Post on 24-Feb-2016
description
1
Validasi dan Verifikasi Metode
Analisis
Mochammad YuwonoFakultas Farmasi Universitas Airlangga
E-mail: yuwono05@yahoo.com
Alfas – Surabaya, 29 Maret 2014
Sharing KnowledgeIkatan Alumni Universitas Airlangga – Fakultas Farmasi
Sharing Knowledge2
Quality is important in every product or service, but it is vital
in medicines as it involves life.
Regulasi Obat: Persyaratan Sangat ketat !
QualityInvisible when GOODImpossible to ignore when BAD
How good something isIf the quality of a product is low, it means that the product is not really good
3
Sharing Knowledge
Quality of Products
The ability to make the same product the same way, over and over again.
Customer buys today is same as what they bought last month or will buy next month.
Product meets customer’s expectation.
4
Consis
tent
relia
ble
Sharing Knowledge
Quality of Pharmaceutical Products
Quality of thepharmaceutical
products
Man Machine
qualified
calibrated
robust
qualified
Methods
suitable
characterised
documented
MilieuMaterial Management
Quality
Referencestandards
Tempe-rature
Analysts´support
skilled
Humidity
Vibrations Time
Supplies
Irradi-ations
Motivation
Measurements
5 Sharing Knowledge
Quality in Analytical Laboratory
Alat/Instrumen
AnalisBaku Pembanding, Reagensia
Pendidikan
Pelatihan
Pengalaman
Verifikasi KinerjaPresisi
KalibrasiSelektivitas SST
Akurasi, LOD, LOQ
LinieritasLinieritas
Sensitvitas
KualifikasiValiditas
Hasil Valid &
Terpercaya
Metode Analisis
Preparasi sampel
Akomodasi & Lingkungan
6 Sharing Knowledge
Quality of Analytical Data
Sharing Knowledge7
Instrumen Analisis(memenuhi kualifikasi DQ, IQ, OQ, PQ)
Metode Analisis(telah divalidasi/diverifikasi)
Sistem(memenuhi uji SST)
Internal QA(Sampel kontrol masuk rentang)
Hirarki Komponen Mutu Data Analisis
Sampel
Sarana & Prasarana
Bahan Kimia & SRM
SafetyPengelola & Analis
Metode Analisis
Alat/Instrumen
Dokumen sistem Mutu
VALID & TERPERCAYA
8Sistem Manajemen MutuSharing Knowledge
Laporan Hasil
Quality Assurance:
A n a l i s i s
ISO 17025/GLP
Preparasi Sampel – Analisis data
Pengem
bangan
Metode
Validasi /Verifikasi Metode
Sampel Obat, Obat Tradisional, Makanan, Kosmetik
Prosedur Analisis
Sampling9 Sharing Knowledge
Metode Analisis Kimia
GC-MS GC-FTIR/MSLC-MS/MS LC-NMR
Hyphenated Instruments
10 Sharing Knowledge
Metode Analisis
Optimasi
Validasi
Implementasi (rutin)
Pengembangan
Revalidasi
Pre-validasi
Andev
QC11 Sharing Knowledge
Metode Standar/Baku
In House Validation of
Method
Interlaboratory Validation
(Collaborative Study)
Standard Method
Verification of Method
Single Laboratory
Validation Full
Validation
12 Sharing Knowledge
Compendial Methods
Metode yang tertera dalam FarmakopeMerupakan metode Standar yang telah
divalidasi (Full Validation)Termasuk metode Resmi (Official
method) untuk negara-negara tertentu
Sharing Knowledge13
14
Kategori Metode Analisis
Metode analisis untuk identifikasi
Penetapan cemaran atau hasil Degradasi Penetapan kuantitatif (II a) dan uji batas/kualitatif (II b)
Penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku obat atau bahan aktif dalam sediaan farmasi
Penetapan karakteristik sediaan (disolusi, pelepasan obat, dll)
I
II
III
IV
Sharing Knowledge
15
Karakteristik kinerja metode USP dan ICH
PresisiAkurasi
Batas Deteksi (DL/LOD)Batas Kuantitasi (QL/LOQ)
Linieritas
Selektivitas/Spesifisitas
Rentang
Validasi Metode
Robustness/RuggednessSystem Suitability Test
Sharing Knowledge
Sharing Knowledge16
USP ICH 1. Presisi2. Akurasi3. Batas deteksi 4. Batas kuantitasi5. Spesifisitas 6. Linieritas7. Rentang
1. Presisi2. Akurasi3. Batas deteksi4. Batas kuantitasi5. Spesifisitas6. Linieritas7. Rentang 8. Robustness 9. Kesesuaian sistem
Parameter Validasi Menurut USP dan ICH
17
Akurasi dan Presisi Metode
Akurasi rendah Presisi tinggi
Akurasi tinggi Presisi tinggi
Akurasi tinggi Presisi rendah(Hasil dirata-rata)
Akurasi rendah Presisi rendah
Sharing Knowledge
Permintaan Validasi
Literature searchTelaah karakteristik AnalitPenyiapan bahan dan alat
Pengembangan/optimasi Metode
Pembuatan protokol Validasi
Percobaan laboratorium sesuai
protokol validasi
Analisis DataPenyusunan Laporan Validasi
Penyerahan dokumen
Tahapan Validasi Metode
ValidasiMetode
18 Sharing Knowledge
Sharing Knowledge19
Validasi Metode Vs.
