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Caratterizzazione Fisico–Chimica e morfologica dei Materiali:
Spettroscopia Infrarossa: Microscopia, SPR-FT
Siena 23 Novembre 2008
Massimiliano Rocchia, PhDProduct SpecialistMolecular SpectroscopyThermo Fisher ScientificStrada Rivoltana20090 Rodano- Mi-ItalyWeb: http://www.thermo.come-mail: massimiliano.rocchia@thermofisher.com
2
SPR (Surface Plasmon Resonance spectroscopy)
Spettroscopia infrarossa• Introduzione e basi teoriche
Tecniche di Campionamento Macro• Trasmissione• Riflessione (Speculare – Diffusa)• Riflessione totale attenuata
Strumetazione infrarossa• Strumenti dispersivi e strumenti FT
Interpretazione Spettrale
Microscopia Infrarossa
Sommario
3
Spettroscopia
La Spettroscopiaè una scienza che studia l’interazione di due entità diverse, ma
nello stesso tempo simili tra loro
MATERIA RADIAZIONEELETTROMAGNETICA
4
Radiazione Elettromagnetica
Radiazione o Onda Elettromagnetica è costituita da due campi oscillanti perpendicolari tra loro, un campo elettrico ed uno magnetico, che si propagano nel vuoto:
5
Proprietà della radiazione elettromagnetica
La radiazione o onda elettromagnetica è descritta da:
Lunghezza d’onda Lunghezza d’onda
Ampiezza
Distanza tra due massimi.
(HZ) Numero di oscillazioni complete nell’unità di tempo
(cm-1) Numero di onde nell’unità di lunghezza – L’inverso della lunghezza d’onda e proporzionale alla frequenza
Lunghezza d’Onda λ
Frequenza ν
Numero d’Onda ν
(nm) Tempo necessario a compiere un’oscillazione completa o a percorrere uno distanza pari a λ
Velocità: dipende dal mezzo in cui si propaga la radiazione.Velocità nel vuoto c ≅ 3.108 m/s.
In un altro mezzo:vmedia = c/n
dove n è l’indice di rifrazione del mezzo
Periodo T
6
Spettro Elettromagnetico
7
Natura corpuscolare: Fotoni
Una radiazione elettromagnetica che interagisce con la materia deve essere vista nella sua natura corpuscolare e quindi come flusso di particelle aventi energie discrete, chiamate FOTONI.
L’energia di un fotone è direttamente proporzionale alla frequenza dell’onda, secondo l'equazione:
E = h X ν = hc/ λ = hcνdove h è la costante di Planck; h = 6.63*10-34 Joule*s
Il carattere corpuscolare della radiazione consente di studiare gli scambi di energia della luce con la materia
8
Interazione Radiazione Elettromagnetica - Materia
Postulati di Bohr:
• La materia (sistemi atomici) esiste in stati stabili
• L’assorbimento o l’emissione di energia elettromagnetica avviene quando passa da uno stato di energia ad un altro
• Il processo di assorbimento o emissione corrisponde ad un fotone di
energia hν = E2-E1 differenza di energia tra due strati
Gli stati energetici della materia possono essere modificati solo da quei fotoni che hanno un energia corrispondente alla differenza tra due stati
9
Interazione Radiazione Elettromagnetica - Materia
E0 E1 E2 E3
Fotone di enegia hνtale che Ex-Ex-1= hν
Nucleo
Fotone di enegia hν1 tale che Ex-Ex-1≠ hν1
10
Condizioni per l’assorbimento in infrarosso
νλ
hhcE ==ΔCondizione di risonanza
L’energia dei fotoni deve essere uguale all’energia necessaria a far
passare la molecola dallo stato vibrazionale n=0 a quello n=1
1
Il momento dipolaredi una molecola deve
cambiare a seguito della transizione vibrazionale
2
11
Condizioni per l’assorbimento in infrarosso
Cl H
N NNessun segnale IR attivo
Momento dipolareL’intensità dell’assorbimento infrarosso dipende dall’efficacia con cui l’energia del fotone viene trasferita alla molecolaQuesto dipende dal cambiamento del momento di dipolo indotto dalla vibrazione
