การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer Test และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal

Occult Blood เพอใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหต

โดย

นางสาวศศญดา ศรนวม

การคนควาอสระนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชานตวทยาศาสตร

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2556

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer Test และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal

Occult Blood เพอใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหต

โดย

นางสาวศศญดา ศรนวม

การคนควาอสระนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชานตวทยาศาสตร

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2556

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

A COMPARISON STUDY OF THE EFFICIENCY OF KASTLE-MEYER

REAGENT AND FOB 1-STEP FECAL OCCULT BLOOD OF HUMAN BLOOD

STAIN DETECTION IN CRIME SCENE

By

Miss Sasiyada Srenoum

An Independent Study Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in Forensic Science

Program of (forensic science)

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2013

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ

สมดกลาง

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหการคนควาอสระเรอง “ การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer Test และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult

Blood เพอใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหต ” เสนอโดย นางสาวศศญดา ศรนวม เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชานตวทยาศาสตร

……........................................................... (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ)

คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ...........

อาจารยทปรกษาการคนควาอสระ

พนตารวจโท ดร.สฤษด สบพงษศร

คณะกรรมการตรวจสอบการคนควาอสระ

.................................................... ประธานกรรมการ

( รองศาสตราจารย พนตารวจเอกสนต สขวจน ) ............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

( ดร.ชยชาญ ไชยรงสนนท ) ............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

( พนตารวจโท ดร.สฤษด สบพงษศร ) ............/......................../..............

สำนกหอ

สมดกลาง

ง

54312329 : สาขาวชานตวทยาศาสตร

คาสาคญ : นายาตรวจคราบโลหตเบองตน/Kastle-Meyer Test / ชดทดสอบเลอดในอจจาระ/ ความไว/ ความจาเพาะ

ศศญดา ศรนวม : การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer Test

และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood เพอใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหต. อาจารยทปรกษาการคนควาอสระ : พ.ต.ท. ดร.สฤษด สบพงษศร. 106 หนา. การศกษาครงนมวตถประสงคเพอ ศกษาเปรยบเทยบความแตกตางดานความจาเพาะและความไวของนายา Kastle-Meyer test และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยศกษาความแตกตางดานความจาเพาะ โดยใชตวอยางเลอดสตวจานวน 6 ชนด (ไก, หม, วว, แมว, สนข,

นก) และเลอดมนษย การศกษาความแตกตางดานความไว โดยใชตวอยางจากเลอดมนษยทเจอจางดวยนากลนความเขมขน 17 ระดบ (1:100 ถง 1:1,000,000) รวมทงทดสอบดวยตวอยางคราบโลหตมนษยบนพนผวและสภาวะแวดลอมทแตกตางกน ผลการศกษา พบวา การศกษาเปรยบเทยบดานความจาเพาะนนชดทดสอบ FOB 1-Step

Fecal Occult Blood ใหผลเปนลบกบเลอดสตวทกกลมตวอยาง สวนนายา Kastle-Meyer test ใหผลเปนบวกกบเลอดสตวทกกลมตวอยาง โดยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood มความจาเพาะสงกวานายา Kastle-Meyer Test สวนการศกษาเปรยบเทยบดานความไว พบวาชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood test มความไว 1:500,000 ถง 1:900,000 ซงมากกวานายา Kastle-Meyer ทมความไว 1:60,000 สวนการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult

Blood นนชนดของผามผลตอการสกดตวอยางคราบโลหตบนผา และตวอยางทมความเขมขนตาจะใหผลการทดสอบเปนผลบวกออนๆ ดงนนสรปไดวาชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood มความไว และมความจาเพาะกบเลอดมนษย มากกวานายา Kastle-Mayer test จงเปนอกหนงทางเลอก ในการนามาประยกตใชตรวจคราบโลหตเบองตนในสถานทเกดเหตและหองปฏบตการนตวทยาศาสตร

นตวทยาศาสตร บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2556

ลายมอชออาจารยทปรกษาการคนควาอสระ ........................................

สำนกหอ

สมดกลาง

จ

54312329 : MAJOR : (FORENSIC SCIENCE) KEY WORD : PRESUMTIVE TESTS FOR BLOOD/KASTLE-MEYER/FOB 1-STEP FECAL

OCCULT BLOOD TEST/SENSITIVITY/SPECIFICITY SASIYADA SRENOUM : A COMPARISON STUDY OF THE EFFICIENCY OF

KASTLE-MEYER REAGENT AND FOB 1-STEP FECALOCCULTBLOOD OF HUMAN BLOOD

STAIN DETECTION IN CRIMESCENE. INDEPENDENT STUDY ADVISOR : POL. LT. COL.

SARIT SUEBPONGSIRI. 106 pp.

The objective of the study is to comparison the efficiency of the Kastle-Meyer reagent and

the FOB 1-Steo Fecal Occult Blood by testing the specificity of animal blood samples from six species

(chickens, pigs, cows, cats, dogs, birds), and human blood. And sensitivity test in of human blood from

various concentration levels, which was diluted by distilled water from 1:100 to 1:1,000,000 as 17

levels. Including on different surface and environment.

The results showed that the comparison of the specific testing kit, the FOB 1-Steo Fecal

Occult Blood strip test is negative for all animal blood samples. And the Kastle-Meyer reagents is

positive for all animal blood samples. The FOB 1-Steo Fecal Occult Blood strip test has specific to

human blood more than the Kastle-Meyer reagent. The FOB 1-Steo Fecal Occult Blood strip test was

step up to 1:900,000, which more sensitive than the Kastle-Meyer test, which had sensitivity1:60,000.

The FOB 1-Steo Fecal Occult Blood testing on various types of fabric, affected the extraction of

samples bloodstains on fabrics. And the testing result of low concentration was weakly positive.

Conclusion, the FOB 1-Step Fecal Occult Blood a sensitive and specific for human blood

more than the Kastle-Meyer reagent. Therefore, the FOB 1-Step Fecal Occult Blood is an alternate to

apply as presumptive testing human blood at the crime scene and forensic laboratories.

Program of (FORENSIC SCIENCE) Graduate School, Silpakorn University

Student's signature ........................................ Academic Year 2013

Independent Study Advisor's signature ........................................

สำนกหอ

สมดกลาง

ฉ

กตตกรรมประกาศ การศกษาคนควาอสระเรอง การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer test และชดทดสอบ Fecal Occult Blood (FOB) เพอใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหต สาเรจลงไดจากความกรณาจาก พนตารวจโท ดร.สฤษด สบพงษศร อาจารยทปรกษาการศกษาคนควาอสระ ซงไดใหคาปรกษา กาลงใจความมมตรไมตรจต รวมทงตรวจทานแกไขขอบกพรองทาใหการคนควาอสระนมความสมบรณยงขน และผศกษาไดไดรบความกรณาจาก นายชาน แกวเพชร หวหนากลมงานเทคนคบรการ ทใหการสนบสนนทงเครองมอและอปกรณในการศกษาคนควาอสระ ตงแตเรมดาเนนการจนกระทงเสรจเรยบรอย ผศกษาจงขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ ทน ขอกราบขอบพระคณ อาจารย ดร.ศรรตน ชสกลเกรยง ทชวยอานวยความสะดวกและสนบสนนสารเคมทใชในการเตรยมนายา ขอบพระคณผชวยศาสตราจารย พนตารวจโทวรธช วชช-วาณชย เปนอยางสงทกรณาใหคาแนะนาความรและความชวยเหลอรวมทงการสนบสนนเปนอยางด ขอขอบพระคณ คณชนม รอดผล ทใหคาแนะนาและชวยเหลอในการเตรยมนายา ตลอดจนขอขอบพระคณ ผทมไดกลาวนามในทน ซงมสวนชวยเหลอจนการศกษานไดสาเรจลลวงดวยด สดทายน ผศกษาขอกราบขอบพระคณ บดาและมารดาของผศกษา ครอาจารยทกทานทอบรมสงสอนใหความร รวมถงบคคลในครอบครวของผ ศกษา และเพอนๆนองๆเจาหนาทหองปฏบตการ กลมงานเทคนคบรการโรงพยาบาลสว ทใหกาลงใจและสนบสนนทกๆดาน หากการศกษาคนควาอสระฉบบนมขอผดพลาดหรอขอบกพรองดวยประการใด ผศกษาขอนอมรบไวเพอนาไปปรบปรงแกไขเพอประโยชนในการศกษาตอไป

สำนกหอ

สมดกลาง

ช

สารบญ หนา บทคดยอภาษาไทย .............................................................................................................................................. ง

บทคดยอภาษาองกฤษ ......................................................................................................................................... จ

กตตกรรมประกาศ .............................................................................................................................................. ฉ

สารบญตาราง ...................................................................................................................................................... ฌ

สารบญภาพ ......................................................................................................................................................... ญ บทท

1 บทนา ....................................................................................................................................................... 1

ความเปนมาและความสาคญของปญหา ........................................................................................ 1

วตถประสงคของการวจย ............................................................................................................... 3

สมมตฐานของการวจย ................................................................................................................... 3

ขอบเขตของการวจย....................................................................................................................... 3

นยามศพทเฉพาะ ............................................................................................................................ 4

ตวแปร ............................................................................................................................................ 4

กรอบแนวคด .................................................................................................................................. 4

ประโยชนทไดรบ ........................................................................................................................... 5

2 วรรณกรรมทเกยวของ ............................................................................................................................ 6

การพสจนคราบโลหตในทางนตวทยาศาสตร............................................................................... 7

ความรเกยวกบโลหตและองคประกอบของโลหต ........................................................................ 7

องคประกอบของเลอด ................................................................................................................... 8

พลาสมา .......................................................................................................................................... 9

เมดเลอด.......................................................................................................................................... 10

ระบบหมเลอด ................................................................................................................................ 15

การทาลายเมดเลอดแดง ................................................................................................................. 17

ความรเกยวกบการเกบวตถพยานและวตถพยานทเปนโลหต ....................................................... 18

การเกบวตถพยานทเปนโลหต ....................................................................................................... 18

การตรวจพสจนคราบโลหต ........................................................................................................... 19

การทดสอบเบองตนวาเปนคราบเลอดหรอไม .............................................................................. 22

การทดสอบเบองตนวาเปนเลอดมนษยหรอสตว .......................................................................... 22

สำนกหอ

สมดกลาง

ซ

บทท หนา การตรวจยนยนวาเปนเลอดใคร ..................................................................................................... 24

ความคงทนของสารหมเลอด ......................................................................................................... 26

ความรเกยวกบนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ...... 26

หลกการ Immunochromatographic Assay .................................................................................... 26

ประวตการทดสอบ Kastle-Meyer test .......................................................................................... 29

การใชนายา Kastle-Meyer ในทางนตวทยาศาสตร ....................................................................... 29 ผลงานวจยและวรรณกรรมทเกยวของ .......................................................................................... 29

3 วธดาเนนการวจย..................................................................................................................................... 34

รปแบบการทดลอง ......................................................................................................................... 34 วสดและวธการดาเนนการทดลอง ................................................................................................. 34

การเตรยมตวอยางในการทดลอง ................................................................................................... 39

การดาเนนการทดลอง .................................................................................................................... 42

สถานทในทาการทดลอง................................................................................................................ 46 4 ผลการวเคราะหขอมล ............................................................................................................................. 47

ผลการทดลองท 1 ........................................................................................................................... 47

ผลการทดลองท 2 ........................................................................................................................... 48

ผลการทดลองท 3 ........................................................................................................................... 51

5 สรป อภปรายผล และขอเสนอแนะ ........................................................................................................ 55

สรปผลการทดลอง ......................................................................................................................... 55

อภปรายผลการทดลอง ................................................................................................................... 57

ขอเสนอแนะ ................................................................................................................................... 60 รายการอางอง ...................................................................................................................................................... 62

ภาคผนวก ............................................................................................................................................................ 66

ภาคผนวก ก การเตรยมนายาและเตรยมตวอยางในการทดลอง ................................................... 67

ภาคผนวก ข ผลการทดสอบการทดลองท 1 .................................................................................. 80

ภาคผนวก ค ผลการทดสอบการทดลองท 2 .................................................................................. 89 ภาคผนวก ง ผลการทดสอบการทดลองท 3 .................................................................................. 100

ประวตผวจย ........................................................................................................................................................ 106

สำนกหอ

สมดกลาง

ฌ

สารบญตาราง ตารางท หนา 3.1 แสดงปรมาตรเมดเลอดแดงอดแนน (Hematocrit) และความเขมขนของ Hemoglobin ของ

อาสาสมครจานวนทงหมด 20 ตวอยาง ............................................................................................ 40

4.1 ผลการทดสอบคราบเลอดสตวทง 6 ชนด ดวยนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ................................................................................... 47

4.2 ผการทดสอบคราบโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลน 17 ระดบ ทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer Kastle-Meyer test ........................................................................ 48

4.3 ผลการทดสอบโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลนอยในรปของสารละลายโลหต 17 ระดบ ทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยตรง ....................... 49

4.4 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยบนผากอส จากโลหตทเจอจางดวย

นากลน 17 ระดบ ทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood สกดโดย extraction buffer .............................................................................................................................. 50

4.5 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในสภาวะทแตกตางกนดวยนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ................................... 51

4.6 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในตวอยาง B ดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ................................................................................................. 52

4.7 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในตวอยาง C ดวยชดทดสอบ

FOB 1-Step Fecal Occult Blood ................................................................................................... 53

4.8 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในตวอยาง D ดวยชดทดสอบ

FOB 1-Step Fecal Occult Blood ................................................................................................... 54

5.1 ตารางสรปผลการทดสอบตวอยางโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลน 17 ระดบ ดวยนายาทง 2 ชนด ......................................................................................................................... 56

สำนกหอ

สมดกลาง

ญ

สารบญภาพ ภาพท หนา 1.1 กรอบแนวคดการวจย ........................................................................................................................ 5

2.1 องคประกอบในเลอดหลงจากปนใหตกตะกอน .............................................................................. 8

2.2 องคประกอบของเลอด ...................................................................................................................... 10

2.3 เซลลตนกาเนดการพฒนาการ และโครงสรางของเมดเลอดชนดตางๆ ........................................... 11

2.4 ลกษณะโครงสรางของฮโมโกลบน .................................................................................................. 11

2.5 เซลลเมดเลอดชนดตางๆ ทพบในสเมยรเลอดของคนปกต ............................................................. 14

2.6 การจบกลมตกตะกอนของหมเลอดระบบ ABO .............................................................................. 16 2.7 ปฏกรยาการจบกลมของเมดเลอดแดงในหมเลอดกลมตางๆ ของแอนตเจนทอยทผวของเมดเลอด

แดงกบแอนตบอด ............................................................................................................................. 17

2.8 ลกษณะของคราบเลอดบนพนผวไมเมอเวลาผานไป 1, 2 และ 3 วน ....................................... 21

2.9 ลกษณะของคราบเลอดบนผาฝายเมอเวลาผานไป 1, 2 และ 3 วน ............................................ 21

2.10 ลกษณะของคราบเลอดบนกระดาษชาระเมอเวลาผานไป 1, 2 และ 3 วน ............................... 21

2.11 ลกษณะของคราบเลอดบนกระจก เมอเวลาผานไป 1, 2 และ 3 วน .......................................... 22

2.12 การทดสอบ Precipitin test(แบบ Ring test) ..................................................................................... 23

2.13 การทดสอบ Precipitin test(แบบ Gel diffusion) .............................................................................. 24

2.14 ปฏกรยา Absorption-elution method ............................................................................................... 25

2.15 ปฏกรยา Absorption-inhibition method ........................................................................................... 25

2.16 หลกการ Immunochromatographic Assay ....................................................................................... 27

2.17 หลกการ Chromatographic immunoassay ....................................................................................... 28

2.18 การเกดผลลบปลอม(Hook effect) .................................................................................................... 28

2.19 The Kastle-Meyer test reaction test (phenolphthalein) ................................................................... 29

3.1 การเปลยนสของทดสอบ Kastle-Meyer test .................................................................................... 37

3.2 วธการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1- Step Fecal Occult Blood .................................................. 38

3.3 การเจอจางตวอยางโลหตมนษยดวยนากลน .................................................................................... 41

ก.1 เตรยมนายา Kastle-Meyer test โดยผสม phenolphthalein 2.0g, potassium hydroxide 20 g,

นากลน 100 mL แลวเตมผงสงกะส 20 g .......................................................................................... 68

ก.2 เตรยมนายา Kastle-Meyer test นาไปตมโดยใช reflux condenser ตมประมาณ 2-3 ชวโมง .......... 68

สำนกหอ

สมดกลาง

ฎ

ภาพท หนา ก.3 เตรยมนายา Kastle-Meyer test หลงจากตม 2-3 ชวโมงไดสารละลายใสไมมส เกบไวในขวดสชา เปน stock solution ............................................................................................................................ 69

ก.4 สารทใชในการเตรยม Kastle-Mayer test คอ 6 % hydrogen peroxide, ethanol และ

Kastle-Mayer stock solution............................................................................................................. 69

ก.5 ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ................................................................................. 70

ก.6 ตวอยางคราบเลอดสาหรบการทดลองท 1........................................................................................ 70

ก.7 ตวอยางคราบเลอดสตวใชกรรไกรสะอาดตดแบงใหมขนาด 1x1 เซนตเมตร ................................ 71

ก.8 เครองตรวจนบเมดเลอดอตโนมต(Automatic cell counter) ............................................................ 71

ก.9 การเจาะเกบเลอดจากอาสาสมคร...................................................................................................... 72

ก.10 การเตรยมตวอยางสาหรบการทดลองท 2 โดยเจอจางเลอดอาสาสมคร 17 ระดบ

และเตรยมเปนคราบเลอดโดยหยดลงบนผากอสสะอาดขนาด 1x1 เซนตเมตร .............................. 72

ก.11 การทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยใสตวอยางลงใน

ขวด extraction buffer ผสมแลวหยดลงบนชดทดสอบจานวน 2 หยด ............................................ 73