Verifikasi Metode
Verifikasi
Validasi
• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan sebelumnya
• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa laboratorium mampu menggunakan metode analisis baku/standar pada kondisi nyata di laboratoriumnya
20 Sharing Knowledge
Metode baku/Standar Compendial Method
(USP, FI, AOAC, ISO dll.)
Metode tidak baku Metode pengembangan Metode baku yang dimodifikasi Metode baku yang digunakan di luar lingkup
Verifikasi
Validasi
21 Sharing Knowledge
Modifikasi metode kompendial
Jika pada verifikasi metode, kondisi pada Metode kompendial TIDAK diperoleh hasil yang optimal (misal peak tailing, fronting, splitting, resolusi pemisahan tidak terpenuhi) Laboratorium dapat melakukan modifikasi atau adjustment.
Pada USP tertera batas-batas modifikasi atau adjustment yang diperkenankan
Sharing Knowledge22
Modifikasi/Adjustment metode kompendial
Sharing Knowledge23
Sharing Knowledge24
Panduan validasi metode analisis
ICH Q2A : Text on validation of analytical ProcedureICH Q2B Validation of analytical procedures methodologyFDA-CDER (Center for Drug Evaluation and Research)a. Reviewer guidance validation of chromatographic
methodsb. Submitting sample and analytical data for method
validationc. Analytical procedure and method validation for
human studies d. Bioanalytical method validation for human studies
USP: Validation of compendial proceduresUSP: Verification of compendial procedures
Sharing Knowledge25
26 Sharing Knowledge
27 Sharing Knowledge
Verifikasi Metode
Adopsi metode baku/standar Untuk membuktikan bahwa suatu laboratorium mampu melakukan analisis di laboratoriumnya untuk menunjukkan bahwa kinerja metode dapat
ditiru atau diulang oleh laboratorium yang bersangkutan dengan hasil yang sama
28 Sharing Knowledge
Metode baku/Standar Compendial Method
(USP, FI, AOAC, ISO dll.)
Metode tidak baku Metode pengembangan Metode baku yang dimodifikasi Metode baku yang digunakan di luar lingkup
Verifikasi
Validasi
29 Sharing Knowledge
Sharing Knowledge30
Sharing Knowledge31
Metode “General Test” (LOD, sisa pijar, bilangan asam, pH) tidak perlu diverifikasi
Sharing Knowledge32
Acuan Verifikasi Metode
33 Sharing Knowledge
1. Confirmation of Identity, a method that ensures a material is what it purports to be or confirms the
detection of the target analyte.2. Quantifying an analyte at a low concentration.3. Determining if an analyte is present above or below a specified, low concentration (often called a Limit Test). The specified
concentration is close to the LOQ.4. Quantifying an analyte at a high concentration.5. Determining if an analyte is present above or below a specified, high concentration (often called a Limit Test). The specified concentration is substantially above the LOQ.6. Qualitative test.
Kategori Analisis
34 Sharing Knowledge
Parameter Validasi
35 Sharing Knowledge
Parameter Verifikasi
36 Sharing Knowledge
37 Sharing Knowledge
38 Sharing Knowledge
39 Sharing Knowledge
40 Sharing Knowledge
Parameter Verifikasi Metode
Sharing Knowledge41
Penetapan kadar bahan aktif dalam sediaan farmasi
Selektivitas/spesifisitas, Presisi dan akurasi merupakan parameter penting
42
Selektivitas vs. Spesifisitas
USP dan ICH menggunakan istilah Specificity
IUPAC dan AOAC menggunakan istilah Selectivity
AOAC: Specificity “highest selectivity”
Sharing Knowledge
Sharing Knowledge
43
Specificity (ICH/USP)Specificity (USP/ICH): The ability to assess unequivocally the analyte in the presence of components to expected to be present, such as impurities, degradation products, and matrix components.
