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REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 40, nro. 2 DE 2011

Rev. Colomb. Quím., 2011, 40(2): 149-164

INMOVILIZACIÓN DE LIPASA de Candida antarctica SOBRE SOPORTES DE QUITOSANO-GELATINA

IMMOBILIZATION OF LIPASE FROM Candida antarctica ON CHITOSAN-GELATIN SUPPORTS

IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE DE Candida antarctica EM SUPORTES DE QUITOSANA-GELATINA

Sandra X. Rangel1, Jorge García1, Carlos E. Orrego2,3

Recibido:15/03/11-Aceptado:09/09/11

Palabras clave: inmovilización, gela-tina,quitosano,lipasadeCandida antarc-tica, gel iónico, atrapamiento, adsorción,actividadenzimática,sistemabiocatalítico.

AbstRAct

A set of chitosan-gelatin films were pre-paredbyvaryingthechitosan-gelatinra-tiobetween1:2,1:5and1:10,withtotalconcentrationofbiopolymersfrom3,0%3,5%,4,0andpHof5,5.Wecarriedoutthedehydrationof thesupports throughcryoconcentration (successive freezethawing)andconvectivedryingwithair.Immobilization of lipase from Candida antarcticawasperformedonan ionica-lly crosslinked hydrogel with chitosanby entrapment and adsorption, gettingthebestresultsintermsofenzymaticac-

Resumen

Sepreparóunaseriedepelículasdequi-tosano-gelatina variando la relación delos constituyentes, quitosano-gelatinaentre1:2,1:5y1:10,conconcentracióntotaldebiopolímerosentre3,0%,3,5%,4,0%ypHde5,5.Sedeshidrataron lossoportes por crioconcentración (conge-laciones descongelaciones sucesivas) ysecadoconvectivoconaire.La inmovi-lizacióndelipasadeCandida antarcticaserealizósobreunhidrogelentrecruzadoiónicamente con quitosano por atrapa-mientoyporadsorción; losmejores re-sultadosencuantoaactividadenzimáticayreutilizacióndelsoporteseobtuvieronconelmétodoporatrapamiento.Selle-varonacabopruebasdecaracterizaciónfisicoquímica de los soportes, actividad delsistemabiocatalíticoyestabilidad.

1 DepartamentodeIngenieríaQuímica,FacultaddeIngeniería,UniversidadNacionaldeColombia,sedeBogotá,carrera3045-03,BogotáD.C.,Colombia.

2 InstitutodeBiotecnologíayAgroindustria,DepartamentodeFísicayQuímica,UniversidadNacionaldeColombia,sedeManizales,CampusLaNubiakm4VíaalMagdalena,AA127,Manizales,Colombia.

3 corregoa@unal.edu.co

tivity and reuseof the supportwith theentrapmentmethod.Testsofphysicoche-mical characterization of the supports,biocatalyticsystemactivityandstabilitywerecarriedout.

Key words:Immobilization,gelatin,chitosan, lipase fromCandida Antarcti-ca, ionicgel,trapping,adsorption,enzy-maticactivity,biocatalyticsystem.

Resumo

Uma serie de filmes de gelatina quitosana foi preparada variando a proporção doscomponentes,aquitosana-gelatinaentre01:02,01:05e01:10,comconcentraçãototaldebiopolímerosde3,0%,3,5%4,0%epHde5,5.Realizou-seadesidrataçãodossuportesporcrioconcentração(ciclossucessivosdedescongelamento-congela-mento)esecagemporconvecçãocomoar.AimobilizaçãodelipasedeCandida antarctica foirealizadaemumhidrogelionicamenteentrecruzadocomquitosanaporadsorçãoeatrapamento,obtendoosmelhoresresultadosemtermosdeativi-dadeenzimáticaereutilizaçãodosuportecom o método de atrapamento. Foramrealizados testes de caracterização físi-co-químicadossuportes,daatividadedosistemabiocatalíticoedaestabilidade.

Palavras-chave: Imobilização, qui-tosana, gelatina, lipase de Candida an-tarctica,atrapamento,adsorção,ativida-deenzimática,sistemabiocatalítico

IntRoDuccIÓn

La catálisis enzimática en medios noacuososhaadquiridoconsiderableimpor-tanciaporsuaplicaciónenlafabricaciónde ingredientes, productos intermedios

y finales de muy variadas actividades industriales(1).Elbioprocesamientoenfase no acuosa es muy interesante por-que favorece la estabilidad térmica delos sistemas biocatalíticos, predominanlasreaccionesdesíntesissobrelasdehi-drólisis(2),sepuedemanipularlaselec-tividaddelasenzimasporlaeleccióndelmedio y facilita la recuperación de losproductosdebidoaqueseseparansim-ple y económicamente del solvente porevaporación(3).