ก.12 ขนตอนการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยใชตวอยางทเปน

สารละลายโลหต ปรมาตร 90 uL หยดลงบนแถบทดสอบ .............................................................. 73

ก.13 ตวอยาง A คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวซกดวยเครองซกผาอตโนมตโดยใชผลตภณฑ ซกผากอนซกและหลงซก ................................................................................................................. 74

ก.14 ตวอยาง B คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวซกมอดวยนาเปลากอนซกและหลงซก.................... 74

ก.15 ตวอยาง C คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวเกบทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน ........... 75

ก.16 ตวอยาง D คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวเกบไวทโลงแจงเปนเวลามากกวา 2 เดอน ............... 75

ก.17 ตวอยาง E คราบโลหตมนษยบนกอสเกบไวทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน ................... 76

ก.18 ตวอยาง F คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนไมอดผวเรยบเปนเวลามากกวา 2 เดอน ............... 76

ก.19 ตวอยาง G คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนกระเบองเคลอบทอณหภมหองเปนเวลา มากกวา 2 เดอน ................................................................................................................................. 77

ก.20 ตวอยาง H คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนยปซมบอรดทอณหภมหองเปนเวลา มากกวา 2 เดอน ................................................................................................................................. 77

ก.21 ตวอยาง I คราบโลหตมนษยบนฝาเพดานทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน ....................... 78

ก.22 ตวอยาง J คราบโลหตมนษยบนผากอสวางทงไวใหแหงทอณหภมหอง

เปนเวลา 24 ชวโมง ........................................................................................................................... 78

ก.23 ตวอยางคราบโลหต A, B, C, D, E, F, G, H, I และ J ....................................................................... 79

สำนกหอ

สมดกลาง

ฏ

ภาพท หนา ข.1 ลกษณะเมดเลอดไกเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนและลกษณะเมดเลอดไกเมอยอม

ดวย Wright’s Stain ........................................................................................................................... 81

ข.2 ลกษณะเมดเลอดววเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนและลกษณะเมดเลอดววเมอยอม

ดวย Wright’s Stain ........................................................................................................................... 81

ข.3 ลกษณะเมดเลอดหมเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนและลกษณะเมดเลอดหมเมอยอม

ดวย Wright’s Stain ........................................................................................................................... 82

ข.4 ลกษณะเมดเลอดแมวเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนและลกษณะเมดเลอดแมวเมอยอม

ดวย Wright’s Stain ........................................................................................................................... 82

ข.5 ลกษณะเมดเลอดสนขเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนและลกษณะเมดเลอดแมวเมอยอม

ดวย Wright’s Stain ........................................................................................................................... 83

ข.6 ลกษณะเมดเลอดนกเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนและลกษณะเมดเลอดนกเมอยอม

ดวย Wright’s Stain ........................................................................................................................... 83

ข.7 ลกษณะเมดเลอดมนษยเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนและลกษณะเมดเลอดมนษยเมอยอม

ดวย Wright’s Stain ........................................................................................................................... 84

ข.8 การทดสอบ Kastle-Mayer Test ตวอยางเลอดไก ............................................................................ 84

ข.9 การทดสอบ Kastle-Mayer Test ตวอยางเลอดหม............................................................................ 85

ข.10 การทดสอบ Kastle-Mayer Test ตวอยางเลอดวว ............................................................................. 85

ข.11 การทดสอบ Kastle-Mayer Test ตวอยางเลอดแมว .......................................................................... 86

ข.12 การทดสอบ Kastle-Mayer Test ตวอยางเลอดสนข ......................................................................... 86

ข.13 การทดสอบ Kastle-Mayer Test ตวอยางเลอดนก ............................................................................ 87

ข.14 การทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood เลอดสตว 6 ชนด..................................................... 87

ข.15 การควบคมผลบวกและการควบคมผลลบของนายา KM test .......................................................... 88

ข.16 การควบคมผลบวกและการควบคมผลลบของชดทดสอบ FOB 1- Step Fecal Occult Blood ....... 88

ค.1 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 100...................................................................................... 90

ค.2 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 10, 000 ............................................................................... 90

ค.3 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 50, 000 .............................................................................. 91

ค.4 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 60, 000 ............................................................................... 91

ค.5 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 70, 000 ............................................................................... 92

ค.6 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 80, 000 ............................................................................... 92

ค.7 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 90, 000 ............................................................................... 93

สำนกหอ

สมดกลาง

ฐ

ภาพท หนา ค.8 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 100, 000 ............................................................................. 93

ค.9 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 200, 000 ............................................................................. 94

ค.10 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 300, 000 ............................................................................. 94

ค.11 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 400, 000 ............................................................................. 95

ค.12 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 500, 000 ............................................................................. 95

ค.13 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 600, 000 ............................................................................. 96

ค.14 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 700, 000 ............................................................................. 96

ค.15 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 800, 000 ............................................................................. 97

ค.16 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 900, 000 ............................................................................. 97

ค.17 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 1,000, 000 .......................................................................... 98

ค.18 การควบคมผลการทดสอบการทดลองท 2 ของชดทดสอบ FOB 1- Step Fecal Occult Blood ...... 98

ค.19 การควบคมผลการทดสอบการทดลองท 2 ของชดทดสอบ KM test .............................................. 99

ง.1 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง A ........................................................................... 101

ง.2 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง B ............................................................................ 101

ง.3 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง C ............................................................................ 102

ง.4 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง D ............................................................................ 102

ง.5 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง E ............................................................................. 103

ง.6 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง F ............................................................................. 103

ง.7 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง G ............................................................................ 104

ง.8 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง H ............................................................................ 104

ง.9 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง I .............................................................................. 105

สำนกหอ

สมดกลาง

1

บทท 1 บทนา

1. ความเปนมาและความสาคญของปญหา ในคดอาญาประเภทประทษรายตอรางกายและชวต เชน คดฆาตกรรม ขมขนกระทาชาเราและคดอนๆ ทคลายคลงกบคดเหลาน รอยคราบโลหตจะเปนหลกฐานอนหนงทสาคญเสมอ ในคดจาพวกนจะพบรอยคราบโลหตจากบรเวณดงกลาวคอ จากตวผถกประทษราย จากสถานทเกดเหต จากตวของผรายและจากอาวธทใช โลหตทไหลออกมาจะมปรมาณมากนอยอยางไร ยอมขนอยกบความฉกรรจของบาดแผล สวนใดของรางกายทเกดเปนแผลฉกรรจ และบาดแผลอยใกลทางเดนของเสนโลหตใหญกยอมจะมโลหตไหลออกมามาก โลหตทไหลออกมาเปรอะเปอนอยตามทตาง ๆ ดงกลาวนน จะมลกษณะเกาะแนนเปนหยดหรอคราบอยณ ทนนเรยกวา หยดโลหต หรอคราบโลหต หยดโลหตหรอคราบโลหตนนบวาเปนประโยชนแกการสบสวนเปนอนมากคอ ชวยใหทราบถงวธการกระทาผดของคนราย ชวยใหทราบถงเสนทางหลบหนของคนราย ชวยในการตรวจพสจนยนยนตวบคคลผกระทาผด ชวยใหทราบระยะเวลาของการตายทผานมาแลว โลหตทไหลออกมาใหม ๆ จะมลกษณะเหลวและมสแดงเขมตอมาจะเปนลกษณะเหลวตรงกลาง สวนตามขอบของโลหตจะคอยๆแหง และสจะเปลยนเปนสนาตาลแก ตอจากนนจะคอยๆเปลยนสภาพแหงหรอเปนสะเกด สนาตาลแกหรอสดา[1,2,3]

จากทกลาวมาขนตนจะเหนไดวาโลหตเปนชววตถพยานทมความสาคญสามารถใชเปนหลกฐานประกอบสอบสวนเกยวกบพฤตกรรมทเกดขนในคด แตเมอมการปดบงอาพรางทเกดเหต โดยการเชดหรอลางคราบโลหตออก รวมทงปจจยตางๆททาลายคณสมบตของของโลหต เชน ระยะเวลา การเกดสนมของอาวธ ความรอน ความชน หรอการซกกรณเปนคราบทเสอผา ทาใหเหนเปนเพยงรอยคราบไมอาจทราบไดวาเปนคราบเลอดของมนษย คราบเลอดสตว หรอเปนคราบของอาหารและเครองดม ในการสบสวนอาชญากรรมนน การตรวจคราบโลหตเบองตน(Presumptive test) เปนวธการทสาคญ เนองจากเปนสงแรกในการดาเนนการกบวตถพยานซงในบางครงวตถพยานมปรมาณนอย และเปนประโยชนอย า งมากทจะใหค าตอบและเ ปนหลกฐานประกอบสอบสวนค ด ดงนนว ธก าร

สำนกหอ

สมดกลาง

2

ตรวจคราบโลหตเบองตนควรเปนวธทมทง ความไว ความจาเพาะ ขนตอนการทดสอบงายไดผลการทดสอบรวดเรวและมความถกตอง [4]

ปจจบนการทดสอบคราบโลหตในงานดานการตรวจสถานทเกดเหตนนมหลายวธในการคนหาและตรวจพสจนคราบโลหตเบองตน(Presumptive test)มวธการทดสอบหลายวธเชน การทดสอบ luminol

และ Bluestar luminol เปนวธการทนยมใชอยางไรกตามมขอจากดวาตองทาการทดสอบอยในสภาวะทมด การทดสอบ benzidine test เปนการทดสอบทใชประโยชนของตวเรงปฏกรยา จากการทาปฏกรยาระหวางเลอดกบ ethanol/acetic acid solution แตจะมผลบวกปลอมทหลากหลาย เชน การoxidation จากผลไม, ผก และยงเปนสารกอมะเรง การทดสอบ Leucomalachite green (LMG) มสภาวะเปนกรด โดยเรงปฏกรยาของ heme ใหผลการทดสอบเปนสเขยวLMG มความไวใกลเคยง กบนายาKastle-Mayer test และไมจาเพาะกบสายพนธการทดสอบดวยนายาKastle-Mayer test เปนทนยมใชในปจจบนเปนการทดสอบเบองตนในการทดสอบคราบโลหต ดวยหลกการ hemoglobin ในเมดเลอดแดงเปนตวเรงปฏกรยาให peroxides ใหเกด oxidation เปลยน reduce form ของ phenolphthalein จากสารละลายไมมส เปลยนเปน phenolphthalein ซงมสชมพ เนองจากการทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer test เปนการทดสอบคราบโลหตเบองตน ไมสามารถแยกเลอดมนษยออกจากเลอดสตวได และใหผลการทดสอบเปนบวกปลอมจากสาร oxidizing

agent เชน ดางทบทม, นายาฟอกขาว และพชผกผลไม บางชนดทมเอนไซม peroxidase เชน มนฝรง, หวผกกาด, บรอกโคล, กะหลาดอก, แตงกวา, มะเขอเทศ ดงนนจงจาเปนตองมการทดสอบเพอแยกวาเปนเลอดของมนษยหรอสตวอกครง [5,6,7] ปจจบนมชดทดสอบโลหตมนษยเชน Hexagon OBTI ใชหลกการทางภมคมกนแตยงมขอจากดในการทดสอบคอ นอกจากจะใหผลบวกกบ Hemoglobin ของมนษยแลวยงใหผลบวกกบ Hemoglobin ของสตวชนดอนดวย ไดแก Primate(สตวเลยงลกดวยนมชนดหนง)Ferret(สตวเลยงลกดวยนมตระกลเดยวกนกบชะมด)[8]และยงมชดทดสอบอกหลายชนดทผลตจากหลายๆบรษท เชน RSIDTM Human Blood เปนชดทดสอบทมความจาเพาะตอ glycophorin A ของมนษย อกทงยงมความคงทนตอการถกทาลายจากผงซกฟอกทม active oxygen[9] แตมราคาคอนขางแพง ชดทดสอบ ABAcard HematraceTM ผลตภณฑชนดนมใชในตางประเทศเทานนยงไมไดมการนาเขามาใชในประเทศไทย

ในการศกษาเปรยบเทยบความไวและความจาเพาะของนายาตรวจคราบโลหตเบองตน(Presumptive test)ใหผลการศกษาทแตกตางกนไป ในการศกษาของ Johnston และคณะพบวาชดทดสอบ Hexagon OBTI Kit มความไวในการทดสอบเทากบ LMG และนายา Kastle-Meyer test[10]การศกษาของ

สำนกหอ

สมดกลาง

3

Cox พบวานายา Kastle-Meyer test มความจาเพาะตอการตรวจคราบเลอดมากกวา Orthotolidine และ Tetramethyl benzidine (TMB)[4]

ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood test เปนผลตภณฑทางการแพทยอกชนดหนงทใชสาหรบการทดสอบหาเลอดมนษยในอจจาระโดยอาศยหลกการ Immunochromatographic Assay เปนการทาปฏก รยาระหวางเอนตเจนและแอนตบอด มคณสมบตทจ าเพาะในการทาปฏก รยากบ Human

hemoglobin โดยตรง เปนชดทดสอบสาเรจรปใชงายสะดวก และราคาไมแพง ซงจากขอจากดของนายาตรวจคราบโลหตเบองตน Kastle-Meyer test ทพบนนเปนสงสาคญทตองศกษาถงประสทธภาพดานความความไว และความจาเพาะของชดทดสอบ เพอศกษาวาชดทดสอบชนดใดมประสทธภาพทด มความเหมาะสมกบสภาพแวดลอมของประเทศไทยมากทสด(ตดราคาและความปลอดภยออกคะ) ดงนนในการศกษาวจยครงนจงมงเนนศกษาเปรยบเทยบนายา Kastle-Meyer test ซงใชทดสอบคราบโลหตเบองตนทใชในประเทศไทยในปจจบน และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ซงเปนชดทดสอบเลอดในอจจาระ นามาประยกตใชทดสอบคราบโลหตเนองจาก ชดทดสอบ FOB 1-Step

Fecal Occult Blood มความจาเพาะกบเลอดมนษย และเปนชดทดสอบสาเรจรปใชงานงาย จงควรมการศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult

Blood เพอนาผลของการศกษามาเปนแนวทางในการประยกตใชตรวจคราบโลหตในสถานทเกดเหตในประเทศไทยตอไป

2. วตถประสงคของการวจย

1. เพอศกษาเปรยบเทยบความไวของการทดสอบโลหตมนษยระหวาง Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

2. เพอศกษาเปรยบเทยบความจาเพาะของการทดสอบโลหตมนษยระหวาง Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

3. สมมตฐานของการวจย 1. Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood มความไวตอการตรวจโลหตมนษยตางกน

2. Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood มความจาเพาะตอโลหตมนษยตางกน

สำนกหอ

สมดกลาง

4

4. ขอบเขตของการวจย การศกษาครงนเปนการศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายาKastle-Meyer test และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ในการทดสอบคราบโลหตมนษยเบองตนโดยทาการทดสอบกบโลหตมนษยบนพนผวตางๆและสภาวะแวดลอมทตางกน(คราบโลหตมนษยบนผาฝายซกดวยเครองซกผาอตโนมตโดยใชผลตภณฑซกผา, ซกดวยนาเปลาโดยวธการซกมอ, คราบโลหตมนษยบนผาฝายเกบไวมากกวา 2 เดอนโดยวางไวทโลงแจงและอณหภมหอง, คราบโลหตมนษยบนผากอสวางทงทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน, , คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนไมอดผวเรยบ, กระเบองเคลอบ, ยปซมบอรดและบนฝาเพดาน)เลอดสตวจานวน 6 ชนดไดแก ไก, หม, วว, แมว, สนข, นก และเลอดมนษยเจอจางดวยนากลนความเขมขนตางกน17 ระดบดงน1:100,1:10,000, 1:50,000, 1: 60,000, 1: 70,000, 1:80,000,

1:90,000, 1: 100,000, 1:200,000, 1:300,000, 1:400,000, 1:500,000, 1:600,000, 1:700,000, 1:800,000,

1:900,000 และ 1:1,000,000 5. นยามศพทเฉพาะ 1.Kastle-Meyer test หมายถง เปนวธการทดสอบเบองตนเพอทดสอบหาคราบโลหตและ hemoglobin 2. ชดทดสอบ FOB (Fecal Occult blood )หมายถงชดทดสอบหาเลอดทมจานวนนอยมากซงมองไมเหนดวยตาเปลาในอจจาระ 3. ความไว (Sensitivity) ปรมาณของสารทตองการวเคราะหทนอยทสดทวธวเคราะหนนสามารถตรวจได

4. ความจาเพาะ (Specificity) ความสามารถในการตรวจพบสารชนดหนงไดอยางแมนยาโดยไมมปฏกรยาขามระหวางสารสองชนดหรอสารอนๆ

6. ตวแปรทใชในการวจย ตวแปรอสระ (Independent Variable) ไดแก เลอดมนษย เลอดสตว คราบโลหตบนพนผวตางๆและสภาวะแวดลอมทตางกน ตวแปรตาม (Dependent Variable) ไดแกประสทธภาพของนายาทง 2 ชนด

สำนกหอ

สมดกลาง

5

7. กรอบแนวคดในการวจย

การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal

Occult Blood เพอใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหต มกรอบแนวคดในการวจยดงน

รปท 1.1 กรอบแนวคดในการวจย

8. ประโยชนทจะไดรบ

1. เพอเปนขอมลในการตดสนใจเลอกชดทดสอบทมประสทธภาพ ในการตรวจคราบโลหตมนษยในสถานทเกดเหต และเปนแนวทางสาหรบเจาหนาทปฏบตงาน ในการพจารณาเกบรวมรวบพยานหลกฐานทางชววทยาในสถานทเกดเหต

2. เพอเปนแนวทางในการพฒนาปรบปรง ควบคม และกาหนดมาตรฐานของชดทดสอบคราบโลหตมนษย เพอนาไปใชในงานนตวทยาศาสตรตอไปในอนาคต