Selectivity describes the ability of an analytical method to differentiate various substances in a sample.
44
Spesifik dan SelektifSelektif:Mampu membedakan antara senyawa analit dengan derivat/degradan/ metabolit atau senyawa pengganggu lainnya
Spesifik:Mampu mengenal respons untuk analit tunggal/murni
Sharing Knowledge
45
Spesifisitas/Selektivitas: Jika tersedia zat hasil degradasi:
Suntikkan:Blanko sampel/Placebo (Sampel minus
analit)Zat Hasil degradasi (degradants)Zat yang memiliki struktur mirip (Related
substancesZat metabolit (untuk bioanalisis)
Sharing Knowledge
46
Spesifisitas/Selektivitas: Blanko sampel/Placebo
tidak menghasilkan peak/noda dengan waktu retensi/Rf yang sama dengan analit
Peak/noda analit terpisah dari peak/noda lainnya
(Rs ≥1,5)46
Sharing Knowledge
Placebo
Sampel
(Rs ≥1,5)
47 Sharing Knowledge
Meloxicam dalam tablet (spektrofotometri UV/Vis)
48 Sharing Knowledge
49
Specificity/Selectivity:
Lakukan forced degradation studies (studi degradasi paksa)
Sampel disimpan pada suhu/kelembaban tertentu atau penambahan oksidator
Bandingkan profil pemisahan peak sebelum
dan sesudah perlakuan
Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)
Sharing Knowledge
50
Forced Degradation Studies
Heat Temperature (50 - 60 oC) Humidity Kelembaban (70 to 80%) Acid Hydrolysis HCl 0.1 N Base Hydrolysis NaOH 0.1 N Oxidation H2O2 (3 to 30%) Light UV/Vis
Sharing Knowledge
Spesifisitas: Uji kemurnian analit Menggunakan Detektor Diode array Teknik Spiking
Peak hasil spiking menunjukkan satu peak/noda dan memiliki tR/Rf sama
Pada TLC menggunakan sistem pengembang berbeda-beda
GC-MS LC-MS; LC-MS/MS
51 Sharing Knowledge
Contoh studi degradasi paksa (HPLC-DAD)
PENETAPAN KADAR PAROXETINE DALAM SEDIAAN TABLET
52 Sharing Knowledge
Overlay spectra UV - analit
53 Sharing Knowledge
Hasil Degradasi terhadap tablet paroxetine 20 mgCondition Time
(h) % Recovery RRT* of degradation
products Acid 0.1 N HC1, 80°C 50 98.0 None detected Base 0.1 , 80°C 50 96.5 1.65 Hydrogen peroxide 0.3%, 80°C
2 73.0 0.19, 0.22, 0.23, 0.27
0.31, 0.35, 0.39, 0.43 0.45, 0.49, 0.52, 0.55 0.59, 0.63, 0.71, 0.76 1.13, 1.36, 1.64
Heat dry, 80°C 72 99.2 None detected Heat wet, 80°C 72 96.2 1.65 Light dry, 1000 foot candles 144 99.5 None detected
Light wet, 1000 foot candles 144 80.3 0.17, 0.20, 0.23, 0.42
0.44, 0.55, 0.82, 0.88 1.13, 1.60
* RRT, relative retention time.
54 Sharing Knowledge
55
Linieritas (Linearity)
Kemampuan suatu metode untuk menunjukkan hubungan secara langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi analit.
A B C D
●
●●
●●
Respon alat
Sharing Knowledge
56
Linieritas
Melalui analisis statistik Linear Regression (y = mx + b) Correlation Coefficient (r), y-intercept (b), slope (m), residual sum of squares
Disarankan menggunakan minimum 5 macam konsentrasi analit
Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan dari sampel hasil pengenceran
Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran dan/atau larutan spike
2/122 })(){())((
1 yyxxyyxx
ri
ii
Sharing Knowledge
57
Evaluasi terhadap Linieritas
Relative process standard deviation (Vxo)
Mandel’ testResidual testANOVA-linearity testingRSD of the Plot of response factor Vs.
concentrationXp value- Funk’s et al. r value Homogeneity of the linear-curve
Sharing Knowledge
58
Evaluasi Linieritas
i
iiY
YXO
xoXO
bxayN
yyS
bSS
XSV
ˆ , 2
ˆ where
%100
0.05 p and
2-N ffor factor student t t , 1
11. .Y
with.