Para usar los catalizadores enzimá-ticos repetidamente, se deben llevar acabo procesos de inmovilización quese pueden aplicar a procesos por lotesocontinuos.Lainmovilizacióndeenzi-masconsisteenlarestriccióndeliberadade la movilidad de la enzima. Despuésde inmovilizadas, las enzimas quedanlocalizadas en una región definida del espacio,limitadaporbarrerasmaterialesoelectrostáticas,queseparanfísicamen-te la enzima del seno del medio de re-acción,peropermeablesalasmoléculasde reactivos y de productos. La inmo-vilizaciónpuede servirparadosobjeti-vos:mejorarlaestabilidaddelaenzimayreducirsuconsumo,yaquepuedeserretiradayreutilizadaenvariosciclosdereacciones. El grado de mejora de estaestabilidad operacional depende de laestructura de la enzima, del método deinmovilizaciónydeltipodesoporte(4).

Los métodos de inmovilización deenzimaspuedenserdiferenciadosendoscategoríasgenerales:porretenciónfísicaymedianteenlacequímico(5).Laadsor-ción,queformapartedelaprimeracate-goría,eselmétodomássimpleeinvolu-cra interacciones superficiales reversibles entrelaenzimayelmaterialdesoporte.

Se ha observado que la inmovilizaciónpor adsorción no covalente es muy útilensistemasnoacuosos,enloscualesladesorciónpuede serdespreciadadebidoa la baja solubilidad de enzimas en es-tos disolventes (6, 7). Otro método de inmovilizaciónfísicaeselatrapamientoenmatrices,enelcuallasolucióndeen-zima se mezcla con un fluido polimérico que luego se solidifica. Ejemplos carac-terísticosdeeste tipode inmovilizaciónson el atrapamiento en geles de polisa-cáridoscomoalginatos,k-carragenanos,agar,quitosanoyácidopoligalcturónicouotrasmatricespoliméricascomogelati-na,colágenoypolivinilalcohol(8,9).

Elquitosanoesunaminopolisacári-do[(1-4)-2-amino-2-deoxi-b-D-glucano]obtenido por N-desacetilación alcalinade la quitina. Es uno de los polisacári-dosmásampliamentedistribuidosen lanaturaleza.Noestóxicoyhasidoutili-zadoparalainmovilizacióndeenzimas,en particular lipasas, no solo porque sumétododeobtenciónessimple,sinotam-biénporquebrindapropiedadesfísicasyquímicas de interacción enzima-soporteinteresantesparallevaracaboreaccionesbiológicas con buen grado de eficiencia y actividadenzimática(10).

Laseleccióndelquitosanocomoso-porteparalainmovilizacióndeenzimasen este estudio se justifica por su afini-dadconlasproteínas,lapresenciaensusmoléculas de grupos amino reactivos,subiocompatibilidadyporquesepuedemoldear en distintas formas. La forma-cióndehidrogeleshíbridosdequitosanoconotrosbiopolímerospuedeincremen-tarladensidaddelgel,mejorarsuresis-tencia mecánica y, consecuentemente,ampliar susposibilidadesdeaplicación.

Estoscomplejospolielectrolíticossefor-man por las interacciones iónicas entrelosgruposaminocargadospositivamen-tedelquitosanoconlascargasnegativas(talescomolasdelosgrupossulfónicosycarboxilos)deotrosbiopolímeros.Entrelosbiopolímerosquesehanusadoparacombinarconelquitosanoseincluyenlagelatina,elcolágeno,elcarragenano,elalginato,elacoholpolivinílicoy lacar-boximetilcelulosa. La gelatina contienegruposcarboxiloensuscadenasprinci-palesytieneelpotencialdeestablecerin-teraccionesasociativasconelquitosanodebidoasucapacidaddeformarpuentesdehidrógenoconeste,dandolugaraunaestructura reversible de hidrogel que sehadenominadoderedpoliméricahíbrida(11).

Layemadehuevoexpuestaatempe-raturas por debajo de -6 °C experimenta gelificación (12). De forma similar, las solucionesacuosasdemuchospolímerossintéticosynaturalestalescomoalcoholpolivinílico (PVA), quitosano, xantano,goma locust, amilopectina, amilasa ymaltodextrinasexperimentancambiosfí-sicoscomoresultadodesucongelación,almacenamiento en frío y subsecuentedescongelacióndesusdispersionesacuo-sas.Laestructura,estabilidadquímicaymecánicadeestoscriogelesy losmate-rialessecosqueseobtienenporsudeshi-dratación,loshaceútilescomomatricesatractivasparacromatografíaysoportesde nanopartículas biológicas, células yenzimas(13,14).Enlosmaterialesbasa-dos en quitosano, obtenidos por conge-lación y descongelación seguidas o nopor un proceso final de deshidratación, el tamaño de los cristales y, por tanto,el tamañopromedioy laorientacióndelosporosenelproductosecoseajustan

variandolatemperatura,lavelocidaddecongelaciónylostratamientosdeconge-laciónydescongelación.Otrofactorqueafectaeltamañodelporoylamorfologíadelosporosdeloscriogelessecoseslaconcentracióndelosmonómerosusadosen la dispersión precursora del criogel(14,15).