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Regione infrarossa dello spettro elettromagnetico
La regione infrarossa dello spettro elettromagnetico si
occupa delle vibro-rotazioni degli atomi costituenti le
molecole:
• Organici ed inorganici• Solidi, liquidi e gas
• Campionamento micro¯o• Analisi quantitative&qualitative
Scissoring
(forbice)
Rocking
(dondolo)
Twisting
(torsione)Wagging
(agitare)
Stretching
asimmetrico
Stretching
simmetrico
13
Regione infrarossa dello Spettro Elettromagnetico
UV Visibile NEAR MID
vibrazioni di overtonevibrazioni di combinazione
vibrazioni fondamentalivibrazioni di fingerprint
vibrazioni di scheletro
FAR
Nella regione infrarossa si utilizzano i numeri d’onda (cm-1) in quanto si ha la necessità di utilizzare la frequenza (grandezza proporzionale all’energia) l’unità di misura in HZ non viene utilizzata
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Sommario
Spettroscopia infrarossa• Introduzione e basi teoriche
Strumetazione infrarossa• Strumenti dispersivi e strumenti FT
15
Spettrofotometri IR Dispersivi
Grating
Detector
IR Source
Reference
Sample
Chopper
Slits
16
Strumentazione IR Trasformata di Fourier
Detector
Sorgente IR
Specchio fisso
x 0 -x
Beamsplitter
Laser diodeHe-Ne laser
Campione
Specchio mobile
17
Funzionamento Interferometro Michelson
Differenza di fase = 0
Specchio Fisso
Beamsplitter
x 0 -x
Specchio Mobile
Differenza dicammino ottico:
SF = SMZERO PATH
DIFFERENCE
Detector IR
18
Funzionamento Interferometro Michelson
Differenza di fase = 1/4λ
Specchio Fisso
Beamsplitter
Specchio Mobile
Differenza di camminoottico: SF = SM - 1/8λ
Detector IR
x 0 -x
19
Funzionamento Interferometro Michelson
Differenza di fase = 1/2λ
Specchio Fisso
Beamsplitter
Specchio Mobile
Differenza di camminoottico: SF = SM - 1/4λ
x 0 -x
Detector IR
20
Dal dominio del tempo a quello delle frequenze: FTV
olta
ggio
Differenza di cammino ottico (ritardo)
λInterferogramma di una sola frequenza
λ/4
λ/2
21
Dal dominio del tempo a quello delle frequenze: FTV
olta
ggio
Differenza di cammino ottico (ritardo)
FT
Voltaggio
FT
FT
Frequenza
22
Dal dominio del tempo a quello delle frequenze: FT
FT
Interferogrammaregione infrarossa
Spettro infrarosso
23
Strumentazione IR Trasformata di Fourier
Rapporto I/Io x 100
Interferogrammadel bianco
Curva I
FFT
Interferogrammadel campione
Curva Io
FFT
Signature: Not signed
0.4 0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
2.0
2.1
2.2
Abso
rban
ce
5000 6000 7000 8000 9000 10000 Wavenumbers (cm-1)
24
Vantaggi spettrofotometri FT
Vantaggio JacquinotL’energia che arriva al rivelatore è molto elevata
(assenza di fenditure, monocromatori, filtri)Come conseguenza il rapporto segnale/rumore è migliore
Vantaggio ConnesLa presenza del laser He-Ne permette di avere
un riferimento interno, ad ogni scansione, per la scaladelle frequenze dell’interferogramma
Precisione 0.01cm-1
25
Vantaggi spettrofotometri FT
Vantaggio FelgettAcquisizione di uno spettro estremamente rapida
Possibilità di effettuare più scansioni
(il tempo di una scansione completa è pari al tempo che un sistema dispersivo impiega a registrare una porzione di spettro
uguale alla banda passante)
Possibilità di mediare le scansioni migliorando il rapportosegnale/rumore
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Sommario