3. เพอเปนแนวทางในการพฒนางานวจย ดานการทดสอบคราบโลหตในสถานทเกดเหตตอไป

เปรยบเทยบประสทธภาพ

ความจาเพาะ

ความไว

นายาและชดทดสอบโลหต

นายา Kastle-Meyer

ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal

Occult Blood

เลอดมนษย

เลอดสตว 6 ชนด

คราบโลหตบนพนผวและสภาวะแวดลอมตางๆ

6

บทท 2

วรรณกรรมทเกยวของ

การศกษาคณสมบตการศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood เพอใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหตผวจยไดศกษาคนควาเอกสาร แนวคด ทฤษฎและงานวจยทเกยวของ เพอเปนแนวทางในการดาเนนการศกษาวจย ดงน

1. การพสจนคราบโลหตในทางนตวทยาศาสตร 2. ความรเกยวกบโลหตและองคประกอบของโลหต 3. ความรเกยวกบการเกบวตถพยานและวตถพยานทเปนโลหต

4. ความรเกยวการตรวจพสจนคราบโลหต 5. ความรเกยวกบนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood 6. ผลงานวจยและวรรณกรรมทเกยวของ

1. การพสจนคราบโลหตในทางนตวทยาศาสตร การตรวจพสจนคราบโลหตนน สามารถพสจนไดวารอยคราบนนเปนคราบโลหตหรอไม เปนโลหตของมนษยหรอสตว เนองจากปจจยบางอยางมผลตอการทาลายคณสมบตของเลอด ไดแก ระยะเวลา การเกดสนมของอาวธ ความรอน ความชน การปดบงอาพรางสถานทเกดเหตโดยการเชด หรอลาง รวมถงการซกลางกรณเปนคราบทเสอผา ประโยชนของโลหตในการสบสวนชวยในการบอกวาทใดเปนสถานทเกดเหต บอกไดวามการกระทาความผดเกดขน ชวยระบวาใชอาวธชนดใดในการกระทาความผด ชวยพสจนคาใหการของผตองสงสย ชวยแยกผบรสทธออกจากผกระทาผด ในทางนตวทยาศาสตรวตถพยานทเปนโลหตจงเปนวตถพยานทมความสาคญ และมกพบอยในสถานทเกดเหต ในคดอาญาประเภทประทษรายตอรางกายและชวต เชน คดฆาตกรรม ขมขนกระทาชาเรา และคดอนๆทคลายคลงกบคดเหลาน มกพบคราบโลหตเปรอะเปอนอยตามสถานทตางๆเชน พน, ฝาผนง, เสอผา, ตามรางกายของผเสยหายหรอคนราย

7

และอาวธทใชทาราย เลอดทไหลออกมาเปรอะเปอนอยตามทตางๆดงกลาวนน จะมลกษณะเกาะแนนเปนหยดเลอด หรอคราบเลอด [1,2] ในจานวนของเหลวจากรางกายทงหมด เลอดเปนชววตถพยาน ทสาคญอยางมาก ในการนาไปใชตรวจหาหมเลอดและดเอนเอ เพอบงบอกวาเปนเลอดของใคร และยงสามารถใชเปนหลกฐานในการเชอมโยงผเสยหาย ผตองสงสย และสถานทเกดเหตเขาไวในเหตการณเดยวกนโดยอาศยลกษณะของคราบเลอดทปรากฏในทเกดเหตเชน ปรมาณเลอด ขอบเขตการกระจายของเลอด รอยปาย รอยลาก เปนตน นอกจากนลกษณะรปรางของหยดเลอดยงสามารถบงบอกถงระยะและทศทางของเลอด ทมาตกกระทบพนผวได ขอมลเหลานลวนเปนประโยชนอยางยงในการทจะนาไปใชประกอบการพจารณาถงพฤตการณของคดทเกดขน การตรวจคราบเลอดในหองปฏบตการนน คราบเลอดควรมปรมาณมากพอ ตอการตรวจพสจน [7]

2. ความรเกยวกบโลหตและองคประกอบของโลหต

เลอดและสวนประกอบของเลอด

เลอดเปนองคประกอบทสาคญยงของรางกาย โดยทวไปสาหรบผทมนาหนกตวประมาณ 70 กโลกรม จะมเลอดประมาณ 5 ลตร หรอมเลอดประมาณ 70 มลลลตรตอนาหนกตว 1 กโลกรม [11] ระบบไหลเวยนเลอดของมนษยและสตวนน ทางานรวมกนอยางมระบบ เพอจดหาปจจยพนฐานทจาเปนสาหรบเซลลในรางกาย ทาใหเซลลสามารถดารงชพ และทาหนาทไดอยางมประสทธภาพ ทาใหสงมชวตนนสามารถดารงชพอยไดอยางปกต [12]

2.1 หนาทของเลอด (Function of blood) เลอดมหนาทสาคญ [12] ดงน

1. การขนสง (Transportation)

1.1 การขนสงสารอาหาร (Nutrient transportation) เลอดมหนาทขนสงอาหารหรอผลตผลของสารอาหารตางๆ ทไดจากการยอยในระบบทางเดนอาหาร ดดซมเขาสเสนเลอดฝอยแลวขนสงไปสเนอเยอตางๆ ทวรางกาย

1.2 การขนสงแกส (Gaseous transportation) โดยฮโมโกลบน ซงเปนโปรตนทอยในเมดเลอดแดงและมคณสมบตในการจบกบออกซเจนเปนออกซฮโมโกลบน (oxyhemoglobin) โดยเฉพาะทปอด

เพอนา ออกซเจนไป

1.3 การขนสงของเสย (Waste product transportation) ของเสยทไดจากขบวนการเมทตาบอลซม ในเนอเยอตางๆ ของรางกาย เชน ยเรย, กรดยรค, ครเอตนน และพวกแรธาตตางๆจะถกขนสงออกจากเนอเยอไปขบออกทไต ผวหนง และอวยวะอนๆ เพอกาจดออกจากรางกาย

8

1.4 การขนสงฮอรโมน (Hormone transportation) ฮอรโมนตางๆทผลตไดจากตอมไรทอ

(endocrine gland) จะถกขนสงไปยงเนอเยอหรออวยวะเปาหมาย (target organ) โดยเลอด

2. การควบคม (Regulation)

2.1 การควบคมความเปนกรด-เบสของรางกาย (Regulation of body pH) ขบวนการเมทตาบอลซมและปฏกรยาทางชวเคมตางๆ ทเกดขนในรางกาย รวมทงการเผาผลาญอาหารหรอผลจากการไดรบยาหรอสารเคมตางๆ เขาไป จะมผลทาใหความเปนกรด-เบส ของรางกายเปลยนแปลง เชน การเกดแกสคารบอนไดออกไซด กรดแลคตก เปนตน โดยเลอดจะทาหนาทเปนบฟเฟอรชวยรกษาระดบความเปนกรด-

เบสในรางกายใหคงท หรอมการเปลยนแปลงนอยทสด

2.2 การควบคมอณหภมของรางกาย (Regulation of body temperature) เลอดควบคมอณหภมหรอความรอนภายในรางกายโดยการกระจายความรอนและการขบเหงอ

2.3 การควบคมนาในรางกาย (Regulation of water balance) เลอดทาหนาทรกษาสมดลของของเหลวในกระแสเลอดกบของเหลวในเนอเยอโดยการแลกเปลยนของนา 3. การปองกน (Protection)

3.1 การปองกนการสญเสยเลอด (Protection of blood loss) เมอเกดบาดแผลขนกบรางกายไมวาจะเปนทผวหนงหรออวยวะภายในของรางกาย เลอดจะมกลไกการหามเลอด โดยอาศยปจจยในการแขงตวของเลอดรวมถงเกลดเลอด ชวยใหเกดการอดปดบาดแผล

3.2 การปองกนสงแปลกปลอม (Protection of foreign body) เลอดทาหนาทปองกนสงแปลกปลอม เชน เชอโรค ตลอดจนสารพษทเขาสรางกาย โดยอาศยกลไกการทางานของเมดเลอดขาว เกลดเลอด และแอนตบอด (antibodies) ทไหลเวยนในกระแสเลอด

2.2 องคประกอบของเลอด

เลอดจดเปนเนอเยอเกยวพน (Connective tissue) ชนดหนง ทมลกษณะเปนของเหลวไหลเวยนอยในหลอดเลอด ประกอบดวย

1. สวนทเปนนาเลอดทเรยกวา พลาสมา (plasma) เปนของเหลวทเปนตวกลางใหเมดเลอดแขวนตวลอยอย คดเปนสดสวนประมาณ 55 เปอรเซนตของเลอด

2. สวนทเปนเมดเลอด (Corpuscles หรอ formed elements) คอสวนทเปนตวเซลลแขวนลอยไหลเวยนในหลอดเลอดทวรางกาย ไดแก เมดเลอดแดง เมดเลอดขาว และเกลดเลอดหรอทรอมโบไซต คดเปนสดสวนประมาณ 45 เปอรเซนตของเลอด

9

รปท 2.1 แสดงองคประกอบในเลอดหลงจากปนใหตกตะกอน [11]

2.3 พลาสมา (Plasma)

พลาสมา หมายถง นาเลอดทแยกเอาสวนของเมดเลอดออกไปแลว มลกษณะเปนของเหลวสเหลองใส ซงมสารตางๆ ละลายอย ไดแก โปรตนชนดตางๆ รวมถงปจจยในการแขงตวของเลอด

คารโบไฮเดรต ไขมน วตามน เกลอแรตางๆ (อเลกโทรไลต) ฮอรโมน และสารอนๆ สวนประกอบของพลาสมา ไดแก นาประมาณ 90 เปอรเซนต โปรตนชนดตางๆ 7 เปอรเซนต เชน อลบมน โกลบลน และไฟบรโนเจน และอก 3 เปอรเซนต เปนสวนของแกสทละลายอยในนาเลอด อออนตางๆ ฮอรโมน และสารอาหารชนดอนๆ

โปรตนในพลาสมามคณสมบตทางกายภาพทสาคญทางสรรวทยา โดยอลบมนและโกลบลนเปนตวสาคญทเกยวของกบความดนออสโมตก (colloid osmotic pressure) ในการรกษาสมดลของนาในรางกาย

โกลบลน ซงมอยในรปของแอลฟา (α) บตา (β) และแกมมา(γ) เกยวของกบการสรางแอนตบอด ฮอรโมนและเอนไซมชนดตางๆ ไฟบรโนเจนชวยในการแขงตวของเลอด โปรตนทงหมดในพลาสมาทาหนาทเปนบฟเฟอรชวยควบคมระดบความเปนกรด-เบส และทาใหเกดความหนดของเลอด

10

2.4 เมดเลอด (Corpuscles หรอ formed elements)

ไดแกเซลลเมดเลอดแดง มมากทสดประมาณ 95.1% เซลลเมดเลอดขาวมประมาณ 0.1% และเกรดเลอดประมาณ 4.8% ซงเซลลเมดเลอดจะมลกษณะและหนาทตางๆกนดงน

รปท 2.2 องคประกอบของเลอด [12]

1. เมดเลอดแดง (Erythrocyte, red blood cell)

มลกษณะเปนถงรปรางกลม ตรงกลางเวาเขาหากนทงสองดาน (biconcave)ทาใหรปรางเปลยนไดมาก โดยไมทาใหปรมาตรเปลยน เชน ขณะผานหลอดเลอดฝอย ปรมาตรจะเพมไดมากโดยแรงตงผวและ

11

พนทผวเปลยนเพยงเลกนอย ภายในเมดเลอดหอหมสารละลายตางๆ ซงสวนใหญคอ ฮโมโกลบน

(hemoglobin) เอนไซม (enzyme) และพวกอออน (ion) เพอทาหนาทขนถายออกซเจน และคารบอนไดออกไซดระหวางปอด และเนอเยอตางๆ ทวรางกาย และทาหนาทเปนบฟเฟอรทปรบความสมดลของกรดและเบส (acid - base buffer) ของเลอด เมดเลอดแดงถกสรางในไขกระดก โดยมความดน

ปรมาณออกซเจนในเลอดตลอดจนการเสยเลอด และการไดรบเลอด เปนปจจยทสาคญเกยวของกบการสรางเลอด มฮอรโมนอรโทรพอยอตน (Erythropoietin) ในเลอดเปนตวควบคมการสรางเมดเลอดแดง ปรมาณเมดเลอดแดงในเลอดในเพศชายมคาเทากบ 5.5-6.0 ลานเซลล/ลกบาศกมลลลตร และในเพศหญงมคาเทากบ 4.5-5.0 ลานเซลล/ลกบาศกมลลลตร โดยปรมาณเลอดขนอยก บ อาย บทบาทของรางกาย

ภมอากาศ ระดบความสงของทอย พยาธสภาพของโรค ทเกดกบรางกาย

รปท 2.3 แสดงเซลลตนกาเนดการพฒนาการ และโครงสรางของเมดเลอดชนดตางๆ[13]

12

รปท 2.4 แสดงลกษณะโครงสรางของฮโมโกลบน [14]

ฮโมโกลบน (Hemoglobin, Hb) คอโปรตนในเมดเลอดแดง ทาหนาทรบสงแกสออกซเจน และเปนบฟเฟอรชวยปรบความสมดลของกรดและเบส แตละโมเลกลของฮโมโกลบนประกอบดวย 4 หนวยยอย แตละหนวยยอยประกอบดวย 1 ฮม (heme) จบกบเปปไทดสายยาว (polypeptide) 1 สาย ภายในมธาตเหลก (Fe) 1 อะตอม ฮโมโกลบนเมอจบกบออกซเจน จะเรยกวาออกซฮโมโกลบน (Oxyhemoglobin) โดยการจบกบของฮโมโกลบนกบออกซเจน ขนอยก บ อณหภม ความเปนกรด -เบส ปรมาณคารบอนไดออกไซดและปรมาณออกซเจนในละลายอยในกระแสเลอด ( pCO2 และ pO2 )

อาการไซยาโนซส (Cyanosis) พบเมอเลอดมสคลายเลอดดา มฮโมโกลบนทไมไดจบกบออกซเจน (Deoxyhemoglobin) อยมาก ผวหนงมลกษณะเขยวคลา ซงจะเหนไดชดทเลบมอ เลบเทา รมฝปาก ทงนปกตเมทฮโมโกลบน (Methemoglobin) ซงจบกบธาตเหลก (Fe2+) ในฮมจะถกออกซไดซไปเปนเหลกออกไซด (Fe3+) ทา ใหฮโมโกลบนมสคลา

Methemoglobin: Fe2+ Fe3+ ----------------> "Hb สคลา"

Oxidized

ปรมาตรเมดเลอดแดงอดแนน (Hematocrit ; Hct หรอ Pack cell volume; PCV) เปนคาทางโลหตวทยาของเมดเลอดแดง สามารถหาไดจากการนาเลอดใสในหลอดแกวทมขนาดเลก (capillary tube) นาไป

13

ปนดวยเครองปนเหวยงความเรวสง มหนวยเปนเปอรเซนตเมอเทยบกบปรมาตรเลอดทงหมด มประโยชนตอการวนจฉยการเกดพยาธสภาพของรางกาย เชน ในสภาวะทรางกายขาดนา จะพบ Hct มคาสงกวาปกต

ในผปวยทมภาวะโลหตจาง (anemia) มกพบ Hct มคา ตากวาปกต

2. เมดเลอดขาว (Leukocyte , white blood cell)

เมดเลอดขาวในกระแสเลอดมหลายชนด มหนาทปองกนและทาลายสงแปลกปลอมทเขาสรางกายมคณสมบตทสาคญ 3 ประการ คอ

1. เมดเลอดขาวสามารถเคลอนทผานผนงหลอดเลอดฝอยสเนอเยอ ไปยงบรเวณทมเชอโรค

(Diapedesis)

2. เมดเลอดขาวสามารถเคลอนเขาไปหาเชอโรค โดยการดงดดของสารเคมทถกปลอยจากเชอโรค เชน แบคทเรย (Chemo taxis)

3. เมดเลอดขาวสามารถจบกนสงแปลกปลอมโดยวธคลายอะมบา เขาโอบลอมและยอยเชอโรค หรอสงแปลกปลอมนน (Phagocytosis)

สามารถแบงเมดเลอดขาวออกเปน 2 ชนดใหญๆ คอ

2.1 ชนดมแกรนลหรอมนวเคลยสหลายแบบ (Granulocytic or polymorph nuclear cell) ซงจะแบงยอยตามลกษณะการตดสของแกรนลเมอยอมดวยสไรท ดงน

1. นวโทรฟล (Neutrophil or polymorph nuclear cell, PMN) มขนาดใหญกวาเมดเลอดแดงประมาณ 2 เทา หรอประมาณ 12 ไมครอน มนวเคลยสไดตงแต 2- 5 พ (lobe) ตดสนาเงนปนมวง ในไซโทพลาซมมแกรนลละเอยดมาก ตดสชมพ หรอชมพอมมวง

2. อโอสโนฟล (Eosinophil) มขนาดประมาณ 12 ไมครอน รปรางเหมอนนวโทฟล

ตางกนท สวนใหญนวเคลยสจะม 2 พ ในไซโทพลาซมจะมแกรนลเมดใหญ ตดสสมแดงคอนขางวาวแสงอยเตมไซโทพลาซม และมกจะไมทบนวเคลยส

3. เบโซฟล (Basophil) รปรางเหมอนนวโทฟล ตางกนทนวเคลยสมไดตงแต 2-5 พ แตมกจะเหนนวเคลยสไดไมชด เนองจากถกบดบงดวยแกรนลซงมขนาดใหญตดสนาเงนเขมกระจายทวไซโทพลาซม

14

รปท 2.5 เซลลเมดเลอดชนดตางๆ ทพบในสเมยรเลอดของคนปกต [16]

2.2 ชนดไมมแกรนลหรอมนวเคลยสเดยว (Agranulocytic or mononuclear cell) หมายถง

เมดเลอดขาวทไมมแกรนลเฉพาะ (specific granule) มแตแกรนลไมเฉพาะ(non specific granule) ซงพบไดในเซลลเมดเลอดขาวทกชนด เรยก อะซโรฟลกแกรนล (azurophilic granule) ตดสแดงอยในไซโทพลาซม