Enestetrabajo,apartirdeloshidro-geles híbridos de quitosano-gelatina, ymediantedistintas técnicasdedeshidra-tación, se prepararon y caracterizaronsoportes tipo película variando, en ladispersiónbiopoliméricainicial, larela-ciónmásicadelosbiopolímeros,sucon-centracióntotalyelpH.Enlosdistintostiposdesoportesobtenidosseinmovilizóuna lipasa de Candida antarctica tantopor adsorción como por atrapamiento.Paralamedidadelaactividaddelsiste-mainmovilizadoseutilizólareaccióndeesterificación de ácido oleico y butanol enhexano.

mAteRIALes Y mÉtoDos

materiales

Quitosano,conungradodede-acetilación76,2% y peso molecular de 602 KDa, en forma de hojuelas de la compañía Sig-ma-Aldrich(StLouis,MO,EE.UU.).Lagelatinacomercialdecarnazaderesfuedonadapor lacompañíaPROGEL(Em-presaProductoradeGelatinaS.A.),Ma-nizales,Colombia.Lalipasautilizadafuede Candida antarctica (Novozym 435),con una actividad específica lipolítica no-minalde910U/mgdesólidoyuncon-tenidoaproximadode9,02%deproteína(medidosegúnelanálisisdeBiuret),fueadquirida en Novo Nordisk A/S (Bags-vaerd, Denmark). Los demás reactivos

fuerongradoanalíticodediferentescasascomerciales.

Preparación de los hidrogeles biopoliméricos

Sepreparóunaseriededispersionesdegelatinayquitosanoadaptandoelproce-dimientodescritoporChenet al. (2003)(16). En ellas se varió la relación de los biopolímeros quitosano:gelatina (1:2,1:5y1:10)ysuconcentracióntotal(3,0,3,5 y 4,0% w/w). Por ejemplo, para lapreparacióndedispersiónderelación1:5quitosano:gelatina con una concentra-ción final de biopolímeros del 3%, se adi-cionaron0,5gdequitosanoen50mLdeaguay2,5gdegelatinaenotros50mLde agua.Al mezclar se obtuvieron 100mLdeunadispersiónconuncontenidodel3%enpesodebiopolímeros,enunaproporción1:5quitosano:gelatina.

Lasdispersionespoliméricasdequi-tosanoseprepararonensolucionesacuo-saspreviamenteaciduladashastapH2a3utilizandoHCl2M.Sehomogeneiza-ronporagitación(120rpm)durantedoshorasatemperaturaambiente(20°C).Alasdispersioneshomogéneasdequitosa-noseleselevóelpHhastaunvalorentre5,5-6,0 por adición lenta de NaOH 1 M conagitaciónde150rpm.Paralelamenteseprepararondispersionesdegelatinaenagua destilada a una temperatura entre 60 y80°C,yunpHde5,5.Despuésdeso-lubilizada lagelatina,sedejaronenfriarhastatemperaturaambiente.

Se mezclaron las dispersiones dequitosano y de gelatina ajustando supH hasta alcanzar tres niveles (5,5, 6,0 y 6,5). Estos sistemas compuestos se colocaron en cajas de Petri (10 cm de

diámetro interno,~50mLdedispersiónbiopolimérica) hasta que gelificaron (20 ºC); posteriormente fueron sometidas adeshidratación.

Procedimientos de deshidratación de los hidrogeles

Procedimiento de secado convectivo con aire. Los soportes gelificados de diferen-tesconcentracionesyrelacionesbiopoli-méricas sedeshidrataron exponiéndolosalambiente(20ºC,70-80%dehumedadrelativa)por72horas.

Procedimiento de secado por con-gelaciones-descongelaciones sucesivas (CDS). Los soportes gelificados fueron sometidos a una temperatura de -20 °Cdurante24horas,seguidosdedesconge-lamientoatemperaturaambientedurante4horas.Porefectodeladescongelaciónde los soportes gelificados, una parte de sucontenidodeaguasepudosepararyextraer fácilmente al inclinar la caja dePetriqueconteníalamuestra.Elexcesode humedad superficial del gel se retiró utilizando una servilleta de papel. Esteprocedimiento se repitió 5 veces (ci-clos).

Inmovilización de la enzima

Preparación de la solución enzimáti-ca. Se preparó una solución buffer deNaH2PO4.2H2OdepH7,5.Enestasolu-ciónsedisolviólaenzimacomercial(30mg/mL)a temperaturaambiente.Luegoseagitóa150rpmdurante30horas,secentrifugópor2horas(15,000Xg,tem-peratura ambiente 20 °C) y se filtró.