11. . 2
22
2
P
2
2
iiXX
XXtableY
XX
PtableXOP
XN
XQ
QX
NtSa
QbYY
NtSX
Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linear Vxo = koefisien variansi regresi linear
Vxo = <2-5%Sharing Knowledge
Koefisien korelasi
Nilai r ternyata TIDAK menjamin linieritas respons dan konsentrasi
Kurva non linier dapat memiliki r yang tinggi Korelasi linier jika rhitung > rtabel. Harga r
tergantung jumlah konsentrasi. Contoh n = 5 rtabel = 0,878; n = 10 r tabel = 0,632
r membuktikan linieritas jika rentang tidak terlalu lebar dan r ≥ 0,999
59 Sharing Knowledge
Residual dan Least square
Makin kecil atau makin besar konsentrasi deviasi makin besar dikuadratkan dan diminimasi Least square
Oleh karena itu, respons harus memiliki varians yang sama (Homogeneity of variance = homoscedasticity) 60 Sharing Knowledge
Persamaan garis regresi
koefisien korelasi r ≥ 0,999 Persamaan garis melewati titik 0,0 Intersep tidak berbeda secara bermakna
dengan nol lakukan uji t Slope berbeda secara bermakna dengan harga
nol lakukan uji t
61 Sharing Knowledge
Respons faktor = y/x
62 Sharing Knowledge
Uji Homogenitas
digunakan untuk mengetahui homogenitas varian pada persamaan garis regresi
Uji F menguji homogenitas batas atas dan bawah
Uji Cochran dan uji Barlett menguji keseluruhan titik pada rentang persamaan garis
63 Sharing Knowledge
64 Sharing Knowledge
65
Rentang (Range)
Interval antara konsentrasi terbesar dan terkecil dari analit dalam sampel
Memenuhi syarat dalam hal presisi, akurasi dan linieritas
Sharing Knowledge
66
Minimum Specified Range:
For Drug Substance & Drug product Assay 80 to 120% of test Concentration
For Content Uniformity Assay 70 to 130% of test Concentration
For Dissolution Test Method +/- 20% over entire Specification Range
For Impurity Assays From Reporting Level to 120% of Impurity Specification for
Impurity AssaysSharing Knowledge
67
Uji Homogenitas kurva kalibrasi
Sharing Knowledge
Metode Analisis pada Cleaning Validation
Validasi Metode untuk analit konsentrasi sangat rendah (Residu)
Parameter LOD dan LOQ berperan sangat penting
Sharing Knowledge68
69
Akurasi
Biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery)
Dapat dilakukan melalui pebandingan hasil analisis antara metode yang divalidasi dengan metode standar uji t harus tidak berbeda makna
Dapat dilakukan metode adisi standar terhadap blanko atau sampel.
Sharing Knowledge
70
Akurasi
Persen perolehan kembali (% recovery)
Persyaratan untuk assay validation = 98-102%
Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi masing-masing 3 kali replikasi
Adisi standar pada blanko/plasebo
%100Re% xyasesungguhnKadar
diperolehyangKadarc
Sharing Knowledge
71
KURVA AKURASI menurut Funk et. al.
- Untuk mengetahui ada atau tidaknya kesalahan sistematis, Dibuat kurva regresi antara Xf (konsentrasi analit hasil analisis) terhadap Xc (konsentrasi nominal analit)
Xf = af + bf. Xc
- Dihitung confidence range (Cr) dari intercept {VB(af)} dan slope {VB(bf)} dari recovery Pada p = 0.05
QxxXc
N1 . S . ta =aCr
2
yftableff
Qxx.Stb=bCr yftable
ff
2-N)]X-b+(a-[X
=S2
iffifyf
t = Student-t-factor f = N-2, P = 95 %. Sharing Knowledge
72
M. Yuwono & G. Indrayanto, Validation method of Chromatography Methods of Analysis, Profiles of Drugs Substances, Excipients and Related Methodology, Vol. 32, Elsevier Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto. In Press (2005)
Sharing Knowledge
Sharing Knowledge73
Analyte recovery at different concentration
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
Analyte Ingred. (%)
Analyte ratio Unit Mean recovery
(%)100 1 100 % 98-102≥ 10 10-1 10 % 98-102≥ 1 10-2 1% 97-103
≥ 0.1 10-3 0.1% 95-1050.01 10-4 100 ppm 90-1070.001 10-5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-1100.00001 10-7 100 ppb 80-1100.000001 10-8 10 ppb 60-115
0.0000001 10-9 1 ppb 40-120
74
PresisiKedekatan dari suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen
Dalam bentuk RSD (relative standard deviation)
Meliputi: - Repeatability - Intermediate Precision - Reproducibility
Sharing Knowledge
75
Repeatability
Kondisi sama pada interval waktu yang singkat
Satu larutan uji disuntikkan berkali-kali pada hari yang sama, alat yang sama, analisis serta kondisi lain yang sama.
