيوضعثمالنقيبالفيروسميكانيكا حقنةيتمثمالمناسبالعائلتوفيريتم
دالطرأجهزةبإستخداموذلكالفيروسجزيئاتلترسيبأخرىطبيعيةطرقهناك.النتائج
امالحأوالسكروزمنالمتدرجالكثافةعمودذوالمركزيوالطردالسرعةفائقالمركزي
.السيزيوم
![Page 23: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/24.jpg)
Figure1.(d,e) Electron microscopy. Negative stain images of rAAV9 purified (d) using the
sodium citrate method, or (e) using discontinuous step gradient of iodixanol.8 The inserts in
the lower right hand corner are close-up images of the virus capsids. Filled arrowheads point at
the DNA-containing particles; empty arrowheads: at the empty capsids; black asterisk
indicates proteasome; white asterisk indicates deformed AAV particle.
Figure 2. A) Two bands of virus in the tartrate gradient are visible when a small light source is
placed beneath the centrifuge tube. B) The upper band contains empty capsids, which have
intact VP0 whereas the lower band C) contains native infectious virus. As assayed by negative
stain TEM (shown) and PAGE gel (data not shown).
![Page 25: ماعلا تاسوريفلا لمعمfac.ksu.edu.sa/sites/default/files/lmml_lsb_2.pdf · ماعلا تاسوريفلا لمعم “250 MIC ” عباسلا لمعملا يسيبــكلا](https://reader034.fdocuments.in/reader034/viewer/2022051916/60083c978037d511425e8fbc/html5/thumbnails/25.jpg)
نهاية المعمل السابع