Inmovilización por atrapamiento. Seadicionólacantidadnecesariadesoluciónenzimáticaalamezcladelasdispersionesdequitosanoygelatinade formaque laconcentración final de la proteína en este sistemafuera5mg/mL.Elgelbiopolimé-ricoconlaenzimaatrapadasesometióadeshidrataciónporelprocedimientodes-crito de congelaciones-descongelacionessucesivas(CDS).

Inmovilización por adsorción. Sesu-mergieron1,78gdesoportesenunaso-luciónde5mg/mLdeenzimacomercialobtenidadeladilucióndelasoluciónen-zimáticaenlasoluciónbuffer.Despuésde24horasyagitaciónesporádica,seretiróelsoporte;ellíquidoresidualfuealmace-nadoparaanálisisdeproteína.EnseguidaserealizarondoslavadosconfosfatodesodioapH7,5dedosminutoscadauno.Luego,elbiocatalizadorsealmacenóenrefrigeración a 5 ºC. Las soluciones delavadofueronalmacenadasparadetermi-narsucontenidodeproteína.

Análisis del contenido de proteína. La confirmación de la proteína presente en la solución enzimática y la fijada en el soporte durante el procedimiento deinmovilización por adsorción (a partirde lasconcentracionesyvolúmenesdelas soluciones enzimática, de lavado ydelosexudadosdelasdescongelacionesde los geles secados por CDS) se cal-cularon a partir de ensayos de medidadeproteínausandoelmétododeBiuretaunalongituddeondade540nm,uti-lizando un espectrofotómetro de doblehazLambda20dePerkinElmerconunaceldade1cmyunacurvadecalibraciónhechaconalbúminadesuerobovino.

caracterización de los soportes y de los sistema biocatalíticos

Determinación de humedad de los sopor-tes. Semidiólahumedadporelmétodogravimétrico hasta peso constante a 95°C,utilizandounabalanzaanalíticaKernde0,1mgdeprecisión.

Pruebas cualitativas de estabilidad en medios acuosos y no acuosos. Te-niendoencuentaquelossoportessefa-bricaronconelpropósitodeevaluarsucapacidaddesermatricesdeinmoviliza-cióndelipasasenmediosacuososynoacuosos,sedecidióhacerensayoscuali-tativosquedieranunaideadesusresis-tenciasmecánicayquímica,ydelgradode hinchamiento último que mostrabanen un variado conjunto de disolventes,fijando algunas condiciones típicas de reacciones enzimáticas o protocolos deinmovilización. Así, para establecer laresistenciaa laagitación, sehizo la in-mersiónde losdistintos soportesen80mL de agua destilada (pH = 6,5) a di-ferentes velocidades de agitación (800rpm, 500 rpm y 120 rpm) por 8 horas.Para medir la estabilidad química serealizó la inmersión de los soportes endiferentes solventes a temperatura am-biente (HCl 5%, NaOH diluido, agua,ácido acético, glicerina, hexano, buta-nol,etanol,acetona,isopropanol,aceitedehiguerilla,aceitedepalma,biodiesel)por 48 horas. En todos los casos, al final de los ensayos se hizo una inspecciónvisualdelapreservación,desintegraciónparcialototal,odesaparicióndelosso-portesenelmedio.

Espectroscopia infrarroja por trans-formada de Fourier. Los diferentes so-portes fueron pulverizados (3 mg demuestra)ysemezclaroncon2gdeKBr

paraformarunapastillaqueseanalizóenunespectrofotómetroPerkinElmerSpec-trumBXII.

Análisis superficial por microscopía de fuerza atómica. La estructura super-ficial de las películas de geles secas, con osinenzima,sevisualizóutilizandounmicroscopio de fuerza atómica (ParkScientific Instruments, modelo Auto ProbeCP)enmodonocontacto(25ºC)conunasondaultra-lever.Lasimágenesfueronobtenidasenunaatmósferadehu-medad controlada aunavelocidadde1Hz,unáreadebarridode100µm2yunaresolución de 256×256 pixeles.

Determinación del área superficial. Las pruebas de área superficial se efec-tuaron en un analizador de porosidad yárea superficial ASAP 2020 (Microme-ritics Instrument Corporation, Gosford,NewSouthWales,Australia).Comoes-tándaresparacalibrarelequiposeutili-zarona-alúminaycaolinita,deáreasu-perficial = 0,52 ± 0,03 m2g-1y=15,8±0,09m2g-1,respectivamente.Lamuestrase desgasificó a 100 °C con una rampa de calentamientode10°C/min,por24ho-ras,hastaalcanzarunapresiónestablede7mmHgyunavelocidaddeevacuaciónde10mmHg/s.Luegodeesteprocedi-miento,lasisotermasdeadsorciónydes-orcióndenitrógenose tomarona77K.Losdatosdevolumenadsorbidoacon-diciones estándarde temperaturaypre-sión se transformaronmatemáticamentedeacuerdoconlaecuacióndeBrunauer,EmmettyTeller(BET).