Spettroscopia infrarossa• Introduzione e basi teoriche
Tecniche di Campionamento Macro• Trasmissione• Riflessione (Speculare – Diffusa)• Riflessione totale attenuata
Strumetazione infrarossa• Strumenti dispersivi e strumenti FT
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Polystyrene measured as a film
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
%T
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)
Metodi di Analisi: Trasmissione
A: assorbanza
T: trasmittanza
I0, I: potenze radianti
a: assorbanza specifica
b: cammino ottico
C: concentrazione
ε: assorbanza specifica molare
M: molarità
I0 I
T= I /I0
A=log(Io/I )
bMabCIIlogTlogA 0
1010 ε===−=
Legge di Lambert-Beer
cam
pion
e
Polystyrene measured as a film
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
Abs
orba
nce
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)
Film di polistirene
A %T
28
Metodi di Analisi: Riflessione Speculare
Dipende dall’indice di rifrazione (n) e dal coefficiente di estinzionemolare (k)
Si può correggere tramite la trasformata di Kramers-Kronig chetiene in considerazione i parametri sopra citati e permette di avere
uno spettro simile a quelli di trasmittanza
Sostanza che assorbe
(e riflette)
Riflessione assorbimentoRAS
Riflessione speculare
Sostanza che assorbe e
riflette
Metallo che riflette
θi θrθi=θr
Es: polimeri accoppiati con alluminio, vernici...
29
Metodi di Analisi: Riflessione Speculare
0.2
0.4
0.6
0.8
Log(
1/R
)
Polimetil Metacrilato Riflettanza Speculare KK
Polimetil Metacrilato Riflettanza Speculare
4
6
8
10
1000 1500 2000 2500 3000 3500
30
Metodi di Analisi: Riflessione Diffusa
SDDD
D• Per polveri o solidi che provochinoriflessione della radiazione in tutte le
direzioni (scattering)• Preparazione minima del campione• Elevata sensibilità (fino alle ppm)
• Adatta a campioni di vario tipo
Occorre eliminare la componente speculare in quanto altera le misure non essendo assrobita dal campione.
Lo spettro di riflessione diffusa può essere manipolato con la funzione di Kubelka Munk per ottenere spettri simili a quelli in
trasmittanza
31
Metodi di Analisi: Riflessione Diffusa
sK
RRRf =
−=
∞
∞∞ 2
)1()(
Kubelka Munk
Csa
RRRf 302.2
2)1()( =
−=
∞
∞∞
R∞ Riflettanza diffusa di un campione spessore infinito rispetto ad
un bianco non assorbente
K Coefficiente di assorbimento
s Coefficiente di scatteringPer basse concentrazioni
K = 2.302 a Ca assobanza specifica
C concetrazione
32
Metodi di Analisi: Riflessione Totale Attenuata (ATR)
Angolo criticoSorgente
nn11
nn22 n2n1>
θ
Indice dirifrazione
33
Metodi di Analisi: Riflessione Totale Attenuata
Campione in contatto con un cristallo ad elevato indice di rifrazione
Misura Superficiale
A seconda della dimensione del cristallo possono essere:Singola RiflessioneMultipla Riflessione
34
Metodi di Analisi: Riflessione Totale Attenuata
L’intensità dell’onda evanescente diminuisceesponenzialmente allontanandosi dalla superficie
Iev = Io exp [-z/dp]
z distanza dall’interfaccia (normale alla superficie)Io Intensità a z = 0,
dp distanza alla quale l’intensità dell’onda evanescente diminuisce di un valore rispetto al suo valore originario
dove n1 e n2 sono rispettivamente gli indici di rifrazione del cristallo e del solido/liquido da analizzare
θ angolo di riflessione
21
221
221
0
)(2 nsennd p
−=
θπ
λ
35
Metodi di Analisi: Riflessione Totale Attenuata
Parametri che influiscono sugli spettri in Riflessione totale attenuata
Indice di rifrazione del cristallo e del campione