เมดเลอดขาวชนดไมมแกรนลน นวเคลยสจะไมแบงเปนพ แตอาจมรอยบมเวา (indented) เปนลอนเหมอนรอยพบ (folding) แบงยอยได 2 ชนดคอ

1. โมโนไซต (Monocyte) เปนเมดเลอดขาวทมขนาดใหญทสดในกระแสเลอด ขนาดใหญกวาเมดเลอดแดงประมาณ 2-3 เทา หรอประมาณ 14-20 ไมครอนนวเคลยสมกจะเวาหรอเปนลอน ไซโทพลาซมตดสเทาออนๆ หรอนาเงนปนเทา และอะซโรฟลกแกรนล เปนเมดเลกๆ ตดสแดงกระจายอยทวไป

2. ลมโฟไซต (Lymphocyte) โดยทวไปเปนเมดเลอดขาวทมขนาดเลกทสด ใหญกวาเมดเลอดแดงเลกนอย (ขนาดประมาณ 10 ไมครอน) แตบางครงอาจพบทมขนาดใหญได (20 ไมครอน)

15

นวเคลยสมกจะกลมหรอร และอาจมรอยเวาไดบาง ตดสเขมทบอยชดรมดานใดดานหนงของเซลล ไซโทพลาซมตดสฟาออนใส และพบอะซโรฟลกแกรนลไดบาง

3. เกลดเลอด (Thrombocyte , platelet)

เปนองคประกอบของเลอดทมขนาดเลกทสด ประมาณ 2-4 ไมครอน ไมมนวเคลยส สวนใหญรปรางกลม แบน หรอ รปไข ตดสฟาออน มพบอะซโรฟลกแกรนล ตดสมวงหรอมวงแดงกระจายอยทวไปกลางเซลล ในคนและสตวเลยงลกดวยนมชนดอนๆ มตนกาเนดมาจากเซลลเมกะคารโอไซต (megakaryocyte) ในไขกระดก ในสตวมกระดกสนหลงชนดอน จะพบองคประกอบนเปนเซลลทเรยกวา ทรอมโบไซต (thrombocyte) ทาหนาทสาคญเกยวกบการแขงตวของเลอด ชวยทาใหเลอดหยดไหลหรอหามเลอดเมอเกดบาดแผล

2.5 ระบบหมเลอด (Blood group systems)

บนเมดเลอดแดงมแอนตเจนมากกวา 600 ชนด จดแบงออกเปนหมเลอดได 23 ระบบ ซงหมเลอด ABO มความสาคญมากทสด และหมเลอด Rh เปนหมเลอดทมความสาคญรองลงมา นอกจากระบบหมเลอด ABO และ Rh แลวยงมหมเลอดอกกลมหนงทมแอนตบอดซงไดเกดเองโดยธรรมชาต อาจทาใหเกดปญหาจากการทเมดเลอดแดงมอายสนกวาปกต (short survival) หมเลอดเหลานไดแก หมเลอดระบบ Lewis, P และ MNSs ทสาคญกวานคอหมเลอดระบบ Kell, Kid, Duffy, Diago และ Lutheran ซงแอนตบอดสวนใหญเกดจากการกระตนโดยการใหเลอดหรอการตงครรภ [15]

1. หมเลอดระบบ ABO คนพบโดย Karl Landsteiner ในป 1990โดยพบ หม A หม B และ หม O กอน จากนนอก 2 ปตอมาจงมการพบหม AB โดยผรวมงานของเขา การคนพบหม ABO น มประโยชนมากเพราะหมเลอดระบบนมความสาคญทสดในการใหเลอด แอนตเจนของหมเลอดระบบ ABO

สามารถตรวจพบแอนตเจน A และ B ได ตงแต embryo ทมอายประมาณ 5-6 สปดาห แตการสรางยงไมเจรญเตมท เมออาย 2-4 ป จงมปรมาณแอนตเจนเทาผใหญซงจะคงทตลอดไป แตความแรงของแอนตเจน จะลดลงไดในผสงอายหรอในผปวยโรค Leukemia บางราย โดยการสรางแอนตเจน A และ B เรมจากสาร precursor substance คนทมยน H(HH, Hh) จะมการสราง H substance ตอจากนน H substance จะถกเปลยนเปน A และ B แอนตเจน ขนอยกบวามยน A หรอ ยน B ควบคม สวนหม O นนไมมยน A หรอ B จงไมมการสราง A และ B แอนตเจน บนเมดเลอดแดงยงคงม H substance อย สวนคนทไมมยน H แตมยน h

(hh) จะไมสามารถสราง H substance ได จงยงคงม precursor substance อยเชนเดม ดงนนถงแมจะมยน A หรอ B ซงสามารถถายทอดไปยงลกได แตไมสามารถสราง A และ B แอนตเจนได บนเมดเลอดแดงจงไมม

16

ทง A, B และ H แอนตเจน แตในซรมจะมทง anti-A, anti-B และ anti-H เรยกเลอดชนดนวาเปน O Bombay

สามารถตรวจสอบหมเลอดโดยอาศยปฏกรยาทางวทยาภมคมกน ระหวางแอนตเจนบนผวเมดเลอดแดงและแอนตบอดทจาเพาะตอกน เกดปฏกรยาการเกาะกลม (agglutination) ของเมดเลอดแดง

รปท 2.6 แสดงการจบกลมตกตะกอนของหมเลอดระบบ ABO [14]

2. หมเลอดระบบ Rh หมเลอดระบบน คนพบโดย Landsteiner และ Wiener ซงไดทาการฉดเมดเลอดแดงของลงรซส (Rhesus) เขาไปในกระตาย ซรมของกระตายสามารถทาปฏกรยากบเมดเลอดแดงของคนผวขาวได จากการศกษาตอมาพบวาหม เลอดนมแอนตเจนทสาคญคอ แอนตเจน C, c, D, E และ e

แตละตวมแอนตบอดทจาเพาะซงไดแก anti-C, anti-c, anti-D, anti-E และ anti-e ในกรณทตรวจไมพบ D

แอนตเจนถอวาเปน d จดเปนหมเลอดทมความสาคญมากอกระบบหนง ในคนไทยสวนใหญเปนมหมเลอด

Rh positive มเพยง 0.3% ทเปน Rh negative หมเลอดระบบนทาใหเกดการแตกของเมดเลอดแดง hemolytic

disease of the newborn สาเหตมกพบในลกคนทสองของแมทมหมเลอด Rh negative และไดรบการกระตนใหสรางแอนตบอด (immune antibody) จากลกคนแรกทมหมเลอดเปน Rh positive เมอเลอดของแมทมแอนตบอดนผานรกไปยงลกทอยในครรภซงมแอนตเจนทจาเพาะกนมผลใหมเกดการทาลายเลอดแดงของลก ทาใหเกดการเสยชวตของทารก[15]

17

รปท 2.7 แสดงปฏกรยาการจบกลมของเมดเลอดแดงในหมเลอดกลมตางๆ ของแอนตเจนทอยทผวของเมดเลอดแดง กบแอนตบอด [14]

2.6 การทาลายเมดเลอดแดง (red cell destruction)

เมดเลอดแดงมอายเฉลยประมาณ 120 วน ระยะทางทเคลอนทในระบบไหลเวยนประมาณ 700

ไมล และในทสดจะถกทาลาย การเคลอนทอยในหลอดเลอดยอมมการเสยดส ระหวางผนงเมดเลอดและหลอดเลอด รวมทงสมผสกบสารเคมตางๆ ในเลอด มผลใหผนงเมดเลอดเสอม เมดเลอดทอายมากจงแตก

(hemolysis) ไดงาย ซงปกตอตราการสรางเมดเลอดเทากบอตราการทาลาย (ประมาณ 1% ของปรมาณเมดเลอดแดงทงหมดตอวน) ถาอตราสรางสงกวาอตราการทาลายมผลใหปรมาณเมดเลอดแดงในเลอดสงขนปรมาณเมดเลอดแดงอดแนนมากขน (polycythemia) และถาอตราการสรางตากวาอตราการทาลาย จะมผลใหปรมาณเมดเลอดแดงอดแนนตาลง (anemia) เมดเลอดแดงทมอายมากจะถกทาลายใน reticuloendothelial

system สวนใหญถกทาลายในมาม (spleen) ฮโมโกลบนจะถกแยกออกเปน heme และ globin heme จะถกเปลยนเปน biliverdin แลวเปน bilirubin เขาสตบ แลวออกมากบนาดสลาไสเลก ซงบางสวนถกดดซมกลบเขาสกระแสเลอดแลวถกขบออกทไตปนออกมากบปสสาวะ Bilirubin มสเหลองทองถามความเขมขนเกน 2

มลลกรม/100 มลลลตรพลาสมา จะทาใหผวหนง scleras และ mucous membrane มสเหลอง เรยกอาการเชนนวา ดซาน (juandice) หรอ kernicterus การเพมขนของปรมาณ bilirubin ในเลอด เรยกวา hyperbilirubinemia เกดไดจากหลายสาเหตเชน เมดเลอดแดงถกทาลายมากวาปกต เชน hemolytic anemia

18

bilirubin เขาเซลลตบไดนอยลง การหลง bilirubin จากเซลลตบส bile canaliculi ผดปกต หรออาจจะเกดจากทอนาด อดตน[12]

3. ความรเกยวกบการเกบวตถพยานและวตถพยานทเปนโลหต

3.1 การเกบวตถพยาน

ในขณะทาการตรวจคนหาพยานหลกฐาน เมอพบสงใดทใชเปนพยานวตถได ผเกบมหลกการทควรยดถอปฏบตเปนลาดบดงน [1, 2, 3]

1. บนทกตาแหนงและสภาพของพยานวตถ เมอตรวจพบสงใดระหวางการตรวจสถานทเกดเหต กอนจะจบตองหรอหยบขนมาตองมการบนทกตาแหนงและสภาพของวตถพยานนนใหเรยบรอยเสยกอน

2. ถายภาพพยานวตถทตรวจพบไว พยานวตถทกชนจะตองทาการถายภาพ ระยะไกล ระยะกลาง ระยะใกล ระยะใกลวางสเกล ไวกอนทาการเกบวตถพยาน เพอแสดงถงความสมพนธกบพยานวตถกบสภาพโดยรอบ และเพอใหเหนพยานวตถจรงและใหทราบขนาดทแนนอนของวตถพยานทจะทาการเกบ

3. ตาหนสญลกษณเพอใหเปนหลกฐานวาเปนสงทตรวจพบในคดใด เมอใด โดยใครการทาตาหนควรทาทพยานวตถทกชนและทาในตาแหนงทจะไมกระทบกระเทอนตอการตรวจพสจน 4. เกบรวบรวมวตถพยานเปนขนตอนสดทายของการปฏบตตอพยานวตถ เพอนาไปดาเนนการทางคดตอไปเปนขนตอนทมความสาคญเพราะหากบกพรองอาจทาใหเกดการสญหาย หรอการแปรสภาพของพยานวตถทจะตามมาได หากผเกบรวบรวมทาไมถกวธ โดยตองทาการเกบพยานวตถทสญหาย หรอเสยหายไดงายเปนอนดบแรก ในกรณทมวตถพยานหลายชนตองแยกบรรจไมนามาเกบไวในทเดยวกน เพราะอาจทาใหเกดการสบสน และพยานวตถบางชนดอาจเสยสภาพไป[2, 3]

3.2 วธการเกบวตถพยานทเปนโลหต 1. เลอดเปยก 1.1 ปรมาณมากหรอเปนกอง

1.1.1 ใชหลอดฉดยา (Dropper) ดดเกบของเหลวใสในภาชนะบรรจทปราศจากเชอ (Sterile) ปรมาณทใชในการตรวจพสจน 5 มลลลตร

1.1.2 รบนาสงตรวจพสจนทนท หากไมสามารถทาไดใหแชไวในตเยน หรอถงนาแขงแตหามนาไปแชแขงโดยเดดขาด

19

1.1.3 ในบางประเทศศาลอนญาตใหใชสารเคมเชน โซเดยมอะไซด ใสลงไปเพอปองกนเลอดเสยได

1.2 ปรมาณนอย

1.2.1 ใชสาลชนด 100 เปอรเซนต ผากอส กะดาษซบ ผาขาวสะอาด หรอกระดาษเยอ อยางใดอยางหนง ซบเกบขนมา 1.2.2 นาไปผงลมใหแหงหามผงแดด เพอปองกนไมใหโลหตเสยหรอเสอมสภาพ

1.2.3 เกบในหลอดทดลองหรอภาชนะอนทผานการฆาเชอแลว

2. คราบเลอดแหง

2.1 บนผววสดไมดดซม

2.1.1 ถามปรมาณของเลอดแหงไมเพยงพอ ใหใชใบมดโกนทสะอาดขดออกจากผวของวสด กรณทไมสามารถใชวธการขดได ใหใชกระดาษซบ สาล ผากอส อยางใดอยางหนงทสะอาดขนาดพอสมควร ชบนาเกลอ (นาเกลอผสม 0.9) หรอนากลน ปดทบตรงคราบเลอดจนคราบเลอดซมออกมาทกระดาษ (สงเกตจากส) และนากระดาษผงลมใหแหง วธนตองนาของกลางควบคม (Control sample) สงไปตรวจพสจนพรอมกบของกลางปญหาดวย

2.1.2 เกบไวในภาชนะทผานการฆาเชอโรค

2.2 บนพนวสดดดซม เชนไมทเคลอบผว สงของทจาเปนจากเสนใย

2.2.1 นาวสดทมคราบเลอดสงตรวจพสจนทงชน เชนเสอผา ทอนไมทสงสยวาคนรายใชตผตาย

2.2.2 ใหแยกบรรจหบหอ เชนเสอผาตองไมเกบรวบรวมกบเสอผาผตองสงสย และเกบในภาชนะทผานการฆาเชอโรค ถาวตถนนมขนาดใหญเกนไปไมสะดวกในการนาสงตรวจพสจนทงชนใหแยก ถอด หรอตดเฉพาะสวนทมคราบเลอดตดอยปรมาณเพยงพอนาสงตรวจพสจน 2.2.3 อปกรณเกบเลอดเชน ใบมดโกน มด สาล ใชไดสาหรบรอยเลอดเดยวเทานน เมอจะทาการเกบรอยเลอดใหมกตองเปลยนเพอปองกนการปนเปอนนอกจากนสารจากรางกายผเกบอาจปนเปอนกบเลอดของกลางททาการเกบ

4. ความรเกยวการตรวจพสจนคราบโลหต

4.1 การตรวจพสจนคราบโลหต

การตรวจพสจนคราบโลหตนน เราสามารถทจะตรวจพสจนไดดงน[2, 3]

20

1. รอยคราบหรอสงทสงสยวาจะเปนโลหตนนเปนโลหตหรอไม

2. ถาเปนโลหตแลว จะตองตรวจพสจนวาเปนโลหตมนษยหรอสตว

3. ถาเปนโลหตสตว ควรพสจนวาเปนโลหตของสตวอะไร

4. ถาเปนโลหตมนษย และมจานวนมากพอกสามารถตรวจพสจนโลหตนนวาเปนหมใด

ขนตอนในการตรวจพสจนคราบโลหตทกลาวมานน เพอใหมนใจวาสามารถตรวจหาสารพนธกรรมไดในตวอยางคราบทสงสยนน อกทงชวยหลกเลยงการตรวจวเคราะหสารพนธกรรมทมราคาแพงและใชเวลานานเพอยนยนชนดของเหลวทางชวภาพทตรวจพบ ซงเทคนคตางๆทใชทดสอบคราบเลอดซงแบงตามขนตอนไดดงน [17]

การตรวจลกษณะทวไป

กอนทจะเกบคราบเลอด ควรจะดลกษณะทวไปเสยกอน เชน สของคราบเลอด เลอดสดใหมจะมสแดง ทงไวนาน ๆจะคอย ๆ เปลยนเปนสนาตาลเขม ผาทเปอนเลอดเมอแหงแลวจะแขงคลายผาทลงแปง

การตรวจดวยกลองจลทรรศน จะดไดกรณคราบเลอดใหม โดยดพวกเซลลเมดเลอดขาว เซลลเยอบ

แบคทเรย ถาเปนเลอดประจาเดอน (Menstruation) จะมเซลลเยอบชองคลอดและมแบคทเรยจานวนมาก

การตรวจลกษณะทวไปจะสามารถบอกพฤตกรรมบางอยางไดจากลกษณะของคราบเลอด [5,7] คอ

1. รปรางของคราบเลอด หากเปนการหยดจากบาดแผลตรง ๆ รปรางของหยดเลอดจะกลม แตหากมการเคลอนไหว เชน การสะบดอาวธทเปอนเลอด หยดเลอดจะมรปรางเรยว ซงสามารถบอกทศทางของเลอดได โดยทศทางของเลอดจะเปนไปในทางเดยวกนกบดานปลายเรยวของหยดเลอด

2. การกระจายตวของคราบเลอด เลอดทออกจากเสนเลอดแดงจะมการกระจายไดมากกวาเลอดทออกจากเสนเลอดดา และถาเสนเลอดมขนาดใหญการกระจายกจะมไดมากกวาเสนเลอดขนาดเลก

3. ปรมาณของคราบเลอด มความสมพนธกบบาดแผล ถาคราบเลอดมปรมาณมากแสดงวาบาดแผลมขนาดใหญหรอมการฉกขาดของเสนเลอดขนาดใหญ ถาพบปรมาณเลอดเพยงเลกนอยโดยทบาดแผลมขนาดใหญ แสดงวานาจะมการเคลอนยายศพมาจากทอน หรอไมกเปนบาดแผลภายหลงตาย โดยทาขนเพออาพรางคดตาแหนงของคราบเลอด คราบเลอดทพบตดอยตามประตผนงหองหรอบนวตถอน ๆ อาจเกดจากการพงของเลอดจากเสนเลอด จากการปะทะของผบาดเจบกบสงของนน ๆ หรออาจเกดจากการสมผสกบมอของผตองหาทเปอนเลอดกได