Medida de la actividad enzimática del biocatalizador. Paralamedidadelaactividadseutilizólareaccióndeeste-rificación de ácido oleico y butanol en

hexano.Laenzimainmovilizadafuein-cubadapreviamentedurante20minenla solución de ácido oleico en hexano.Para iniciar la reacción, se mezclaron37,5mLde soluciones0,2Mdeácidooleico y butanol en hexano para obte-ner una relación equimolar (0,1 M) desustratos.Cadasistemadereacción,quecontenía1,28gdesistemabiocatalítico(soporte más enzima inmovilizada) seagitó a 300 rpm a una temperatura de40ºC.

Elseguimientodelareacciónsehizotomando1mLdelamezcladereaccióncada 5 minutos, que se diluyó hasta 10mL en una solución de etanol/acetona(1:1v/v);luegoseagregófenolftaleínaal1%ysetitulóconNaOHacuoso0,01N.Lasmuestras se tomaronenunperiodode30minutos.

Este procedimiento se realizó sin ca-talizador (blanco),con lipasacomercialyconlalipasainmovilizadaenlosgelesde

quitosano-gelatina tanto por atrapamientocomoporadsorción.

Laactividadenzimática,calculadaapartir de la pendiente de la gráfica de la desaparicióndeácidooleicovs.tiempo,semidióenmMmoldeácidoconsumi-do/min.gdeenzimainmovilizada.

ResuLtADos Y DIscusIÓn

estabilidad de los soportes de quitosano-gelatina en medios acuosos y no acuosos

Aunquesepresentóalgúngradodehin-chamiento,lossoportesnosedesintegra-ron en agua destilada (20 °C, pH = 6,5) luego de permanecer en ella 8 horas adiferentesvelocidadesdeagitación(800rpm,500rpmy120rpm).

EnlaTabla1semuestranlosresulta-dosdelaspruebasdesolubilidadehin-chamiento.

tabla 1. Estado final de los soportes quitosano:gelatina luego de la pruebas de estabilidad e hin-chamiento

Solvente Estabilidad química Hinchamiento

HCl 5 % Inestable Sí

NaOH 2 % Inestable Sí

Agua Inestable Sí

Ácido acético glacial Inestable No

Glicerina Estable No

Hexano Estable No

Butanol Estable No

Etanol 96% (v/v) Estable No

Acetona Estable No

Isopropanol Estable No

Aceite de higuerilla Estable No

Aceite de palma Estable No

Biodiesel Estable No

LosresultadosdelaTabla1correspon-denalainspecciónvisualdecadamaterialluego de que este permaneciera inmersodurante48horasenlosdistintosmediosa20°C.Independientementedelaspropor-cionesdequitosano:gelatina,delporcen-tajetotaldebiopolímeroenladispersiónoriginalydeltipodesecadoutilizadoeneste registro cualitativo, no hubo distin-ción en cuanto a la calificación del estado final de cada uno de los soportes. El pro-pósitodeestasencillapruebafuedetermi-narsiloshidrogelesdeshidratados,desti-nadosasersoportesdeinmovilizacióndeenzimas, tenían suficiente estabilidad para permaneceríntegrosenensayosdesegui-miento de una reacción enzimática, quepuedendurar48omáshoras.

En conclusión, los soportes quitosa-no-gelatina analizados en este estudio,aunque presentaron alguna estabilidadmecánica en agua durante ocho horas,solotienenpotencialdeusocomosopor-tes para inmovilización de enzimas enreaccionesenmediosnoacuosos.

Análisis de las alternativas de fabricación y humedad final de los soportes de quitosano:gelatina

ElpHenelque lasmezclasde lasdis-persionesdegelatinayquitosanofueron

establesyhomogéneasfue5,5.ApHde6,0, y más evidentemente en 6,5, se for-maron pequeños precipitados blancos.Este comportamiento coincide con loreportadoenlaliteraturaparadispersio-nesacuosasdequitosanopuroenlasqueestebiopolímerocomienzaaprecipitaravalores de pH mayores de o iguales a 6 (16).

Encuantoalaconcentracióntotaldela mezcla de biopolímeros se observó,paraelcasodelasmezclasde3,5y4,0%,que la viscosidad del hidrogel era muyelevada y dificultaba su manipulación y la obtención final de películas de gel se-cashomogéneas.