Numero di riflessioni
Angolo di incidenza
Contatto tra cristallo e campione (Pressione)
36
Riflessione Totale Attenuata: Indice di rifrazione
ZnSe (45o) Esano RI = 2.4
Ge (45o) Esano RI = 4.0Si (45o) Esano RI = 3.4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ass
orba
nza
2700 2800 2900 3000 3100 3200 Numeri d’onda (cm-1)
37
Riflessione Totale Attenuata: Angolo di riflessioneA
bsor
banc
e
Ge 35° PP/PMMA/PEGe 40° PP/PMMA/PEGe 45° PP/PMMA/PEGe 50° PP/PMMA/PE
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
0.0200.022
2800 2900 3000 3100 Numeri d’onda (cm-1)
Ass
orba
nza
38
Riflessione Totale Attenuata: Numero di riflessioni
Esano 12 riflessioni
Esano 10 riflessioni
Esano 1 riflessione
0.1
0.2
0.3
0.4
Ass
orba
nza
1340 1360 1380 1400
Numeri d’onda (cm-1)
39
Riflessione Totale Attenuata: Pressione
Alta pressione di contattoMedia pressione di contattoBassa pressione di contattoNessuna pressione di contatto
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Ass
orba
nza
2700 2800 2900 3000 3100 Numeri d’onda (cm-1)
Film di Polietilene
40
Riflessione Totale Attenuata: Cristalli
Range n Sensibile a: Durezza Range Ph
ZnSe 17000-650 2.4 Acidi e basiforti, agenti
complessanti(EDTA)
Bassa 5-9
Ge 5500-600 4 Acqua regia Media 1-14
Silicio 8300-660 3.4 HF e HNO3 Media 4-12
Amtir* 11000-700 2.5 Prolungataesposizione asoluzioni alcaline
Bassa 1-7
Diamante 4500-2500e 1667-33
2.37 K2Cr2O7,H2SO4 conc.
Alta <1;>14
* Amorphous material transmitting infrared radiation
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Sommario
Spettroscopia infrarossa• Introduzione e basi teoriche
Tecniche di Campionamento Macro• Trasmissione• Riflessione (Speculare – Diffusa)• Riflessione totale attenuata
Strumetazione infrarossa• Strumenti dispersivi e strumenti FT
Interpretazione Spettrale
42
Interpretazione Spettrale: Medio infarosso
Polistirene
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Tr
ansm
ittan
ce
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2000 2500 3000 3500 Wavenumbers (cm-1)
ZONA GRUPPI FUNZIONALI
ZONA IMPRONTA DIGITALE
43
Interpretazione Spettrale
HCO
Finger Print
44
Interpretazione Spettrale
http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/InfraRed/infrared.htm
45
Interpretazione Spettrale
Posizione IntensitàForma
Informazioni che un segnale infrarosso fornisce
46
Interpretazione Spettrale
Gruppi funzionali Frequenze(cm-1) Intensità Assegnazione Frequenze
(cm-1) Intensità Assegnazione
Alcani 2850-3000 str CH3, CH2 e CH2 o 3 segnali
1350-14701370-1390720-725
medmedwk
CH2 e CH3
deformazioneCH3 deformationCH2 rocking
Alcheni 3020-31001630-1680
1900-2000
medvar
str
=C-H & =CH2 (stretto) C=C (simmetrico intensitàridotta)
C=C asymmetric stretch
880-995780-850675-730
strmedmed
=C-H & =CH2
(out-of-plane bending)cis-RCH=CHR
Alchini 33002100-2250
strvar
C-H (stretto)C≡C (simmetrico intensitàridotta)
600-700 str C-H deformation
Areni 30301600 & 1500
varmed-wk
C-H (possibilità di molti segnali)C=C (in ring) (2 segnali)(3 se coniugato)
690-900 str-med C-H bending e modi di anello
Alcoli e Fenoli 3580-36503200-3550
970-1250
varstr
str
O-H (free), (stretto)O-H (H-bonded), solitamentelargoC-O
1330-1430
650-770
med
var-wk
O-H bending (in-plane)O-H bend (out-of-plane
http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/InfraRed/infrared.htm
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Interpretazione Spettrale
Ammine 3400-3500 (Dil. Sol.)