Disebut juga Intra-assay precision
Sharing Knowledge
76
Intermediate Precision
Disebut juga “within-laboratory varia-
tions”.
Berbeda hari, atau analis, atau instru-
ment (dalam satu laboratorium)
Sebagai bagian Ruggedness menurut USP
Sharing Knowledge
77
Repeatability test at different labs.Berbeda analis atau instrument dari
laboratorium yang berbeda
Reproducibility
Sharing Knowledge
78
Uji Presisi :
Dianjurkan menggunakan 3 macam konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120 % dari konsentrasi target
Masing-masing konsentrasi dilakukan 3 replikasi
Dapat dilakukan pada satu konsentrasi dengan 6 kali replikasi
Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang berbeda dan analisis yang berbeda
Kriteria penerimaan: tergantung kategori analisis atau konsentrasi analit
Contoh: RSD < 2% (kategori I)Sharing Knowledge
Sharing Knowledge79
Analyte concentration vs precision
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
Analyte % Analyte ratio Unit RSD (%)100 1 100 % 1.3≥ 10 10-1 10 % 2.7≥ 1 10-2 1 % 2.8
≥ 0.1 10-3 0.1% 3.70.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.30.0001 10-6 1 ppm 110.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 210.0000001 10-9 1 ppb 30
Kurva Horwitz
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)
C adalah konsentrasi (fraksi desimal)
Misalnya : Untuk kadar C = 100% maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%
HORRAT = SBRobs/SBRcalc
Dapat dilakukan pada satu konsentrasi
80 Sharing Knowledge
Sharing Knowledge81
Validasi Metodepada
Cleaning Validation
Analytical Method for Cleaning Validation
• Metode Analisis hendaknya divalidasi sebelum validasi pembersihan
• Pemilihan metode analisis untuk analisis residu berkaitan erat dengan sifat kimia target residu dan batas deteksinya
• Metode yang digunakan mampu mendeteksi residu atau kontaminan secara spesifik Kromatografi (HPLC, GC, and HPTLC). Metode lainnya (sendiri atau kombinasi): TOC, pH,
Konduktivitas, Spektrofotometri UV, ELISA
Sharing Knowledge82
Analytical Method for Cleaning Validation
Validasi Metode meliputi : Presisi, Linieritas dan Selektivitas (jika target
berupa analit spesifik); LOD LOQ Recovery (melaui spiking analit) reproducibility
Batas Deteksi merupakan paramater sangat penting.
LOD di bawah batas konsentrasi residu/ kontaminan yang diperkenankan
83 Sharing Knowledge
Analytical Method for Cleaning Validation
Recovery < 50% is consideredquestionable
> 80% is considered good > 50% is considered
reasonable
84 Sharing Knowledge
Batas Deteksi
Batas Deteksi?
Batas Deteksi:Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih dapat terdeteksi
85 Sharing Knowledge
86
Lowest amount of analyte in a sample that can be detected but not necessarily quantitated.
Estimated by Signal to Noise Ratio of 3:1.
Detection Limit (DL)
Lowest amount of analyte in a sample that can be quantified with suitable accuracy and precision.
Estimated by Signal to Noise Ratio of 10:1.
Quantitation Limit (QL)
Sharing Knowledge
87
Detection Limit (DL) and Quantitation Limit (QL)
1. Based in Visual Evaluations- Used for non-instrumental methods
2. Based on Signal-to Noise-Ratio- 3:1 for Detection Limit- 10:1 for Quantitation Limit
3. Based on Standard Deviation of the Response and the Slope menggunakan sampel konsentrasi rendah dapat digunakan SD dari residual; SD intrersep
Sharing Knowledge
88 Sharing Knowledge
89
Based on Signal-to Noise-Ratio
Sharing Knowledge
90
Based on the Standard Deviation of the Response and the Slope
where s = the standard deviation of the response ( SD of blank samples or SD of intercepts of regression line)S = the slope of the calibration curve
Sharing Knowledge
91
Definition: Capacity to remain unaffected by small variations in method parameters
Determination: Comparison results under differing conditions with precision under normal conditions Variations may include: stability of analytical
solution, variation of pH in a mobile phase, different column (lot/supplier), temperature, flow rate.
Robustness
Sharing Knowledge
92
Re-Validation
“When sponsors make changes in the analytical procedure, drug substance, drug product, the changes, may necessitate revalidation of the analytical procedures.”
“The degree of revalidation depends on the nature of the change.”
Sharing Knowledge
93
Terima Kasih
Mochammad YuwonoFakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya
E-mail: yuwono05@yahoo.com
Sharing Knowledge