Elpropósitodeladeshidratacióndelhidrogelesobtenerun soporte secoconcaracterísticas estructurales adecuadaspara inmovilizar la lipasaenunamatrizcon suficiente agua disponible para que la enzimapreservesuactividadcatalíticaenunmedionoacuoso.ElmétododeCDSproporcionóun tipode soportemáshú-medo,esponjosoyconporosidadsuper-ficial evidente. Con el método de secado convectivosegeneraronestructurasrígi-das,compactasydebajahumedad.

EnlaTabla2semuestranlosvaloresde humedad final de los soportes.

tabla 2. Humedad final (%, base húmeda) de los soportes

Concentración total de biopolímeros

3,0% 3,5% 4,0%

Q:G 1:2 1:5 1:10 1:2 1:5 1:10 1:2 1:5 1:10

CDS 35,7 32,2 29,2 25,8 28,7 31,3 26,8 25,4 24,2

C 12,8 11,9 8,3 12,5 11,9 8,00 10,9 10,9 8,8

Q:G. Relación quitosano:gelatina ; CDS: Humedad final con secado CDS; C: Humedad final con secado convectivo

Enestetrabajoseusaronmezclasdequitosano-gelatina en diferentes propor-ciones,concentracionestotalesyvaloresdepHenladispersiónoriginal,yseapli-carondosmétodosdesecado:conaireoconvectivo y CDS. De acuerdo con losresultados descritos relativos al efectodelpH–laconcentracióntotaldebiopo-límerosenladispersiónoriginal–,sede-cidiócontinuarelestudiosolamenteconlosmaterialespreparadosconpHycon-centracióndebiopolímerosde5,5y3%,respectivamente.Respectodelmétododesecado,serestringióasoportesobtenidosmediante CDS por su mayor porosidadaparente y contenido de humedad sufi-cienteparagarantizarladisponibilidaddeaguaparalaenzimaqueseibaainmovili-zaryautilizarenunmedionoacuoso.

Estructura y área superficial de los soportes

Independientementedelatécnicaaplica-daparalaproduccióndeunsoporteca-talítico, debe tenerse en cuenta algunosfactores asociados a su estructura, quepuedenlimitarsuactividadcatalítica:lamacroporosidad, que afecta la difusiónexterna de los sustratos desde el mediodereacciónhacialossitiosdeubicacióndelasenzimasenelsoportesólido,ylamesoporosidad, principalmente relacio-

nadaconeltamañodelascavidadesquealojan las moléculas de enzima y que,para una mejor eficiencia y capacidad de inmovilización, idealmente, debieraserdeuntamañoligeramentemayorqueel radiohidráulicode laproteína inmo-vilizada en la matriz (17). Para lograrestas características estructurales, en elcasodedispersionesdequitosano,sehanutilizadocriogelesestructuradosydeshi-dratadosmedianteprocesosdecongela-ción-descongelación(CDS)(15).

Estructura superficial. La microsco-píadefuerzaatómica(AFM),unatécnicaque permite estudiar la estructura superfi-cial,hasidoutilizadaporinvestigadoresinteresadosenelestudiodelatopografíasuperficial de membranas (18)

Lamorfologíaobservadaparatresso-portes(3%decontenidototaldebiopolí-meros, deshidratados mediante CDS) dediferente relación quitosano:gelatina fuedistinta,comoseobservaenlasimágenestopográficas mostradas en la Figura 1. Las micrografíastomadasalasdiferentespe-lículas corresponden a un tamaño de 5×5 µm2. La superficie de las tres muestras noeslisayenellaseobservanestructu-rasnodulosasydeagregadosdenódulosqueaparecenbrillantes,mientrasquelaszonasmásoscurascorrespondenasuper-ficies más profundas.

Å500250

1.000.50

Relación1:2 Relación1:5 Relación1:10

Figura 1. Imágenes topográficas de tres tipos de soportes obtenidos mediante CDS. Concentra-cióntotaldebiopolímeros:3,0%

ElefectodelostratamientosCDSenlaproduccióndemembranasosoportesde quitosano es estructurar la superficie, es decir, hacerla homogénea y porosa(19). En el caso de mezclas quitosano-gelatinaseevidencia,deacuerdoconlasmicrografíasdelaFigura1,queparalaproporciónmásbajadegelatinaestatéc-nicatambiénproduceestetipodeestruc-turación.Sinembargo,elefectosepierdeamedidaqueseincrementalapresenciadegelatinaenlamezclainicialdebiopo-límeros.