3300-3400 (Dil. Sol.)1000-1250
wk
wkmed
N-H (ammine primarie), 2 segnaliN-H (ammine secondarie)C-N
1550-1650660-900
med-strvar
NH2 scissoring (ammine primarie)NH2 e N-H wagging(shift per legameidrogeno)
Aldeidi e Chetoni 2690-2840(2 segnali)1720-17401710-1720
1690 1675 1745 1780
medstrstr
strstrstrstr
C-H (aldeide C-H)C=O (aldeide satura) C=O (chetone saturo)
Aril chetoneα, β-insaturociclopentanoneciclobutanone
1350-13601400-1450 1100
strstrmed
α-CH3 bendingα-CH2 bendingC-C-C bending
Acidi carbossilicie derivati
2500-3300 (acidi) su C-H1705-1720 (acidi)1210-1320 (acidi)
1785-1815 (acil) 1750 & 1820 (anidridi)
1040-1100 1735-1750 (esteri)
1000-1300 1630-1695(amidi)
strstrmed-str
strstrstrstrstrstr
O-H (molto largo)C=O (legame idrogeno) O-C (a volte 2 segnali)
C=OC=O (2 segnali)
O-CC=O
O-C (2 segnali)C=O (amide primaria)
1395-1440
1590-1650
1500-1560
med
med
med
C-O-H bending
N-H (amide primaria) N-H (amide secondaria)
http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/InfraRed/infrared.htm
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Sommario
Spettroscopia infrarossa• Introduzione e basi teoriche
Tecniche di Campionamento Macro• Trasmissione• Riflessione (Speculare – Diffusa)• Riflessione totale attenuata
Strumetazione infrarossa• Strumenti dispersivi e strumenti FT
Interpretazione SpettraleMicroscopia Infrarossa
49
Cosa è Possibile Analizzare?
Microscopia ottica con analisi Infrarossa
Particelle solide
Fibre
Superfici
Laminati
Film multistrato
Inclusioni
Difetti
Impurezze
50
CAMPIONE
SUPPORTOSUPPORTO
1 - TRASMISSIONE2 - RIFLESSIONE
3 - RIFLESSIONE ATR
MICRO CRISTALLO ATR
Tipi di Misure in Microscopia IR
51
TRASMISSIONE:Particelle appiattiteFibre appiattiteLaminati e sezioni multistratoInclusioni asportate da manufattiImpurezze prelevate da prodottiRisoluzione spaziale > 8-10 μm
%T
RIFLESSIONE:Particelle appiattiteSuperfici riflettentiInclusioni asportateImpurezze prelevateRis Sp > 10 μm
%R
MICRO ATR:Particelle tal qualiFibre tal qualiSuperfici tal qualiInclusioni tal qualiImpurezze tal qualiRis Sp > 10 μm
Micro ATR
Tipi di Misure in Microscopia IR
52
Mascheramento del Campione
Quando il raggio Infrarosso è di dimensioni più grandi dell’area di interesse (*):
• Lo spettro che si ottiene include informazioni dalla zona diinteresse analitico ma anche da quelle adiacenti
• Questo effetto indesiderato è detto “contaminazione spettrale”e può pregiudicare la qualità dell’analisi fino alla scorrettainterpretazione
Esempio:
(*) Nel punto di fuoco ottimale del microscopio FT-IR il raggio IR viene focalizzato a circa 150 micron di diametro. Per analizzare campioni di dimensioni più piccole (il 90% dei casi) ed evitare “contaminazione spettrale, occorre mascherare.
Film polimerico di Polipropilene
Inclusione (?)
53
Mascheramento del Campione
Analisi dell'inclusione SENZA APERTURE
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
%T
500 1000 1500 2000 2000 3000 4000 Wavenumbers (cm-1)
???