21

รปท 2.8 ลกษณะของคราบเลอดบนพนผวไมเมอเวลาผานไป 1 วน, 2 วน และ 3 วน

รปท 2.9 ลกษณะของคราบเลอดบนผาฝายเมอเวลาผานไป 1 วน, 2 วน และ 3 วน

รปท 2.10 ลกษณะของคราบเลอดบนกระดาษชาระเมอเวลาผานไป 1 วน, 2 วน และ 3 วน

รปท 2.11 ลกษณะของคราบเลอดบนกระจก เมอเวลาผานไป 1 วน, 2 วน และ 3 วน

22

4.2 การทดสอบเบองตนวาเปนคราบเลอดหรอไม การทดสอบแบบงายๆทวไปทผสบสวนใชในการสบสวนทเกดเหตในการทดสอบหาคราบเลอดทเหนไดไมชดเจน โดยใชแหลงกาเนดแสงแบบตางๆในเครอง ALS ทความยาวคลน 420-480 nm เชน UV

light วธการนชวยไดอยางมากถารอยคราบนนอยในทมดไมมแสงหรอฉากหลงเปนสดา แหลงกาเนดแสงทใชประโยชนทเปนทรจกกนดคอ Polilight R ประกอบดวยชวงคลนความยาวแสง และแบงแยกบงบอกรอยคราบใหเหนในรปแบบของการเกดส การทดสอบแบบใชความยาวคลนไมมความเฉพาะ luminol เปนวธการทใชกนบอยในทเกดเหตโดยใชความสามารถ oxidation Hb และอนพนธในเลอด จะออกมาในรปแบบของ alkaline solution และแสดงผลเมอทาการพน spay luminol สวนทสงสย โดยใชการ oxidation

ของ luminol ซงมความไวมาก การทดสอบ luminol ยงคงไดรบความนยมเมอเทยบกบการทดสอบเบองตนอนๆ เปนนายาทไมทาอนตราย อยางไรกตาม luminol มขอจากดวาตองอยในสภาวะทมด การทดสอบ

benzidine, o-tolidine, phenolphthalein, leucomalachite green, และ luminol วธทงหมดนเปน catalytic test

โดยวธ benzidine และ o-tolidine จะใหความไวสง แตมความจาเพาะนอยกวาวธ Kastle-Meyer test และวธ

leucomalachite green นอกจากนวธ benzidine และ o-tolidine ยงเปนสารกอมะเรงจงไมนยมใชกน วธ

Kastle-Meyer test มไวสงกวา leucomalachite green ฉะนนวธ Kastle-Meyer test หรอ phenolphthalein จงเปนวธทนยมใชกนทวไป หลกการคอ อาศย peroxidase-like activity ของ hemoglobin และใช hydrogen

peroxide เปน peroxide เมอ reduced phenolphthalein ซงเปนสารทไมมสถก oxidized จะเปลยนเปนสารสชมพ [5,7]

4.3 การทดสอบเพอยนยนวาเปนเลอดมนษยหรอสตว

หลงจากทพสจนวาสงทสงสยเปนโลหตแลว ตองพสจนตอไปวาโลหตนนเปนของมนษยหรอสตว ในปจจบนมการนาเสนอชดทดสอบใหมๆ ทใชในการทดสอบฮโมโกลบนของมนษย เปนวธทงายและรวดเรว ใชตวอยางในการทดสอบเพยงเลกนอย และสามารถนามาใชอกครงในการวเคราะหพนธกรรม การตรวจดงกลาวมความไวนอยกวาการทดสอบเบองตนแตมความจาเพาะมากกวา แตมความเปนไปไดของการเกดผลบวกปลอม [9] นอกจากนนแลวยงมวธอนๆอกดงน

1. ทดสอบ Precipitin test จะเกดตะกอน ขนขาว โดยใส Anti-Human ลงในหลอดทดลองแลว แลวใสสารละลายโลหตลงไปชาๆปรมาณเทากบ Anti-Human ถาเปนเลอดมนษยจะเกดแถบตะกอนขนขาวบรเวณรอยตอระหวางชนของตวอยางสารละลายโลหตทสงสยได และ Anti-Human serum [2,7]

23

รปท 2.12 แสดงการทดสอบ Precipitin test(แบบ Ring test) [18]

วธ gel diffusion หยดตวอยางเลอดทสกดได และ antihuman serum ใสในหลม 2 หลมทอยตรงกนขามกน ถาเปนเลอดมนษยจะเกดเสนตะกอนขาวระหวางหลมทง 2 ทแอนตบอดและแอนตเจนซมผาน agar gel-coated plate มาพบกน อาจใชวธ electrophoresis เพอชวยเรงใหแอนตบอด และแอนตเจนซมผาน agar ไดเรวขน precipitin test น มความไวสงสามารถใหผลบวกกบคราบเลอดแหงทถก เกบไวนาน 10-

15 ป รวมทงตวอยางเนอเยอของมมมทม อาย 4-5 พนปได และจะไมใหผลบวกกบเลอดของสตวอน ๆ

ยกเวนลง[2,7]

2. ตรวจดวยกลองจลทรรศน จะตรวจไดกรณคราบใหม เชนดขนาดและรปรางของเมดเลอดแดงโดยเลอดคนปกตจะมลกษณะกลม บมตรงกลาง (Biconcave) ไมมนวเคลยส ขนาดเสนผาศนยกลาง 7.5

ไมครอน ขณะทเมดเลอดแดงของนก ปลา กบและง รปรางรนน และมนวเคลยส[17]

24

รปท 2.13 แสดง Precipitin test (แบบ Gel diffusion) [18]

4.4 การตรวจยนยนตวบคคลวาเปนเลอดใคร

ในปจจบนนยมตรวจหาหมเลอดระบบ ABO และการตรวจเพอเปรยบเทยบ ดเอนเอ การตรวจหาหมเลอดระบบ ABO แมวาเมดเลอดแดง จะสลายหมดแลว แตแอนตเจน แอนตบอด ยงคงอยในคราบเลอดจงสามารถทจะตรวจหาสารหมเลอดได โดยใชวธการทดสอบ เชน

วธ Absorption-elution method หลกการคอ แอนตเจนซงอยในคราบเลอดจะจบกบแอนตบอด A,

B, O ซงแอนตเจนในคราบเลอดจะจบกบแอนตบอดชนดเดยวกน แลวนาไปอบทความรอน 56 องศา เพอใหแอนตบอดทจบกนนนหลดออกมาหลงจากนนและนาสวนทเปนนาซงมแอนตบอดหลดออกมาไปทดสอบกบเซลลเมดเลอด A, B, O ถามการปลอยแอนตบอด A กจะใหผลบวกกบเซลล A แตจะใหผลลบกบเซลล B

และ O

25

รปท 2.14 แสดงปฏกรยา Absorption-elution method [19]

วธ Absorption-inhibition method หลกการคอ แอนตเจนในคราบเลอดจะจบแอนตบอดชนดเดยวกนทเตมลงไป แอนตบอดทเตมลงไปจะลดลงจากเดมหรอหมดไป หลงจากนนเตมเซลลเมดเลอดแดง A B O ลงไป แอนตบอดทเหลอจะเกดการจบกลมของเซลลเมดเลอดแดง ถามการจบกลมกบแอนตบอด A

แลวนน เมอเตมเซลลเมดเลอด A จะมการจบกลมนอยลงหรอไมจบกลมเลย [15,19]

รปท 2.15 แสดงปฏกรยา Absorption-inhibition method [19]

26

4.5 ความคงทนของสารหมเลอด

แอนตเจนบนผวเมดเลอดแดงมความคงทนมากกวาแอนตบอด แอนตเจนอยไดนานเปนป ถงแมจะเกบคราบเลอดแหงนนไวทอณหภมหองซงการสลายตวของโปรตนในคราบเลอดนนขนอยกบความรอน

ความชนในสภาพแวดลอม และพนผวทมรอยครบเลอด เชอราและแบคทเรยในคราบเลอดเปนสาเหตทาใหการ ตรวจหมเลอดใหผลบวกเทจหรอผลลบเทจได ดงนนคราบเลอดทแหงเรวจะชวยรกษาคณสมบตของเลอด ไดดกวาคราบเลอดทยงเปยกชนอย ถงแมวาผลการตรวจหมเลอดจากคราบเลอดหมเลอดตรงกบผเสยหายหรอผตองสงสย จาเปนตองตรวจยนยนดวยการตรวจเปรยบเทยบดเอนเอตอไป[12]

5. ความรเกยวกบนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

5.1 หลกการ Immunochromatographic Assay

เปนวธการตรวจทไดรบความนยมมากในปจจบน เนองการใชงานงายและผลการตรวจใกลเคยงกบวธ ELISA วธการตรวจไมตองใชอปกรณมาก ชดตรวจบางอยางไมตองใชเครองมอเสรมอนเลย อกทงการการอานผลทรวดเรว อายการใชงานของชดตรวจประมาณ 2-3 ป และบางชดตรวจสามารถเกบในชวงอณหภมกวางประมาณ 1-30 องศาเซลเซยส การรายงานผลการตรวจเปนแบบเชงคณภาพ (qualitative) และกงปรมาณ (Semi-quantitative) [20]

5.1.1 หลกการการเกดปฏกรยา Immunochromatographic Assay ใชหลกการเกดปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด ซงประยกตมาจากวธการตรวจแบบ ELISA ปฏกรยาจะเกดบนแผน membrane โดยทวไปจะเปน

Nitrocellulose, Nylon ซงในแผนทดสอบจะประกอบไปดวยเสน หรอจดแสดงผลทถกเคลอบไว อยางนอยสองเสน หรอสองจด คอ

1. Control line / Control dot (เสนควบคมหรอจดควบคม) เปนเสนทแสดงคณภาพชดตรวจชดนน ซงเสนหรอจดนจะตองปรากฏเสมอเมอทาการทดสอบ

2. Test Line /Test Dot (เสนทดสอบหรอจด) เปนทแสดงผลการทดสอบ เสนนจะปรากฏหรอไมขนอยกบหลกการของชดตรวจ อาจจะม 1-2 เสน หรอ 1-2 จดซงแอนตเจนหรอแอนตบอดจะตดฉลากดวยสารทมส เชน Colloidal Gold

27

รปท 2.16 แสดงหลกการ Immunochromatographic Assay [21]

5.1.2 ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood หลกการของ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ใชหลกการ Chromatographic immunoassay

ผวของแถบทดสอบ จะถกเคลอบดวย anti-hemoglobin antibody ทบรเวณ Specimen well เมอใสตวอยางทม Antigen hemoglobin จะมการจบกนระหวาง Antigen และ Antibody หลงจากนนจะเกดการเคลอนทไปยงบรเวณ reaction zone (test line, control line) ปรากฏแถบสชมพอมมวง ซงสามารถมองเหนการเปลยนแปลงดวยตาเปลาได ความสามารถของชดทดสอบสามารถทดสอบเลอดในอจจาระไดตาถง 50

ng/mL หรอ 6 ug/g feces [22]

5.1.3 ความจาเพาะของชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood มความจาเพาะตอฮโมโกลบนของมนษย โดยสกดตวอยางในขวด extraction buffer ใหมความเขมขน 1.0 mg /ml และมการควบคมทงผลบวกและผลลบ พบวาชดทดสอบไมมตอการทดสอบฮโมโกลบนของวว, ไก, หม, แพะ, มา, กระตาย และไกงวง

28

รปท 2.17 หลกการ Chromatographic immunoassay [23]

5.1.4 การเกดผลบวกปลอมและผลลบปลอม

การทดสอบหาแอนตเจน มความเปนไปไดในการเกดผลบวกปลอม (จากการขามปฏกรยา) และผลลบปลอม ( Hook effect ) ซงเปนทรจกกนดวาสามารถเกดขนไดเมอตรวจหาเอนตเจนในกรณทตวอยางมความเขมขนตา หรอในทางกลบกนเอนตเจนมความเขมขนสงมากเกนไป ซงในกรณทความเขมขนของเลอดมากเกนไปปฏกรยาการจบกนระหวางแอนตเจน-แอนตบอด ถกกดขวางโดยแอนตเจนทมปรมาณสงเกนไป ซงแกไขโดยการเจอจางตวอยางทมปรมาณแอนตเจนสงกอนทาการทดสอบดงนนในการทดสอบน ผผลตจงแนะนาใหสกดตวอยางดวย extraction buffer กอนทาการทดสอบ

รปท 2.18 การเกดผลลบปลอม ( Hook effect ) [23]

29

5.2 ประวตการทดสอบ Kastle-Meyer test

ในป ค.ศ.1818 Louis-Jacques Thenard คนพบ hydrogen peroxide และในป ค.ศ.1863 Christian

Freidrich Schonbein สงเกตเหน peroxidase-like activity ของ hemoglobin เปนสาเหตของ oxidation ของ

hydrogen peroxide ผลของปฏกรยาระหวาง hydrogen peroxide กบ hemoglobin มฟองเกดขน ในชวงตนของป 1900 Kastle ไดใช phenolphthalein เปน color indicator ของการตรวจ hemoglobin ไมกปตอมา Meyer ไดปรบปรงและพฒนาการทดสอบจงเรยกการทดสอบนวา Kastle-Meyer test [24, 25]

หลกการของการทดสอบนคอ เกดปฏกรยา peroxidation โดย enzyme peroxidase ของสาร phenolphthalein (reduced form) ซงใสไมมส กบสารละลาย hydrogen peroxide โดยมฮโมโกลบน

(hemoglobin) ในเมดเลอดแดงเปนตวเรงปฏกรยาให phenolphthalein (reduced form) ใสไมมส เปลยนเปน phenolphthalein (oxidized form) สชมพ และเพอใหการแปลผลการทดสอบนาเชอถอ ตองอานผลการทดสอบตามเวลาทกาหนด เนองจากสาร phenolphthalein จะคอยๆถก oxidized เปนสชมพโดยออกซเจนในอากาศ

รปท 2.19 The Kastle-Meyer test reaction test (phenolphthalein) [26]

30

5.2.1 การใชนายา Kastle-Meyer ในทางนตวทยาศาสตร

ในทางนตวทยาศาสตร สารหรอสารละลายทใชในการตรวจคราบเลอดเบองตน

(Presumptive test)ไดแก Benzidine, O-tolidine, Tetramethylbenzidine (TMB), Leucomalachite Green

(LMG), Luminol และ Kastle-Meyer reagent เมอตองการตรวจยนยนการพบคราบเลอดจะทาการทดสอบ

Crystal test ดวย Teichmann test และ Takayama test ดงทไดกลาวมาแลว

การศกษาเปรยบเทยบความไวและความจาเพาะของ Presumptive test นนใหผลการศกษาทแตกตางกนไป ในการศกษาของ Johnston และคณะ พบวาชดทดสอบ Hexagon OBTI kit มความไวในการทดสอบเทากบ LMG และ Kastle-Meyer test [10] และจากการศกษาของ Cox นนพบวา Kastle-Meyer test

มความจาเพาะตอการตรวจคราบเลอดมากกวา O-tolidine และ TMB [4] นอกจากน ยงพบวาการศกษา DNA ในตวอยางวตถพยาน พบวา DNA ไมถกทาลาย และสามารถตรวจพบและเพมจานวนในตวอยางทไดผานตรวจดวย Kastle-Meyer test แลวอกดวย

6. ผลงานวจยและวรรณกรรมทเกยวของ

Alex Mattoli และ Reena Roy พบวามขอจากดของชดทดสอบ Haxagon OBTI ทนอกจากจะใหผลบวกกบ Hemoglobin ของมนษยแลวยงใหผลบวกกบ Hemoglobin ของสตวชนดอนดวย ไดแก Primate

(สตวเลยงลกดวยนมชนดหนง) Ferret (สตวเลยงลกดวยนมตระกลเดยวกนกบชะมด) [8]

Milton Cox ไดศกษาเปรยบเทยบความไวและความจาเพาะของ phenolphthalein, tetramethyl

benzidine, leucomalachite green และ orthotolidine ในการทดสอบคราบเลอดเบองตน (presumptive) พบวาการทดสอบ Phenolphthalein เปนการทดสอบเดยวทดสาหรบใชในการสอบสวน และมความไว 1: 10,000 เทา จากการทดสอบคราบโลหตบนกระดาษกรองและผาฝาย และยงใหผลบวกปลอมกบพชททาปฏกรยา peroxidase การทดสอบ phenolphthalein และ leucomalachite green นนมความจาเพาะมากวา สวนการทดสอบ tetramethyl benzidine และ orthotolidine มความไวมากทสดในกลมนและยงเกดปฏกรยารบกวนจากพชทม peroxidase และยงสงเกตพบอกวาผาฝายมการเกบรกษาคราบเลอดไดดกวาผาอนๆ จากการทดสอบ ความแนนของเสนใยผาฝายทดดซบเลอดทานนเปนคาอธบายทเปนไปไดททาใหมความไวมากขนจากการทดสอบคราบโลหตบนผาฝาย มากกวากระดาษกรอง ซงความไวทมความแตกตางกนของการทดสอบเบองตนเกดจากความแตกตางกนในระดบความเขมของนายา ในวธการเตรยมตวอยางการอานผลและประเภทของวสดทมคราบโลหต[4]

31

Milton Cox ศกษาผลการซกผาทมตอการตรวจคราบโลหตเบองตน ของนายา O-tolidine และ phenolphthalein เพอดการรกษาคราบเลอดบนเนอผาทตางกนจานวนสบสองชนด หลงจากการซกทแหงตาง ๆกนพบวาการรกษาคราบเลอดบนผาถกซกนน ขนอยกบองคประกอบเสนใยของผาทใช ความจาเพาะของการทดสอบเลอดเบองตน การซกโดยใชและไมใชผงซกฟอกการ ผลการศกษาพบวาการทดสอบเบองตนดวย O-tolidine พบวามความไวมากกวากวา phenolphthalein [27]

Ana Castelló ศกษาการตรวจคราบโลหตเบองตนโดยวธการทดสอบ human glycophorin A พบวา เหมาะสาหรบใชเปนตวบงช ทมประสทธภาพสาหรบการตรวจเลอดมนษย เนองจาก human glycophorin A มความคงทนตอการถกทาลายจากผงซกฟอกทมสาร active oxygen[9]