Área superficial. EnlaTabla3seob-servanlosresultadospromediodedosde-terminaciones de área superficial para tres diferentes tiposdesoportesdequitosano-gelatinaobtenidosconlosdosmétodosdedeshidrataciónutilizadosenestetrabajo.

tabla 3. Área superficial interna (m2/g)delossoportesdequitosano-gelatina.Concentracióntotaldebiopolímerosenlasmuestras:3,0%

Q:G 1:2 1:5 1:10

CDS 2,9908 1,6765 0,8760

C 0,2654 0,2842 0,2006

Q:G.Relaciónquitosano:gelatinaCDS: Área superficial para muestras secadas mediante CDSC: Área superficial para muestras secadas con aire

Las cifras de área superficial de la Ta-bla3soncoherentescon lasapreciacio-nescualitativassobreestructuraacercadelos materiales secos obtenidos mediantesecadopor convecciónyCDS.Lospri-meros, rígidos y compactos, tienen losvalores más bajos de área superficial; los segundos muestran cifras entre cuatro ydoce veces superiores respecto de estacaracterísticay,entreellos,losdepropor-

ción1:2enlarelaciónquitosano:gelatinatuvieron mayor área superficial por gra-modemuestra(2,9908m2/g).Tambiénesevidentequepara lossoportesdeshidra-tadosporCDShaycorrespondenciaentreestas cifras y la estructura superficial que apareceen lasmicrografíasde laFigura1: la mayor área superficial corresponde a la superficie más estructurada.

El área superficial de los soportes de quitosano depende principalmente delprocedimiento de secado de los hidro-geles.Cuandoseusasecadoconvectivoconairesehareportado,parapequeñasesferas de quitosano, áreas superficiales menoresde0,5m2g-1(20);usandoseca-doporaspersión seobtienenvalores li-geramente superiores (0,74-3,01 m2 g-1)(21). El secado al vacío y la liofilización permitenalcanzarentre10y150m2g-1(22);elsecadosupercríticoconducealaobtención de las más altas áreas superfi-ciales(hasta200m2g-1)(23).Puedecon-cluirsequemediantelatécnicadescrita,para mezclas de quitosano-gelatina conconcentración toral de biopolímeros de3,0% secadas mediante CDS, se logranestructuras semejantes en área superficial alasquesealcanzandeshidratandodis-persionesdequitosanomediantesecadoporaspersión.Paraelcasodelquitosanose ha sugerido que las superficies porosas tienenunacapacidadderetenciónsupe-riordeenzimaenprocesosdeadsorcióndelipasassobreestaclasedesoportesy,consecuentemente, mayor actividad ca-talítica(17).Porestarazónseconsideróqueelsoportederelación1:2(quitosano:gelatina)eraelmásadecuadoparainmo-vilizarlalipasa.

Espectroscopia infrarroja por trans-formada de Fourier. Losespectrosinfra-

y1.412cm-1)queseatribuyenadistintosmodos de vibración de los grupos CH,CH2 y CH3 (24) y una segunda ampliabandacondospequeñospicosyunmí-nimo en 1.089 cm-1 producidos por losgruposC-O,C-O-C,C-CyC-Ndelbio-polímeroyque,enconjunto,usualmen-teseasocianalaestructurasacáridadelquitosano(25).

rrojosdetransformadadeFourierdelossoportesdequitosano-gelatinaobtenidospor deshidratación mediante CDS sonmostradosenlaFigura2.

El espectro del quitosano muestraun fuertepicocaracterísticodeamidaa1.654 cm−1; una banda amplia con trespequeños picos (1.300 cm-1, 1.350 cm-1

Figura 2. EspectrosIRdelossoportessecosdequitosano:gelatinaylasmezclasdeestosbiopo-límeros.

Enelespectrodelagelatina(Figura2) seobservaunpicoenunaubicaciónligeramente menor a 1.654 cm−1 que seasociaalgrupocarboniloyaunapeque-ñabandaaminoalrededorde1.537cm-1.

Laincorporacióndelagelatinallevóa pequeñas modificaciones en el espectro dequitosano,variandolasposicionesdebandasypicoshaciavaloresligeramentemenores,peroobservables,delosnúme-rosdeonda,amedidaqueseincrementaelcontenidodegelatina.Estospequeños

cambios indican la interacción de lasmoléculasdegelatinayquitosanoporlaformación de puentes de hidrógeno en-treellasenelcomplejopolielectrolíticocreado entre los dos biopolímeros (26).

Inmovilización de la enzima

DeacuerdoconlosresultadosdelaTabla3, el área superficial de los soportes ob-tenidos mediante CDS es baja. General-mente, la eficiencia de la inmovilización deunaenzimaladeterminaeláreasuper-

ficial del soporte. Esto ha sido cuestionado paraelcasodelainmovilizacióndelipa-sasensoportesbiopoliméricosenlosqueresulta ser más importante la afinidad del material de soporte por las enzimas quesu área superficial(27). Tal parece ser la el casoenesteestudiopueslosresultadosdeactividad catalítica en la inmovilizacióndelalipasadeCandida antarcticafueronsatisfactoriosy,enalgunoscasossuperio-resalaspublicadasentrabajossimilares,talcomoseobservaenlaTabla4.