54
Mascheramento del Campione
Analisi dell'inclusione CON APERTURE: Polistirene HQI 99%
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%T
500 1000 1500 2000 2000 3000 4000 Wavenumbers (cm-1)
Film estruso di polipropilene
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%T
500 1000 1500 2000 2000 3000 4000 Wavenumbers (cm-1)
Apertura
Polipropilene
Polistirene
55
Apertura
Lo spettro IR viene espresso in Numeri d’Onda• Il campo spettrale IR, espresso in Numeri d’Onda
è compreso tra 4000 e 400 cm-1
• Espresso in Lunghezza d’Onda (l’IR è nell’ordine dei Micron) il campo spettrale risulta essere compreso tra 2,5 e 25 micron
In microscopia FT-IR, un’apertura di dimensioni molto piccole rappresenta un limite fisico:
• Quando le sue dimensioni raggiungono valori prossimi alle lunghezze d’onda della radiazione incidente
• Le lunghezze d’onda superiori alle dimensioni dell’apertura nonpossono attraversarla e quindi non sono rilevate
56
Apertura
Wavenumbers (cm-1)
apertura 20 x 20 micron50
100
%T
50
100
%T
50
100
%T
50
100
%T
1000 1500 2000 2000 3000
10μm7μm
apertura 15 x 15 micron
apertura 10 x 10 micron
apertura 7 x 7 micron
57
Modificazione superficiale con risoluzione micrometrica Analisi puntuale
4 3 2 1
Immagine da microscopio ottico
Immagine da microscopio elettronico
Materiale Silicio poroso terminato con idrogenoLa microscopia FTIR mi permette di ottenere informazioni sulle modificazioni chimiche successive al trattamento subito dal materiale (bombardamento con elettroni) con risoluzione micrometrica
Finestra 100X100 micron
58
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
Mappa 1,1 X 1,2 mm2 (cornice rossa)
• Finestra di Campionamento100X100 μm2
• Step 50 μmFinalità della misura:
• Verificare il numero dicomponenti della vernice e l’omogeneità degli stessi sullasuperficie
Capacità di abbinare l’Informazione chimica (spettri infrarossi) e l’informazione spaziale (distribuzione componenti)
59
Dalla mappatura si risale ai costituenti della vernice che sono stati identificati come:
• Polifenilensolfuro PPS• Politetrafluoroetilene PTFE
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
60
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
nF
FF
F
S
n
Mappa di correlazione spettrale ottenuta sulla base dello spettro del PTFE Rosso nella mappa correlazione ottima rapporto pari a 1
Blu nella mappa correlazione molto bassa
rapporto pari a 0
1
0
61
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
Sovrapposizione dell’immagine chimica con l’immagine otticaGarantisce l’individuazione immediata della distribuzione dei singoli componenti
62
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
40 2030 15 10μm
Corrosione di un bronzoMappa in ATR
5350 data points
Universita’ di BolognaTecnologie per la Conservazione dei Beni CulturaliProf. Rocco Mazzeorocco.mazzeo@unibo.it
Informazione chimica (spettri infrarossi) eInformazione spaziale (mapping)
63
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
Bronze (no absorption) correlationChemical image
Azurite 950 cm-1 region chemigramChemical image
Malachite 1040 cm-1 region chemigramChemical image
Cellulose correlationChemical image
Embedding resin correlationChemical image
Abso
rban
ce (
Abs
)
0.00
0.05
0.10
3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
Position (micrometers)=12 µm ;331 µm
Abso
rban
ce (
Abs
)
0.00
0.05
0.10
3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
Position (micrometers)=12 µm ;331 µm
64
Compressa farmaceutica