Ana Castelló และคณะ ศกษาผลของการซกผาทมตอการตรวจคราบโลหตเบองตนโดยทดสอบการรกษาคราบเลอดบนเนอผาทตางกน 4 ชนด เกบไวเปนเวลา 1, 5, 10, 20, 30 และ 40 วนกอนนาไปซก พบวา Phenolpthalin, Luminol และ Human hemoglobin ใหผลการทดสอบเปนลบกบตวอยางดงกลาว[28]

Hochmeister และคณะ ศกษาการตรวจโลหตมนษยในทางน ตวทยาศาสตรดวย Imuno

chromatographic 1-strep occult blood พบวาการทดสอบ Immunochromatographic 1-strep occult blood มความจาเพาะตอ ฮโมโกลบนของมนษย และมความไวมากกวาวธกอนหนาในการตรวจหาฮโมโกลบนของมนษยจากรอยคราบโลหต [22]

Dalia Hermon และคณะ นาชดทดสอบ Hexagon OBTI ซงเปนชดทดสอบสาเรจรปใชในการตรวจเลอดในอจจาระ มาประยกตใชตรวจเลอดมนษยในสถานทเกดเหต ทาการศกษากบตวอยางเลอดของอาสาสมครทเจอจางนาโดยนากลน เลอดสตว เลอดผปวยโลหตจาง เลอดเดกทารก และสารคดหลงจากรางกาย การศกษานไดเสรมความไวของชดทดสอบโดยลด Buffer ลงเหลอ 0.2 ml และบางการทดลองแชตวอยางไวใน Buffer มากกวา 2 ชวโมง พบวา Hexagon OBTI มความจาเพาะกบเลอดมนษยมากกวา นายาตรวจคราบโลหตเบองตน Kasle-Meyer test [29]

32

Johnson และคณะ ศกษาเปรยบเทยบความไวของชดทดสอบคราบโลหตโดยวธการตรวจเบองตนของชดทดสอบ พบวาชดทดสอบ Hexagon OBTI kit มความไวในการทดสอบเทากบ LMG และ Kastle-

Meyer test [10]

Amanda Misencik และคณะ ศกษาชดทดสอบ HemDirect ซงอาศยหลกการ chromatographic

immunoassay นามาทดสอบกบคราบโลหตมนษยทเกบไวในเวลาตางๆ เลอดสตว และคราบโลหตมนษยทสภาวะแวดลอมตางๆ พบวาชดทดสอบ HemDirect มความจาเพาะตอฮโมโกลบนของมนษย การทดสอบเลอดสตวใหผลบวกในสายพนธลงและ Ferret เมอทดสอบของเหลวในรางกายอน ๆ ซงมโลหตปรมาณนอยใหผลเปนบวก นาลายและนาอสจใหผลการทดสอบฮโมโกลบนเปนบวก ตวอยางเหงอใหผลการทดสอบเปนลบ การทดสอบคราบเลอดทมอายตงแต 16, 21, และ 31 ป ใหผลการทดสอบเปนบวก และยงพบวาระยะเวลาการในการสกดตวอยางคราบโลหต 24 ชวโมงในบฟเฟอรนนทาใหไดตวอยางเพยงพอสาหรบการทดสอบ[30]

Connie J และคณะ ศกษาชดทดสอบ ABAcard HemaTrace เปนการทดสอบโดยใชหลกการ

Immunochromatographic สาหรบการตรวจเลอดมนษยโดยตรวจหาฮโมโกลบนของมนษย ( human

hemoglobin) พบวา ABAcard HemaTrace มความไวสง ทดสอบงายสะดวกและรวดเรว [31]

Shanan S และ Tobe ไดเปรยบเทยบความไวความจาเพาะและผลของนายาในการนามาตรวจวเคราะห DNA ของนายาทดสอบคราบเลอดเบองตนจานวน 6 ชนด คอ Luminol, LMG, Kastle-Meyer test,

Hemastrix Hemident และ Bluestar พบวานายาตรวจโลหตเบองตน Kastle-Meyer test ใหผลบวกกบ อสจ,

มะเขอเทศ, ซอสมะเขอเทศ, มนฝรง, ถวแดง, นายาฟอกขาว และ Horseradish (พชชนดหนง)[6]

ไชยวฒน ไชยสมบรณ ศกษาเปรยบเทยบการตรวจเลอดในปสสาวะ โดยทดสอบดวยแถบทดสอบปสสาวะเทยบกบนายา Kastle-Meyer test พบวา Kastle-Meyer test มความไวในการตรวจมากกวาแถบทดสอบ รวมทงสารละลายยงสามารถตรวจระดบ hemoglobin แมในปสสาวะจะมความเขมขนเพยง

0.007 มลลกรม/เดซลตรเทานน นอกจากนเมอเปรยบเทยบการตรวจอจจาระทพบเมดเลอดแดงดวยกลองจลทรรศน พบวา Kastle-Meyer test ใหผลบวกตรงกบการตรวจดวยกลองจลทรรศน 84.38% ในขณะทชดทดสอบ Guiac ใหผลบวก 75% [32]

33

แสงชย นทวรนารถ ศกษาเปรยบเทยบชดทดสอบ Guiac และ นายา Kastle Meyer test ในการตรวจ Fecal Occult Blood (เลอดทออกมากบอจจาระทไมสามารถเหนดวยตาเปลา)การตรวจ FOB มประโยชนทงการแพทยและทางนตวทยาศาสตรผลการศกษาพบวาอจจาระทตรวจพบเมดเลอดแดงดวยกลองจลทรรศนจานวน 32 รายใหผลบวกกบนายา Kastle-Meyer 27 ราย (84.38% ) และใหผลบวกกบชดทดสอบ Guiac 24 ราย (75%) การศกษานชใหเหนวา นายา Kastle-Meyer มความไวสงกวาการทดสอบดวยชดทดสอบ Guiac [33]

อญชล เขมโชคนท ศกษาเปรยบเทยบการทดสอบ Fecal Occult blood โดยวธ Hema-Screen กบวธ 1-Step Fecal Occult Blood Test Strip โดยพบวาลดความผดพลาดจาก Human error 5 % จากการอานสจากปฏกรยาทเกดขน และ การตรวจ Occult blood โดยใช 1-Step Fecal Occult Blood Test Strip เพมความไวและความจาเพาะตอ Human hemoglobin ได 92 % [34]

34

บทท 3 วธดาเนนการวจย

งานวจยนมวตถประสงค เพอศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายาทใชในการทดสอบโลหตมนษยเบองตน โดยเปรยบเทยบนายา Kastle-Meyer test หรอ phenolphthalein ซงเปนนายาทใชในการทดสอบคราบโลหตเบองตนในปจจบน และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood เปนชดทดสอบทใชทางการแพทยเพอตรวจหาเลอดในอจาระ การศกษานทาการทดลองกบตวอยางของเลอดสตวจานวน 6 ชนด คอ ไก, หม, วว, แมว, สนข, นก, ตวอยางคราบโลหตมนษยบนพนผวตางๆในสภาวะแวดลอมตางกน และตวอยางโลหตมนษยททาการเจอจางดวยนากลน มความเขมขนทงหมด 17 ระดบ ดงน 1: 100, 1: 10,000, 1: 50,000, 1: 60,000, 1: 70,000, 1: 80,000, 1: 90,000, 1: 100,000, 1: 200,000,

1: 300,000, 1: 400,000, 1: 500,000, 1: 600,000, 1: 700,00, 1: 800,000, 1: 900,000 และ 1: 1,000,000

รปแบบการทดลอง การศกษานมการทดลองทงหมด 3 การทดลองดงน การทดลองท 1 เพอเปรยบเทยบความจาเพาะของนายาทงสองชนดโดยการทดสอบกบเลอดสตวจานวน 6 ชนด

การทดลองท 2 เพอเปรยบเทยบความไวของนายาทงสองชนดโดยการเจอจางโลหตมนษย 17 ระดบ จากอาสาสมครจานวน 20 คน การทดลองท 3 ทดสอบนายาทงสองชนดกบตวอยางคราบโลหตมนษยบนพนผวและสภาวะแวดลอมทแตกตางกน

วสดและวธการดาเนนทดลอง 1. อปกรณทใชในการทดลอง

1.1 ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood (ABON)

1.2 Measuring Pipette ขนาด 10 ml, 5 ml, 1 ml

1.3 Auto Pipette ขนาด 20 L

35

1.4 Pipette Tip ขนาด 1-200 L, 1-1,000 L

1.5 Dropper

1.6 Test tube ขนาด 45 ml

1.7 ตะแกรงวาง test tube

1.8 นากลน

1.9 สตกเกอร

1.10 ปากกาเขยน tube

1.11 นาฬกาจบเวลา 1.12 กรรไกร

1.13 ผากอซ

1.14 ถงมอ

1.15 เลอดครบสวนจากอาสาสมคร

1.16 เลอดสตวทง 6 ชนด 1.17 ไมพนสาลปราศจากเชอ 1.18 ผลตภณฑซกผาสาหรบซกเครอง [โอโม]

1.19 ผาฝายสขาว 1.20 กลองถายภาพ

2. สารเคมทใชในการทดลอง

2.1 phenolphthalein 2.0g

2.2 potassium hydroxide 20 g

2.3 zinc dust 30 g

2.4 ethanol

2.5 6% hydrogen peroxide

3. การเตรยมนายาและชดทดสอบ 3.1 การเตรยมนายา Kastle-Meyer test (Phenolphthalein) stock solution

3.1.1 เตรยมสาร phenolphthalein 2.0g, potassium hydroxide 20 g, ผงสงกะส 20 g

และ10 g, นากลน 100 mL

36

3.1.2 เตรยมโดยนาสาร phenolphthalein 2.0g และ potassium hydroxide 20 g ใสนากลน 100 mL จะไดสารละลายสชมพ เตมผงสงกะส (zinc dust) 20 g ไปตมโดยใช reflux condenser ตมประมาณ 2-3 ชวโมง จนกระทงสารละลายไมมส เตมผงสงกะสอกเลกนอย เพอใหอยในรป reduced form

เมอเตรยมเสรจแลวใหเกบในขวดสชาเกบไวในตเยน [7, 35]

3.2 เตรยม working phenolphthalein solution เตรยม Working phenolphthalein solution โดยการ ผสม stock solution (ขอ3.1) จานวน

20 mL กบ ethanol จานวน 80 mL ทกครงทเตรยม working phenolphthalein solution ใหมจะตองมการทดสอบควบคมผลบวกและผลลบ กอนทาการทดสอบกบตวอยาง

3.3 เตรยม 3% hydrogen peroxide เตรยม 3% hydrogen peroxide ปรมาตร 2 ml จาก 6 % hydrogen peroxide

สตร C1V1= C2V2

C1 = ความเขมขนเรมตน

C2 = ความเขมขนทตองการ

V1 = ปรมาตรเรมตน

V2 = ปรมาตรทตองการ

โดยใช 6 % hydrogen peroxide จานวน 1 ml ผสมกบ นากลน จานวน 1 ml จะได 3% hydrogen

peroxide ปรมาตร 2 ml.

3.4 ชดทดสอบ FOB 1-step Fecal Occult Blood เปนชดทดสอบสาเรจรปทใชในหองปฏบตการทางการแพทยในการทดสอบหาเลอดในอจจาระ โดยใชหลกการทางภมคมกนวทยา (Chromatographic immunoassay)

ในชดทดสอบ ประกอบดวย

1. Extraction buffer

2. แถบทดสอบ

3. สารกนชน

4. วธการทดสอบ 4.1 ขนตอนการทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer test (Phenolphthalein)

37

หยดนายา Kastle-Meyer test (Phenolphthalein) ลงบนตวอยางทเตรยมไวจานวน 2

หยด จากนน หยด 3% hydrogen peroxide จานวน 2 หยด จบเวลาพรอมสงเกตการเปลยนส อานผลและรายงานตามเวลาทกาหนด

4.1.1 การอานผลการทดสอบ

ผลบวก (Positive) จะมการเปลยนสเปนสชมพทนท (1-5 วนาท) อานผลการทดลองภายใน 1 นาท ผลลบ ( Negative) ไมมการเปลยนส ภายในเวลา 1 นาท หากทงไวนานมากกวา 1

นาทจะทาใหเกดเปนผลบวกปลอม

การควบคมผลบวก ( Control positive) โดยใชโลหตมนษยเปนตวควบคม และมการควบคมผลลบ (Control negative) โดยใชนากลนเปนตวควบคม

รปท 3.1 การเปลยนสของทดสอบ Kastle-Meyer test (Phenolphthalein)

38

4.2 ขนตอนการทดสอบชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood test ใสตวอยางทเตรยมไวลงใน Extraction buffer เขยาใหผสมกนประมาณ 5-10 ครง หยดตวอยางทถกเตรยมใน extraction buffer ซงอยในรปชองสารละลาย ลงบนชดทดสอบ จานวน 2 หยด (90

L) อานผลการทดสอบหลงจากหยดตวอยาง 5 นาท รายงานผลภายใน 10 นาท

รปท 3.2 แสดงวธการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB One Step Fecal Occult Blood [22]

4.2.1 การอานผลการทดสอบ [22, 23, 32]

4.2.3.1 ผลบวก (positive) จะปรากฏแถบสสองตาแหนงคอบรเวณตาแหนง

control line และ test line

4.2.3.2 ผลลบ (negative) จะปรากฏแถบสทตาแหนง control line เพยงตาแหนงเดยวซงสามารถมองเหนการเปลยนแปลงดวยตาเปลาได 4.2.3.3 การทดสอบจะสามารถอานผลไดกตอเมอ มแถบชมพอมมวง ปรากฏทบรเวณของแถบควบคม (control line) หากไมปรากฏแถบควบคมไมสามารถอานผลการทดสอบได (Invalid)

การเกบรกษาชดทดสอบ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood เกบรกษาทอณหภมหองไดนานตามอายของชดทดสอบ

39

การเตรยมตวอยางในการทดลอง เตรยมตวอยางเพอใชในการทดลองท 1 ดงน

1. เตรยมเลอดสตวทง 6 ชนดและคราบโลหตมนษย 1.1 ทาการเกบเจาะเลอดแมว เลอดสนข เลอดไก เลอดนก เลอดวว และเลอดหม เกบจากโรงฆาสตว (ไมใสสารใดๆ) 1.2 เลอดสตวทง 6 ชนดนามาดสดภายใตกลองจลทรรศนและยอมส Wright stain เพอศกษาความแตกตางทางกายภาพของเลอดสตวแตละชนดและเลอดมนษย

1.3 เตรยมผากอสปราศจากเชอ [9, 29] แบงเปน 6 กลมสาหรบหยดเลอดสตว 6 ชนด 1.4 หยดเลอดสตวทง 6 ชนด ทเตรยมไวลงบนผากอสทปราศจากเชอวางทงไวใหแหงเปนเวลามากกวา 24 ชวโมงทอณหภมหอง [28]

1.5 หยดโลหตมนษยทเตรยมไวลงบนผากอสทปราศจากเชอ วางทงไวใหแหงเปนเวลามากกวา 24 ชวโมงทอณหภมหองเพอใชควบคมผลบวก

1.6 ใชกรรไกรสะอาดตดผากอสทง 6 กลมใหมขนาด 1x1 เซนตเมตรเพอใชในการทดลอง

เตรยมตวอยางเพอใชในการทดลองท 2 ดงน

1. คดเลอกจากอาสาสมครทมปรมาตรเมดเลอดแดงอดแนน (hematocrit) และความเขมขนของ Hemoglobin มคาปกต [32] โดยวดคา ความเขมขนของเลอด (hematocrit) และความเขมขนของ Hemoglobin ดวยเครองตรวจนบเมดเลอดอตโนมต (Automatic cell counter) ยหอ Nihon Kohden รน

Celltac E MEK-7222

40

ตารางท 3.1 แสดงปรมาตรเมดเลอดแดงอดแนน (Hematocrit) และความเขมขนของ Hemoglobin ของอาสาสมครจานวนทงหมด 20 ตวอยาง

คาทตรวจวด Sample

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hematocrit

39.7 40.5 44.3 39.1 45.7 37.6 39.3 49.2 37.8 50.3 (Normal range 36.0-56.0 %)

Hemoglobin 12.9 13.3 14.9 13.1 14.8 12.3 13 15.5 12.1 16.3

(normal range 12.0-18.0 g/dl)

คาทตรวจวด Sample 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Hematocrit 39.4 43.7 39.4 52.2 40.5 38.2 45.4 46 37.1 51.4

(Normal range 36.0-56.0 %)

Hemoglobin 13.5 14.5 13.1 17.7 13.3 12.5 15.1 15.6 12.2 17.1

(normal range 12.0-18.0 g/dl)

2. เจาะเกบตวอยางโลหตจากอาสาสมครจานวน 20 ราย (ไมใสสารไดๆ) [9, 29]

3. เตรยมเขยนหลอดทดลองเพอใชในการเจอจางตวอยาง ระบหมายเลข 1-17 จานวน 20 ชด

4. เจอจางตวอยางโลหตจากอาสาสมครดวยนากลน [31] โดยวธการคานวณการเจอจาง ดงรปท

3.6 จากสตร Dilution = ปรมาตรของโลหต / ปรมาตรสดทายของ solution

5. เตรยมผากอสทปราศจากเชอ ใชกรรไกรสะอาดตดแบงใหมขนาด 1x1 cm [31] แยกเปน 17 กลมตามระดบการเจอจาง 6. ใช automatic pipette ดดโลหตมนษยทถกเจอจางอยในรปของสารละลายโลหตจานวน 90

L หยดลงผากอสทเตรยมไว ทาทกระดบการเจอจาง วางไวใหแหงทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมง

41

รปท 3.3 การเจอจางตวอยางโลหตมนษยดวยนากลน

เตรยมตวอยางเพอใชในการทดลองท 3 ดงน 1. เตรยมคราบโลหตมนษยในสภาวะทแตกตางกน [22, 29]