Deacuerdoconlasmedicionesdecar-gadeproteínade las solucionesenzimá-ticas,delavadoydelosexudadosdelasdescongelacionesdelosgelessecadosporCDS, losbalancesdeproteínamostraronque la cantidadde enzimaadsorbidapor

el soporte fue 61,8 mg/g para el procedi-mientodeadsorcióny48,7mg/gdesopor-teparainmovilizaciónporatrapamiento.

Actividad enzimática del biocatalizador

Sin presencia del biocatalizador no seobservódisminucióndelaconcentracióndeácidooleicoencondicionesdeensayo(40°Cy300rpm)durantemediahora.

EnlaTabla4secomparanlosresul-tados de actividad específica (U/g de pro-teínaoU/gdesoporte)obtenidosenesteestudiocon losde trabajos similaresenlos que seutilizó lamisma reaccióndesíntesisparalamedidadelaactividadenelmedioorgánico.

tabla 4.ActividadescatalíticasdelalipasadeCandida antarcticaendistintossoportes

Sistema catalíticoActividad

Referencia(mM/min g soporte)

(mM/min g proteína)

LC (n-hexano) 0,16 0,90 Este trabajo

Atrapamiento (Q:G = 1:2) 0,04 0,87 Este trabajo

Adsorción (Q:G = 1:2) 0,06 1,03 Este trabajo

LCC (n-heptano) 0,01-0,03 - (28)

LC (iso-octano) 0,07 - (29)

LCQ (iso-octano) - 2,75 (19)

LC:LipasadeCandida antarcticainmovilizadacomercialNovozym435LCC:LipasadeCandida antarcticaencarbónactivadoLCQ:LipasadeCandida antarcticainmovilizadaenquitosano,activadaconglutaraldehido

Los resultados de actividad de lossistemas inmovilizados obtenidos eneste trabajo muestran actividades cata-líticas comparables a las reportadasporestudios similares en sistemas de reac-ción semejantes que usaron medios noacuososdistintosalhexano.Estehechopuede explicar en parte las variaciones

delosvaloresdelaactividad.Enelcasodelainmovilizaciónporatrapamiento,laactividad esmenor respectode la de lainmovilización por adsorción, posible-mentepor las restriccionesa la transfe-renciademasaquellevaarestringirmásel flujo de sustratos a través de la matriz biopolimérica.

Paraestimar enunaprimeraaproxi-maciónlaestabilidadoperacionaldelossistemasbiocatalíticos,laactividadcata-líticafuemedidadurantedosreusosmás,tantodelalipasainmovilizadaporatra-pamientocomoporadsorción,mostran-dounapérdidadelaactividaddeaproxi-madamente20,5y38,4%enelcasodeatrapamiento y de 45,6 y 80,2% en al casodeadsorción, locual indicaque lainmovilizaciónporatrapamientoesmásestable.

concLusIones

Enlapreparacióndelossoportes,elfac-tor determinante de la estabilidad y lahomogeneidaddelasdispersionesfueelpH, siendo5,5elvalor enelque senose presentó precipitación del quitosano.En cuanto a la concentración total debiopolímeros,lasmezclasde3,5y4,0%proporcionaronhidrogelesdealtavisco-sidad, lo que dificultó los pasos posterio-resdelosprotocolosdeobtencióndelossoportes.Respectodelmétododesecado,los materiales obtenidos mediante CDS(6 ciclos) fueron escogidos para llevar a cabo la inmovilización de la lipasa portener mayor porosidad, área superficial y contenidodehumedad.

Los soportesquitosano-gelatinapre-paradosenesteestudio,aunquepresenta-ronalgunaestabilidadmecánicaenaguadurante8horas,solotienenpotencialdeuso como soportes para inmovilizacióndeenzimasen reaccionesenmediosnoacuosos.

UtilizandoseisciclosdeCDSselogróobtenerungelcon laestructuray lahu-medadadecuadasparaserutilizadocomosoporteparainmovilizacióndelaenzima.

ComoconsecuenciadelosresultadosdelaspruebasdeAFMylamedidadelárea superficial, para propósitos de in-movilización,seconsideróqueelsoportemásadecuadofuelarelaciónquitosano-gelatina=1:2.

Los resultados de actividad de lossistemas inmovilizados en este trabajomuestranactividadescatalíticasdeeste-rificación en medio no acuoso, compa-rables a las reportadas por estudios si-milares.Enelcasodelainmovilizaciónporatrapamiento, laactividadesmenorrespecto de la de la inmovilización poradsorción, posiblemente por las restric-ciones al flujo de sustratos que impone la matriz.Sin embargo, este resultómejorqueeldeadsorciónencuantoalareutili-zaciónoestabilidadoperacionaldelsis-temabiocatalítico.

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