ORIGINAL SPECTRUM
0.8
1.0
1.2
1.4
Abs
KRAMERS KRONIG CORRECTED
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Abs
Acetylsalicylic acid; Aspirin
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Abs
1000 1500 2000 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)
* Position (micrometers)=-16228 µm ;977 µm
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Abs
Caffeine
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Abs
1000 1500 2000 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)
* Position (micrometers)=-13356 µm ;-1551 µm
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
2.0
2.1
2.2
Abso
rban
ce
1000 1500 2000 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)
Spectrum from map and Caffeine KK corrected and Acetylsalicylic acid
Excipient
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
65
Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche
28 spettri ad ognistep tavolino
14 elementi
• Due di 14 elementi• 28 elementi totali
Ingrandimentoobiettivo
Dimensionepixel
(microns)
15x 20
32x 9
Detector Imaging
66
Sommario
Spettroscopia infrarossa• Introduzione e basi teoriche
Tecniche di Campionamento Macro• Trasmissione• Riflessione (Speculare – Diffusa)• Riflessione totale attenuata
Strumetazione infrarossa• Strumenti dispersivi e strumenti FT
Interpretazione Spettrale
Microscopia Infrarossa
SPR (Surface Plasmon Resonance spectroscopy)
glassprism
p-polarized
incident b
eam
reflected beam
SPR
67
Angolo SPR(+bassa %R)
450Å lamina di oro
Luce polarizzata p
Angolo critico
Come funziona la tecnica SPR
(riflessione interna)
Condizione 3 Raggiungere l’angolo SPR Angolo a cui l’energia della radiazioneincidente polarizzata p viene assorbita dagli elettroni liberi del metallo(oro) e si genera un minimo nello spettro di riflessione
Condizione 1 Luce polarizzata p incidente sulla superficie
Condizione 2 Condizione di riflessione totale interna
L’angolo SPR dipende da:1 - Proprietà del film 2 - Lunghezza d’onda della luce incidente3 - Metallo utilizzato4 - Indice di rifrazione ad entrambi i lati del film metallico
68
Dipolo immagine nei metalli
Carica positiva vicino alla superficie:Attrae gli elettroni liberi verso la superficie
Risultato parziale carica negativa verso la superficie del metallo
Fuori dalla superficie si crea un campo elettricoprodotto dalla ridistribuzione delle cariche.
.
69
Dipolo immagine nei metalli
All’interfaccia il campo elettrico risultante ènullo
Il dipolo immagine cancella il dipolo reale
Dipolo parallelo alla superficie:
Dipolo reale
Dipolo immagine
70
Dipolo immagine nei metalli
μeffective=2μ0
μ0
μimage
Il dipolo immagine è orientato nella stessadirezione del dipolo reale
Momento di dipolo totale doppioIl metalllo amplifica il momento di dipolo
Dipolo Reale
DipoloImmagine
Dipolo perpendicolare alla superficie:
71
Come può essere sfruttata la tecnica SPR Monitoraggioangolo SPR
ΔΘ
0%
20%
40%
60%
80%
100%
50 51 52 53 54 55 56 57 58Angolo di incidenza
Rifl
ettiv
ità
Solo oro
+5 nm Coating
Lunghezza d’ondacirca 12500 cm-1
Shift dell’angolo di minima riflessione
Elevata precisione nella misura dell’angolo di incidenzaNecessità di misurare angoli inferiori a 0.001 grado per monitoraredeposizioni di monolayer
72
Come può essere sfruttata la tecnica SPR Monitoraggiominimo di riflettività mediante FTIR