1.1 เตรยมผาฝายสขาว[31] ตดแบงดวยกรรไกรสะอาดใหมขนาด 5x5 เซนตเมตร [9] แบงออกเปนกลม A, B, C, และ D กลมละ 20 ตวอยาง 1.2 ใชโลหตครบสวนของอาสาสมครทเหลอจากการเตรยมการทดลองท 2 นามาหยดลงบนผาฝายสขาวทเตรยมไวทง 4 กลม วางไวใหแหงทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมง [29] แลวนาไปเตรยมตวอยางดงน 1.2.1 ตวอยางคราบโลหตกลม A นาไปปนซกดวยเครองซกผาอตโนมตโดยใชผลตภณฑซกผาจากทองตลาดโดยใชตามคาแนะนาทระบขางผลตภณฑ (ผา 5 ชนตอผงซกฟอกคอนชอน) แลวผงใหแหงทอณหภมหอง 24 ชวโมง 1.2.2 ตวอยางคราบโลหตกลม B ซกดวยนาเปลาโดยวธการซกมอ [36] แลวลางดวยนาเปลา 1 ครง จากนนนาไปผงใหแหงทอณหภมหอง 24 ชวโมง

1.2.3 ตวอยางคราบโลหต C เกบไวทอณหภมหองโดยไมมอะไรปดทบเปนเวลามากกวา 2 เดอน [22]

42

1.2.4 ตวอยางคราบโลหต D ไวบรเวณทโลงแจงโดยไมมการควบคมสภาวะอากาศเปนเวลามากกวา 2 เดอน 1.3 ตวอยางคราบโลหต E เตรยมบนผากอสสะอาดวางทงไวใหแหงทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน เพอดความแตกตางของผลการทดสอบเมอใชผาตางชนดกน [27]

1.4 เตรยมคราบตวอยางบนพนผวทตางกนภายในหองพกอาศยทงไวโดยไมมการปองกนเปนเวลามากกวา 2 เดอน กาหนดเปนตวอยาง F, G, H, และ I ดงน [30]

1.4.1 ตวอยาง F คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนไมอดผวเรยบ

1.4.3 ตวอยาง G คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนกระเบองเคลอบ 1.4.4 ตวอยาง H คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนยปซมบอรด 1.4.5 ตวอยาง I คราบโลหตมนษยบนฝาเพดาน

1.5 ตวอยาง J คราบโลหตมนษยบนผากอสวางทงไวใหแหงทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมง เพอใชเปนตวควบคมผลบวก

2. คราบโลหตกลม A, B, C, D, E และ J นามาตดใหมขนาด 1x1 เซนตเมตร

3. ตวอยางคราบโลหตกลม F, G, H และ I เกบตวอยางคราบโลหตกลมละ 20 ตวอยางโดยใชไมพนสาลปราศจากเชอ หยดนาเกลอหมาดๆเพอซบคราบตวอยาง

การดาเนนการทดลอง การทดลองท 1 เพอเปรยบเทยบความจาเพาะของนายาทงสองชนดโดยทาการทดสอบกบเลอดสตวทง 6 ชนด

ขนตอนการทดลอง 1. ทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer test (Phenolphthalein)

1.1 ตวอยางคราบเลอดสตวทเตรยมไวทง 6 ชนด และคราบโลหตมนษยทเตรยมไว นามาตดดวยกรรไกรทสะอาด ใหมขนาด 1x1 เซนตเมตร

1.2 วางตวอยางทเตรยมไวบนกระดาษกรอง 1.3 หยด working phenolphthalein solution จานวน 2 หยด

1.4 หยด 3% hydrogen peroxide จานวน 2 หยด

1.5 จบเวลาและสงเกตสทเปลยนแปลงทเกดขนทนท อานผลและรายงานผลการทดสอบภายใน 1 นาท

43

1.6 การอานผลการทดสอบ หากตวอยางมสชมพเกดขนแสดงวาใหผลเปนบวก และหากไมมการเปลยนแปลงของสภายใน 1 นาท ถอเปนผลลบ

1.7 ใชคราบโลหตมนษย ในการควบคมผลบวก

1.8 ควบคมผลลบโดยใชนากลน

1.9 การทดสอบคราบเลอดสตวซาชนดละ 5 ตวอยาง

2. การทดสอบโดยใชชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

2.1 เขยนชอตวอยางลงบนแถบทดสอบ

2.2 คราบเลอดของสตวทง 6 ชนด และคราบโลหตมนษย ทถกตดเตรยมไว สาหรบการทดลองท 1 ใสลงในขวด extraction buffer เขยาเบาๆประมาณ 5-10 ครง

2.3 หยดตวอยาง ลงบนแถบทดสอบจานวน 2 หยด (90 L) อานผลการทดสอบหลงจากหยดตวอยาง 5 นาท รายงานผลการทดสอบภายใน 10 นาท

2.4 ผลบวก (Positive) มแถบสสองแถบทบรเวณทาปฏกรยาและบรเวณควบคม

2.5 ผลลบ (Negative) มแถบสเกดขนแถบเดยวบรเวณควบคม

2.6 หากไมปรากฏแถบควบคมไมสามารถอานผลการทดสอบได (Invalid)

2.7 ใชคราบโลหตมนษย ในการควบคมผลบวก

2.8 ควบคมผลลบโดยใชนากลน

2.9 ทาการทดสอบคราบเลอดสตวซาชนดละ 5 ตวอยาง

การทดลองท 2 เพอศกษาเปรยบเทยบความไวของชดทดสอบ

เนองจากการทดลองนมการเจอจางตวอยางเพอเตรยมคราบโลหตกอนทาการทดลอง จงทาการเตรยมตวอยางและทาการทดลองครงละ 1 คน โดยมจานวนอาสาสมครทงหมด 20 คน กาหนดใหอาสาสมครคนท 1 เปน Sample 1 เรยงตามลาดบ จนถงอาสาสมครคนท 20 เปน Sample 20

ขนตอนการทดลอง

1. ทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer test (Phenolphthalein)

1.1 นาคราบโลหตบนผากอส ทเตรยมไวสาหรบการทดลองท 2 วางบนกระดาษกรองหยด working phenolphthalein solution จานวน 2 หยด

1.2 หยด 3% hydrogen peroxide จานวน 2 หยด

44

1.3 จบเวลาและสงเกตสทเปลยนแปลงทเกดขนทนท อานผลและรายงานผลการทดสอบภายใน 1 นาท

1.4 การอานผลการทดสอบ หากตวอยางมสชมพเกดขน แสดงวาใหผลเปนบวก และหากไมมการเปลยนแปลงของสภายใน 1 นาท ถอเปนผลลบ

1.5 ใชคราบโลหตมนษย ในการควบคมผลบวก

1.6 ควบคมผลลบโดยใชนากลน

1.7 ทาการทดสอบระดบการเจอจางละ 20 ตวอยาง จากอาสาสมคร 20 คน

2. ทาการทดสอบโดยใชชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood การทดลองนมการเปลยนแปลงวธการทดสอบ จากคาแนะนาของผผลตเลกนอย โดยไมใช extraction buffer เพอปองกนไมใหตวอยางถกเจอจางเพมขน จงใชตวอยางโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลน [31] ซงอยในรปของสารละลายโลหต มาทาการทดสอบกบชดทดสอบโดยตรงกาหนดชอตวอยางเปน DI (Distilled water)

2.1 ระบหมายเลข DI 1 - DI 17 และ control negative บนแถบทดสอบ

2.2 ใช Automatic pipette ดดตวอยางสารละลายโลหตมนษยเจอจางแลว หยดลงบนชดทดสอบ จานวน 90 L ทาการทดสอบทกระดบการเจอจางเรยงตามหมายเลขทระบไว อานผลการทดสอบหลงจากหยดตวอยาง 5 นาท รายงานผลการทดสอบภายใน 10 นาท

2.3 ผลบวก (Positive) มแถบสสองแถบทบรเวณทาปฏกรยาและบรเวณควบคม

2.4 ผลลบ (Negative) มแถบสเกดขนแถบเดยวบรเวณควบคม

2.5 หากไมปรากฏแถบควบคมไมสามารถอานผลการทดสอบได (Invalid)

2.6 ควบคมผลลบโดยใชนากลน 2.7 ทาการทดสอบระดบการเจอจางละ 1 ตวอยางตออาสาสมคร 1 คน จะไดการทดสอบรวม 20 ตวอยางตอระดบการเจอจาง จากอาสาสมครทงหมด 20 คน

3. ทดสอบโดยใชชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ทาการทดสอบตามคาแนะนาของบรษทผผลตชดทดสอบ กาหนดชอตวอยางเปน B (Extraction Buffer)

3.1 ระบหมายเลข B 1 – B 17 และ control negative บนแถบทดสอบ 3.2 ใสคราบโลหตมนษยทเจอจางแลว (คราบบนผากอส) ซงเตรยมไวสาหรบการทดลองท 2 ลงในขวด extraction buffer เขยาเบาๆประมาณ 5-10 ครง

3.3 หยดตวอยาง ลงบนแถบทดสอบจานวน 2 หยด (90 L) อานผลการทดสอบหลงจากหยดตวอยาง 5 นาท รายงานผลการทดสอบภายใน 10 นาท

3.4 ผลบวก (Positive) มแถบสสองแถบทบรเวณทาปฏกรยาและบรเวณควบคม

45

3.5 ผลลบ (Negative) มแถบสเกดขนแถบเดยวบรเวณควบคม

3.6 หากไมปรากฏแถบควบคมไมสามารถอานผลการทดสอบได (Invalid)

3.7 ควบคมผลลบโดยใชนากลน 3.8 ทาการทดสอบระดบการเจอจางละ 1 ตวอยางตออาสาสมคร 1 คน จะไดการทอสอบรวม 20 ตวอยางตอระดบการเจอจาง จากอาสาสมครทงหมด 20 คน

การทดลองท 3 เพอเปรยบเทยบความไวและความจาเพาะของนายาทงสองชนด โดยทาการทดสอบกบตวอยาง คราบโลหตมนษยในสภาวะทแตกตางกน จากคราบโลหตมนษยตวอยาง A, B, C, D, E,

F, G, H, I, และ J (ควบคมผลบวก)

ขนตอนการทดลอง 1. ตวอยาง A, B, C, E, J (ควบคมผลบวก) ใชกรรไกรสะอาดตดชนตวอยางคราบบนผาฝายสขาวและผากอส ใหมขนาด 1x1 เซนตเมตร

2. ใชนาเกลอ 0.9% [2] หยดลงบนไมพนสาลปราศจากเชอซบตวอยางคราบโลหต ตวอยาง F,

G, H, และ I ใชกรรไกรสะอาดตดตวอยางเพอใชในการทดสอบกบนายาทงสองชนด

3. ทาการทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer test (Phenolphthalein)

3.1 นาคราบโลหตทเตรยมไวแลววางบนกระดาษกรอง หยด working phenolphthalein

solution จานวน 2 หยด

3.2 หยด 3% hydrogen peroxide จานวน 2 หยด

3.3 สงเกตสทเปลยนแปลงทเกดขนทนท อานผลและรายงานผลการทดสอบภายใน 1 นาท

3.4 การอานผลการทดสอบ หากตวอยางมสชมพเกดขนแสดงวาใหผลเปนบวก และหากไมมการเปลยนแปลงของสภายใน 1 นาท ถอเปนผลลบ

3.5 ใชตวอยาง J ในการควบคมผลบวก

3.6 ใชนากลนเปนตวควบคมผลลบ

3.7 ทาการทดสอบกลมตวอยางละ 20 ตวอยาง

4. ทาการทดสอบโดยใชชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ทาการทดสอบตามคาแนะนาของบรษทผผลตชดทดสอบ เพอดความไวของชดทดสอบในตวอยางทมความเขมขนตาจงมการเปลยนแปลงวธการทดสอบเพมขนจากคาแนะนาของบรษทผผลต โดยเพมระยะเวลาในการสกดตวอยางในขวด extraction buffer แลวทดสอบตามระยะเวลาดงนคอ ทาการทดสอบทนท, สกดไวทอณหภมหองเปน

46

เวลา 5 นาท, 15 นาท, 30 นาท, 60 นาทและ 2 ชวโมง, 3 ชวโมง, 6 ชวโมง, 12 ชวโมง, 24 ชวโมง และอานผลการทดสอบหลกจาก 10 นาท, 20 นาท, 30 นาท, 60 นาท และ 2 ชวโมง[29] 4.1 ระบชอตวอยาง A, B, C, D, E, F, G, H, I, J (ควบคมผลบวก) และ negative บนชดทดสอบ

4.2 ระบเวลาบนขวด Extraction Buffer ดงน ทาการทดสอบทนท, สกดตวอยางไวทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท, 15 นาท, 30 นาท, 60 นาทและ 2 ชวโมง, 3 ชวโมง, 6 ชวโมง, 12 ชวโมง, 24

ชวโมง 4.3 ใสคราบโลหตมนษยซงเตรยมไวลงในขวด extraction buffer เขยาเบาๆประมาณ 5-10 ครง

4.4 หยดตวอยาง ลงบนแถบทดสอบเมอครบเวลาทกาหนด จานวน 2 หยด (90 L) อานผลการทดสอบหลงจากหยดตวอยาง 10 นาท, 20 นาท, 30 นาท, 60 นาท และ 2 ชวโมง

4.5 ผลบวก (Positive) มแถบสสองแถบทบรเวณทาปฏกรยาและบรเวณควบคม

4.6 ผลลบ (Negative) มแถบสเกดขนแถบเดยวบรเวณควบคม

4.7 หากไมปรากฏแถบควบคมไมสามารถอานผลการทดสอบได (Invalid)

4.8 ควบคมผลลบโดยใชนากลน 4.9 ใชตวอยาง J ในการควบคมผลบวก

4.10 ทาการทดสอบกลมตวอยางละ 20 ตวอยาง

สถานททาการทดลอง หองปฏบตการทางการแพทย โรงพยาบาลสว อาเภอสว จงหวดชมพร

47

บทท 4 ผลการวเคราะหขอมล

จากการศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายาสองชนด ระหวางนายา Kastle-Meyer test หรอ Phenolphthalein และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยทาการทดสอบเปรยบเทยบความจาเพาะดวยเลอดสตว จานวน 6 ชนด ไดแก แมว วว ไก สนข หม นก การทดสอบเปรยบเทยบความไว โดยทาการทดสอบโลหตมนษยทมการเจอจางเขมขนตางๆกน 17 ระดบ และทดสอบคราบโลหตมนษยในสภาวะแวดลอมทแตกตางกน ซงแบงเปน 3 การทดลองไดผลการทดลองดงน

ผลการทดลองท 1 ตารางท 4.1 ผลการทดสอบคราบเลอดสตวทง 6 ชนด ดวยนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

ตวอยางท ผลการทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB

แมว วว ไก สนข หม นก KM FOB KM FOB KM FOB KM FOB KM FOB KM FOB

1 + - + - + - + - + - + - 2 + - + - + - + - + - + - 3 + - + - + - + - + - + - 4 + - + - + - + - + - + - 5 + - + - + - + - + - + -

Control positive + + + + + + + + + + + + Control negative - - - - - - - - - - - -

หมายเหต KM = Kastle-Meyer test (Phenolphthalein) FOB = FOB 1-Step Fecal Occult Blood

+ = Positive result - = Negative result

48

ผลการทดลองท 2 ตารางท 4.2 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลน 17 ระดบ ทดสอบดวยนายา Kastle-Meyer test

No ระดบการ เจอจาง

Sample number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 1:100 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 2 1:10,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 3 1:50,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4 1:60,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 5 1:70,000 - - - - - - - - - + - - - + - - - - - + 6 1:80,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 7 1:90,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 8 1:100,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 9 1:200,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 1:300,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 1:400,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 12 1:500,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 1:600,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 1:700,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 15 1:800,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 16 1:900,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 17 1:1,000,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - control positive + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + control negative - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - หมายเหต + = Positive result - = Negative result

49

ตารางท 4.3 ผลการทดสอบโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลนอยในรปของสารละลายโลหต 17 ระดบ ทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยตรง

No ระดบการ เจอจาง

Sample number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 1:100 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 2 1:10,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 3 1:50,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4 1:60,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 5 1:70,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 6 1:80,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 7 1:90,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 8 1:100,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 9 1:200,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 10 1:300,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 11 1:400,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 12 1:500,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 13 1:600,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 14 1:700,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 15 1:800,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 16 1:900,000 - - - - - - - - - + - - - + - - - - - + 17 1:1,000,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - control positive + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + control negative - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - หมายเหต + = Positive result - = Negative result

50

ตารางท 4.4 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยบนผากอส จากโลหตทเจอจางดวยนากลน 17 ระดบ ทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood สกดโดย extraction buffer

No ระดบการ เจอจาง

Sample number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 1:100 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 2 1:10,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 3 1:50,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4 1:60,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 5 1:70,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 6 1:80,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 7 1:90,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 8 1:100,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 9 1:200,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 10 1:300,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 11 1:400,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 12 1:500,000 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 13 1:600,000 - - - - - - - - - + - - - + - - - - - + 14 1:700,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 15 1:800,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 16 1:900,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 17 1:1,000,000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - control positive + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + control negative - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - หมายเหต + = Positive result - = Negative result

51

ผลการทดลองท 3 ตารางท 4.5 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในสภาวะทแตกตางกนดวยนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

Sample 1-Step Fecal Occult Blood test

Incubation Extrac buffer at room temperature KM test Immediately 5 min 15 min 30 min 60 min 2 H 3 H 6 H 12 H 24 H

A - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (20) B - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) +(2) +(2) +(2) +(20) C - (2) - (2) - (2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(20) D - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) +(2) +(2) +(20) E +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(20) F +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(20) G +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(20) H +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(20) I +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(20)

J(positive) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(2) +(20) Nag - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (20)

