UICC HPV and Cervical Cancer Curriculum Chapter 2.d. Screening and diagnosis - HPV analysis and typingProf. Suzanne Garland, MD; Prof. Sepehr Tabrizi

UICC

HPV e CÂNCERCERVICALCURRÍCULO

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01 Capítulo 2.d

Triagem e diagnóstico - Análise e tipagem de HPV

Prof. Suzanne Garland MDDiretora de Pesquisa Microbiológica, Chefe de Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas Hospital Real de MulheresMelbourne, Austrália

Associado Prof. Sepehr TabriziCientista de Pesquisa Sênior, Departamento de MicrobiologiaHospital Real de MulheresMelbourne, Austrália

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02 Partículas semelhantes a Vírus (VLP)• Análogos não infecciosos de um vírus patogênico

• VLP-L1 se une in vitro a capsídeos vazios ou “VLPs”

• Produção de VLP não padronizada

- Sistemas diferentes de expressão, métodos preparativos, abordagens de controle de qualidade

- Formatos de identificação variam (direto vs. indireto)

- Sem padrão ouro para estabelecimento de limite para resultado positivo

- Poucas comparações entre laboratórios

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03 Partículas semelhantes a Vírus (VLP)• VLPs podem ser analisadas utilizando técnicas de

microscopia eletrônica

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04 Detecção de anticorpo para HPV

• Anticorpos

- A presença representa infecção passada ou presente

- Pode ser gerado contra proteínas de HPV precoces (E) ou proteínas tardias (L)

- Anticorpos neutralizantes L1 se correlacionam com proteção iniciada por vacina

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05 Detecção de anticorpo para HPV• Vários ensaios foram desenvolvidos para detectar

anticorpos no soro/mucosa

- Teste imunoabsorvente de ligação a enzima (ELISA): medidas de Ig total, neutralizantes e não neutralizantes

- Testes de ligação competitiva, por exemplo, teste Luminex competitivo (cLIA): medidas de Ig neutralizantes a um epítopo apenas, mas a todas as classes de Ig

- Teste de pseudovírus: medidas de Ig neutralizantes total, todas as subclasses

- Western blot

- Radio-imuno precipitação

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06 Detecção de DNA do HPV por microscopia no tecido• Imuno-histoquímica (antígeno específico para o

grupo)

• Exame Papanicolau: detecta células precursoras de câncer

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07 Técnicas de Detecção Molecular para DNA do HPVMétodos de Amplificação

• Amplificação de sinal

- Captura Híbrida (HC2)

• Amplificação Alvo

- Reação em cadeia da polimerase - DNA do HPV por PCR

- RNAm do HPV

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08 Teste de Captura Híbrida 2

• Teste aprovado atualmente pelo FDA

- formato de tubo em 1995; formato de microtitulação em 1999

• Destinado para trabalhar com amostra de célula cervical esfoliada

• Kit de coleta recomendado inclui escova e meio de transporte de amostra

- Coleta de células endo e ectocervicais

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09 Teste de Captura Híbrida 2

• Sensibilidade de 5000 genomas/amostra

• Sonda para detecção de HPV de baixo risco

- HPV dos tipos 6, 11, 42, 43, 44

• Sonda para HPV de alto risco

- HPV dos tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68

• Resultados não específicos ao tipo

• Sem controle para entrada do número de células

• Boa comparação entre laboratórios

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10Reação em cadeia da polimerase• Muito sensível em cerca de 1 a 10 cópias /100.000

células

• Permite o teste de vários tipos de amostra

• Permite o teste de amostras estocadas com qualidade ruim de DNA

• Testes de consenso: geralmente com alvo na região L1

- Conservado

- Primers variam:MY09/MY11SPF1/SPF2PGMY09/PGMY11 GP5+/GP6+

- Detecção de variedade dos sistemas:ELISAdot blot

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11 Diferentes metodologias de PCR• Teste AMPLICOR ® para HPV

• Teste LINEAR ARRAY® para HPV

• Teste de genotipagem INNO-LiPA ®

- Genotipagem de HPV em cortes incluídos em parafina

- Os cortes do tecido podem ser muito antigos e submetidos à degradação do DNA (inclusive durante a extração)

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12 Diferentes metodologias de PCR

• Formulário do chip de DNA do HPV

• Microarray para HPV

• Ensaio de citometria de fluxo

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13 Outras metodologias para detectar os tipos de HPV

• Tecnologia xMAP® da Luminex

• Norchip - Proficiência ao HPV

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14 Limitações e desafios

• Diversa variação de ensaios

• Sensibilidade e especificidade diferentes

• Falha de leitura dos controles disponíveis, GQ, CQ

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15 Uso prático de métodos de teste de DNA para HPVClínico

• Triagem

• Triagem de exame Papanicolau equivocados / com valores limítrofes

• Monitoria de tratamento pós-displasia

Epidemiologia

• Áreas geográficas de vigilância- Prevalência do HPV- Prevalência do genótipo do HPV

Vacina

• Execução pré e pós vacina- Estudos de eficácia para a vacina- Diferentes regiões em todo o mundo

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Obrigado

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