Il monitoraggio della lunghezza d’onda del minimo di riflettività presentaalcuni vantaggi rispetto all’angolo Uno shift di alcuni numeri d’ondaequivale ad una variazione dell’angolo di 0.001 gradoLa tecnica FTIR garantisce una precisione migliore di 0.5cm-1 e quindisensibilità elevatissime FT-SPR permette sensibilità minori di 1 Å
73
Come può essere sfruttata la tecnica SPR Monitoraggiominimo di riflettività mediante FTIR
Variazione angolo vs variazione lunghezza d’onda
74
Applicazioni della tecnica SPR
Probe immobilizzato Analita Dimostrata
DNA DNA
RNA
Proteina
Proteina
Proteina
DNA
DNA
Peptide
Proteina
75
NIR Beam from FT-IR
polarizer
lens
lens
InGaAsdetector
lens
mirror
prism
gold coat glass slide
aperture
Samplein / out
Strumentazione SPR
76
FT-SPR Deposizione di multistrati di biopolimeri
Deposizione di 2 biopolimeri Acido Poli-glutammico (MW 70.500) e Poli-lisina (MW 48.100) 2 soluzioni 10mg/ml in 100mM di soluzione buffer a pH 8Il chip d’oro è stato preparato utilizzando un SAM terminato con un tioloin testa ed una funzionalità carbossilica in coda (soluzione 1mM per 2h)La deposizione dei bipolimeri è avvenuta per cicli successiviDescrizione di un singolo ciclo:
• Riempimento cella con acido poliglutammico• Incubazione 10 minuti• Risciacquo con soluzione buffer• RIempimento cella con polilisina• Incubazione 10 minuti• Risciacquo con soluzione buffer
SPR
77
FT-SPR Multistrati di biopolimeri
SAM
Au
pLys
pGlu
pLys
pGlu
pLys
pGlu
pLys
pGlu
pLys
pGlu
1: t = 21.690 min.2: t = 25.778 min.3: t = 29.989 min.4. t = at 31.697 min.5. t = 36.822 min.6: t = 38.834 min.7: t = 45.179 min.8: t = 49.999 min.9: t = 54.515 min.
10: t = 58.178 min.11: t = 60.009 min
Total Δt = 60.009 – 21.690 = 38.319 min
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
% R
iflet
tanz
are
lativ
a(P
/S)
7000 8000 9000 10000 11000 Numeri d’onda (cm-1)
123 4
56
78
9
1011
78
Analisi in dinamica del binding Biotina T7-Streptavidina
TTTTTTT
TTTTTTT
Biotin-T7 bound to Streptavidin on SPRchip™Au
O OO ON O OO ON
S S
Streptavidin
Maleimide
T7
Biotin
Linker
TTTTTTT
TTTTTTT
SA-Maleimide probe covalently linked toSPRchip™
Au
O OO ON O OO ON
S S
Streptavidin
Maleimide
Linker
T7
Biotin
Biotin-T7 Analyte
mw = 2400
Multilayer binding structure showingBiotin-T7 bound to streptavidin on SPR chip.
79
Monitoraggio in real time del binding
Interazione con Biotina 7T (oligonucleotide biotinilato) 500nM
Buffer Biotina T7 Buffer
Biotina T7
Buffer
Tempo (sec)
80
Monitoraggio in real time del binding
Interazione con Biotina 7T (oligonucleotide biotinilato) 500nM – Streptavidina giàsaturata con biotina (non con oligonucleotide)
Tempo (sec)
81
Ibridizzazione DNA
Probe: 5’-HS-YYY GTG TTA GCC TCA AGT G-3’Analita non complememtare: 5’-AGA CTC TGA CTC AGT G-3’Analita complementare: 5’-CAC TTG AGG CTA ACA C-3’
Shift di 34.5 cm-1 corrispondente ad un assorbimento di un DNA con MW di 5300
82
Wegner GJ, Lee HJ, Corn RM, 2002. Anal. Chem. 74:5161-8
FLAG ancorato sulla superficie
83
Legame tra anticorpo-FLAG e il probe FLAG
0
5
10
15
20
25
30
35
40
9000 9200 9400 9600 9800
Wavenumber (cm-1)
SPR In
tens
ity
0 nM10 nM25 nM50 nM75 nM100 nM
Nexus™ 870
Concentrazione di anticorpo crescente
84
Shift del picco a ricoprimenti crescenti di anticorpo
Nexus™ 870
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 50 100 150 200 250 300
Anti-FLAG Ab Concentration (nM)
Rel
ativ
e su
rfac
e co
vera
ge
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-100 50 100 150 200 250 300
Raw data peak shifts
SPR
Pea
k Sh
ift c
m-1 Concentration (nM)
Langmuir di adsorbimento possibilità di determinarel’affinità dell’anticorpo