หมายเหต KM = Kastle-Meyer test (Phenolphthalein) + = Positive result - = Negative result A = คราบโลหตมนษยบนผาฝายซกดวยเครองซกผาอตโนมตโดยใชผลตภณฑซกผา B = คราบโลหตมนษยบนผาฝายซกดวยนาเปลาโดยวธการซกมอ C = คราบโลหตมนษยบนผาฝายทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน D = คราบโลหตมนษยบนผาฝายบรเวณทโลงแจงเปนเวลามากกวา 2 เดอน E = คราบโลหตมนษยบนผากอสวางทงทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน F = คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนไมอดผวเรยบ G = คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนกระเบองเคลอบ H = คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนยปซมบอรด I = คราบโลหตมนษยบนฝาเพดาน J = คราบโลหตมนษยบนผากอสทอณหภมหอง 24 ชวโมง ใชเปนตวควบคมผลบวก

52

จากตารางท 4.5 การทดลองในตวอยาง B, C และ D นนใหผลการทดลองทแตกตางกนเมอสกดตวอยางใน extraction buffer ไวทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท, 15 นาท, 30 นาท, 60 นาท, 2 ชวโมง, 3 ชวโมง, 6 ชวโมง, 12 ชวโมง, 24 ชวโมง และเมอเพมระยะเวลาการอานผลในตวอยางทใหผลลบโดยอานผลทเวลา 10 นาท, 20 นาท, 30 นาท, 60 นาท และ 2 ชวโมง กใหผลการทดลองทตางกน ดงตารางท 4.6, 4.7 และตารางท 4.8

ตวอยาง A ใหผลการทดสอบเปนลบทงหมดเมอสกดตวอยางทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท, 15 นาท, 30 นาท, 60 นาทและ 2 ชวโมง, 3 ชวโมง, 6 ชวโมง, 12 ชวโมง, 24 ชวโมง และเมออานการทดสอบหลงจาก 10 นาท, 20 นาท, 30 นาท, 60 นาท และ 2 ชวโมง กใหผลเปนลบเชนกนจงไมไดนามาใสในตาราง

ตวอยาง E, F, G, H และ I ใหผลเปนบวกทงหมดในการสกดตวอยาง ไวทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท, 15 นาท, 30 นาท, 60 นาทและ 2 ชวโมง, 3 ชวโมง, 6 ชวโมง, 12 ชวโมง, 24 ชวโมง จงไมจาเปนตองอานผลการทดสอบหลงจากการหยดตวอยางในเวลา 15 นาท, 30 นาท, 60 นาทและ 2 ชวโมง, 3 ชวโมง, 6 ชวโมง, 12 ชวโมง และ 24 ชวโมง

ตารางท 4.6 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในตวอยาง B ดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

Incubation in test device at

room temperature

Incubation Extrac buffer at room temperature

Immediately 5 min 15 min 30 min 60 min 2 H 3 H 6 H 12 H 24 H

10 min - - - - - - - + + + 20 min - - - - - - - + + + 30 min - - - - - - + + + + 60 min - - - - + + + + + +

2 H + + + + + + + + + + หมายเหต + = Positive result - = Negative result

53

ตารางท 4.7 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในตวอยาง C ดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

Incubation in test device

at room temperature

Incubation Extrac buffer at room temperature

Immediately 5 min 15 min 30 min 60 min 2 H 3 H 6 H 12 H 24 H

10 min - - - + + + + + + + 20 min - - - + + + + + + + 30 min - - + + + + + + + + 60 min + + + + + + + + + +

2 H + + + + + + + + + +

หมายเหต + = Positive result - = Negative result

54

ตารางท 4.8 ผลการทดสอบคราบโลหตมนษยในตวอยาง D ดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

Incubation in test device at

room temperature

Incubation Extrac buffer at room temperature

Immediately 5 min 15 min 30 min 60 min 2 H 3 H 6 H 12 H 24 H

10 min - - - - - - - - + + 20 min - - - - - - + + + + 30 min - - - - - + + + + + 60 min - - - + + + + + + +

2 H + + + + + + + + + + หมายเหต + = Positive result - = Negative result

55

บทท 5 สรป อภปรายผล และขอเสนอแนะ

ในการศกษาคนควาอสระ เรอง การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายา Kastle-Meyer test

หรอ phenolphthalein และชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood เพอนาไปประยกตใชตรวจคราบโลหตมนษยในงานตรวจสถานทเกดเหต ซงมมวตถประสงคเพอศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพดานความจาเพาะ และดานความไวของชดทดสอบ การศกษาครงนมการทดลอง 3 การทดลองโดยทาการศกษาเปรยบเทยบความจาเพาะโดยทดสอบกบเลอดสตว จานวน 6 ชนด การศกษาเปรยบเทยบความไวโดยทดสอบกบโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลนทความเขมขน 17 ระดบจากอาสาสมครจานวน 20 ราย และการทดสอบคราบโลหตมนษยบนพนผวและสภาวะแวดลอมตางกน และศกษาลกษณะทางกายภาพของเลอดสตวทง 6 ชนด

สรปผลการทดลอง การศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพ ของนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step

Fecal Occult Blood โดยทดสอบดานความจาเพาะดวยคราบเลอดสตวจานวน 6 ชนด และทดสอบดานความไวดวยโลหตมนษยทมความเขมของ Hemoglobin และ Hematocrit ทมคาปกตมาเจอจางดวยนากลน 17 ระดบ และการทดสอบตวอยางคราบโลหตมนษยในสภาวะตางกนสามารถสรปการศกษาไดดงน

1. การทดสอบความจาเพาะของนายาทงสองชนด ดวยตวอยางเลอดสตวจานวน 6 ชนด (ไก, หม, วว, แมว, สนข, นก) พบวาชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ซงใชหลกการทางภมคมกน

(Immunochromatographic) มความจาเพาะตอเลอดมนษยมากกวานายา Kastle-Meyer test 2. การทดสอบความไวดวยตวอยางโลหตมนษยทดวยนากลน 17 ระดบ (1:100 ถง 1:1,000,000) พบวา ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood มความไวมากกวานายา Kastle-Meyer test ( ตามตารางท 5.1 ดานลาง )

56

ตารางท 5.1 ตารางสรปผลการทดสอบตวอยางโลหตมนษยทเจอจางดวยนากลน 17 ระดบ ดวยนายาทง 2 ชนด

ระดบการเจอจาง KM test FOB ( Direct ) FOB ( buffer ) 1:100 + (20) + (20) + (20)

1:10,000 + (20) + (20) + (20)

1:50,000 + (20) + (20) + (20)

1:60,000 + (20) + (20) + (20)

1:70,000 - (17),+ (20) + (20) + (20)

1:80,000 - (20) + (20) + (20)

1:90,000 - (20) + (20) + (20)

1:100,000 - (20) + (20) + (20)

1:200,000 - (20) + (20) + (20)

1:300,000 - (20) + (20) + (20)

1:400,000 - (20) + (20) + (20)

1:500,000 - (20) + (20) + (20)

1:600,000 - (20) + (20) - (17),+ (20)

1:700,000 - (20) + (20) - (20)

1:800,000 - (20) + (20) - (20)

1:900,000 - (20) - (17),+ (20) - (20)

1:1,000,000 - (20) - (20) - (20)

control positive + (20) + (20) + (20)

control negative - (20) - (20) - (20)

หมายเหต + = Positive result

- = Negative result

KM = Kastle-Mayer test (Phenolphthalein)

FOB (Direct) = FOB One Step Fecal Occult Blood (หยดตวอยางลงบนชดทดสอบโดยตรง) FOB (Buffer) = FOB One Step Fecal Occult Blood (ใช extraction buffer)

57

3. ในการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ไดมการปรบเปลยนวธการทดสอบเลกนอยโดยเพมระยะเวลาในการสกดตวอยางและเพมเวลาในการอานผลการทดสอบ [29] ไดผลการทดสอบดงน

ตวอยางคราบโลหต E, F, G, H และ I ใหผลการทดสอบเปนบวกทนทเมอทาการทดสอบทนททสกดตวอยางใน extraction buffer

ตวอยางคราบโลหต A ใหผลการทดสอบเปนลบ แมวาจะสกดตวอยางใน extraction buffer เปนเวลา 24 ชวโมง และ อานผลการทดสอบหลงจาก 2 ชวโมง ตวอยางคราบโลหต B ใหผลการทดสอบเปนบวกทนทเมอสกดตวอยางใน extraction buffer เปนเวลา 6 ชวโมง ตวอยางคราบโลหต C ใหผลการทดสอบเปนบวกทนทเมอสกดตวอยางใน extraction buffer เปนเวลา 30 นาท

ตวอยางคราบโลหต D ใหผลการทดสอบเปนบวกทนทเมอสกดตวอยางใน extraction buffer เปนเวลา 12 ชวโมง 4. ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood และนายา Kastle-Meyer test สามารถตรวจคราบโลหตมนษยทเกบไวระยะเวลามากกกวา 2 เดอนได

5. ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ใหผลเปนบวกออนๆ กบตวอยางทมความเขมขนตาเมอสกดตวอยางมากกวา 1 ชวโมง และอานผลการทดสอบหลงจาก 1 ชวโมง

6. ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood และนายา Kastle-Meyer test ไมสามารถตรวจตวอยางคราบโลหต ทถกซกดวยผลตภณฑซกผาทมสารฟอกขาวได

7. การทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood ในตวอยางคราบบนผาทเสนใยมความหนาแนนมาก เชนผาฝาย ควรสกดตวอยางทงไวเปนเวลา มากกวา 1 ชวโมง

อภปรายผลการทดลอง จากการศกษารปรางลกษณะทางกายภาพของเลอดสตวทงหกชนด พบวาลกษณะรปรางของเมดเลอดแดง เมอดดวยกลองจลทรรศน พบวาเมดเลอดแดงของ วว หม แมว และสนข มรปรางกลมบมตรงกลาง มขนาดประมาณ 6-7 ไมครอนใกลเคยงกบเมดเลอดแดงของมนษย ทแตกตางออกไปคอเมดเลอดแดงของไกและนก มลกษณะรปรางกลมนน คอนขางรมขนาดประมาณ 6 ไมครอน เมอนาเลอดสตวทง 6 ชนดไปยอมดวยส Wright’s stain พบวาลกษณะเมดเลอดแดงของสตวทง 6 ชนดตดสชมพมวง พบเมดเลอดขาวทง 5 ชนด และเกลดเลอดซงคอนขางเหมอนกบเมดเลอดของมนษยตองใชความชานาญในการแยก เวนแตเลอดของไกและนกทมลกษณะตางออกไปคอภายในเมดเลอดแดงจะมนวเครยส จงเหนเปนสมวงอยตรงกลางเมดเลอดแดง [17]

58

การศกษาเปรยบเทยบความจาเพาะของนายา Kastle-Meyer test (phenolphthalein) และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood พบวาการทดสอบ คราบเลอดสตวทง 6 ชนด ใหผลเปนบวกกบ นายาตรวจคราบโลหตเบองตน Kastle-Meyer test (phenolphthalein) สวนชดทดสอบ FOB 1-step Fecal

Occult Blood ซงใชหลกการ Immunochromatographic ใหผลเปนลบกบเลอดของสตวทง 6 ชนด สามารถสรปไดวาชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood มความจาเพาะตอเลอดมนษยมากกวานายาตรวจคราบโลหตเบองตน Kastle-Meyer test (phenolphthalein) [26] การศกษาเปรยบเทยบความไว นายาตรวจคราบโลหตเบองตน Kastle-Meyer test ใหผลบวกกบคราบโลหตมนษยทระดบการเจอจาง 1: 60,000 เทา ซงตางจากการศกษาของ Hochmeister และคณะไดบอกวา นายาตรวจคราบโลหตเบองตน Kastle-Meyer test สามารถใหผลบวกกบโลหตทถกเจอจางไดถง 1:

1,000,000 เทา อธบายไดวาความไวในการทดสอบเบองตนทใหผลการทดสอบแตกตางกนนน เกดจากความแตกตางของระดบความเขมขนของนายา วธการเตรยมตวอยาง การอานผลและประเภทของวสดทมคราบเลอด [4] ตวอยางโลหตมนษยทถกเจอจางดวยนากลน ซงอยในรปของสารละลายโลหตเมอนามาทดสอบกบชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยตรงใหผลเปนบวกทระดบการเจอจาง 1:800,000 ตวอยางท 10 ตวอยางท 14 และตวอยางท 20 ใหผลเปนบวกถง 1:900,000 เทา (ดงตารางท 4.3)

ตวอยางผากอสซงมคราบโลหตมนษยทถกเจอจางดวยนากลน ทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-

Step Fecal Occult Blood โดยทดสอบตามคาแนะนาของบรษทผผลตชดทดสอบ ผลการทดสอบพบวา ใหผลเปนบวกกบคราบโลหตมนษย ทระดบการเจอจางสงถง 1: 500,000 เทา และ 1: 600,000 เทา ในตวอยางท 10 ตวอยางท 14 และตวอยางท 20 (ดงตารางท 4.4) ความแตกตางของผลการทดสอบ (ตารางท 4.3 และตารางท 4.4) ในตวอยางท 10 ตวอยางท 14 และตวอยางท 20 ใหผลเปนบวกเพมขนอก 1 ระดบ อาจเปนไดไดวาปรมาณของความเขมเลอด (hematocrit) และปรมาณของ ฮโมโกลบน ในเมดเลอดแดงสงกวาตวอยางอนๆ (ตารางท 3.1) ทาใหความเขมขนของฮโมโกลบนเขมขนกวาตวอยางอนๆ จงทาใหผลการทดสอบใหผลเปนบวกเพมขนอก 1 ระดบการเจอจาง

ความแตกตางของผลการทดสอบการเจอจางตวอยางโลหตมนษย(ตารางท 4.3) ซงใชตวอยางโลหตทเจอจางดวยนากลนอยในรปสารละลายโลหตหยดลงบนชดทดสอบโดยตรง และการทดสอบคราบโลหตโดยสกดคราบโลหตทเจอจางดวย extraction buffer ซงมอยในชดทดสอบ(ตารางท 4.4 ) ผลการทดสอบทแตกตางกนสามารถอธบายไดวาการใช extraction buffer ปรมาตร 2 ml นน นอกจากเปนการสกดตวอยางแลวยงเปนการลดความเขมขนของตวอยางลง จงทาใหผลการทดสอบททดสอบโดยใช extraction

59

buffer ปรมาตร 2 ml นนใหผลเปนบวกในระดบการเจอจางทนอยกวาการใชโลหตมนษยทถกเจอจางดวยนากลนแลวหยดลงบนชดทดสอบโดยตรง[ 29, 31] การทดสอบคราบโลหตมนษยในสภาวะแตกตางกนพบวาตวอยาง B, C, D, E, F, G, H และ I ใหผลเปนการทดสอบเปนบวก กบนายา Kastle-Meyer test และ ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult

Blood มเพยงตวอยางคราบโลหต A (ซกดวยเครองซกผาอตโนมตดวยผลตภณฑซกผา) ทใหผลการทดสอบเปนลบกบนายาทง 2 ชนด เปนไปไดวาฮโมโกลบนถกทาลายจากการใชผลตภณฑซกผา [9, 28] และจากการปนซกลาง(ตารางท 4.5) ตวอยางคราบโลหต B, C และ D ใหผลเปนบวกกบชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

เมออานผลการทดสอบหลงจาก 10 นาท สามารถอธบายไดวาตวอยางทมความเขมขนตานน การใชเวลาในการสกดตวอยางเพมขนและอานผลการทดสอบหลงจาก 10 นาท เปนการเพมความไวใหกบชดทดสอบ เชนเดยวกบการศกษาของ Hermon และคณะ พบวา Hexagon OBTI Test เปนชดทดสอบทใชหลกการของ Immunochromatographic assay ใหผลเปนบวกออนๆกบสารคดหลงของรางกาย เมออานผลการทดสอบหลงจาก 1 ชวโมง เปนการเพมความเขมขนของตวอยางจากสารคดหลงของรางกายซงอาจมความเขมขนของฮโมโกลบนตา[29]โดยผลการทดสอบตวอยาง B, C และ D เปนดงน ตวอยาง B (คราบโลหตบนผาฝายซกดวยนาเปลา) ใหผลการทดสอบเปนบวก เมอสกดตวอยางใน extraction buffer ทงไวทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 6 ชวโมง และใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆ เมออานผลหลงจากหยดตวอยางลงบนแถบทดสอบเปนเวลามากกวา 2 ชวโมงเมอทาการทดสอบทนทสกดตวอยางและสกดตวอยาง 30 นาท สวนการสกดตวอยางเปนเวลา 2 ชวโมง ใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆ เมออานผลหลงจากการทดสอบ 60 นาท การสกดตวอยางไว 3 ชวโมง ใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆเมออานผลการทดสอบหลงจาก 30 นาท เปนไปไดวาการนาตวอยางไปซกเปนการทาลายใหฮโมโกลบนและเจอจางความเขมขนของฮโมโกลบน แตผาฝายนนมเสนใยแนนและคอนขางเกบรกษาคราบไดด ทาใหการซกดวยนาเปลายงคงมฮโมโกลบนคงเหลออย และเมอสกดตวอยางทงไวเปนเวลามากกวา 6 ชวโมงจงใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆ(ตารางท 4.6) ตวอยาง C (คราบโลหตบนผาฝายทอณหภมหองมากกวา 2 เดอน) ทดสอบโดยใสตวอยางลงใน extraction buffer พบวาการทดสอบทนทเมอสกดตวอยางและสกดตวอยางทงไว 5 นาทนน ใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆเมออานผลการทดสอบหลงจาก 60 นาท การทดสอบหลงจากสกดตวอยางไว 15 นาทนน ใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆเมออานผลการทดสอบหลงจาก 30 นาท และการสกดตวอยางทงไวมากกวา 30 นาท ใหผลการทดสอบเปนบวกเมออานผลในเวลา 10 นาท(ตารางท 4.7) จากการทดสอบตวอยางน พบความแตกตางของผลการทดสอบจากตวอยาง E ซงคราบโลหตบนผากอสเกบไวทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอนทใหผลการทดสอบเปนบวก เมอทาการทดสอบ

60

ทนททสกดตวอยางนนเกดจากชนดของผาในการเกบรกษาคราบตวอยางและการสกดตวอยาง จะเหนวาผาฝายดดซบตวอยางไดดกวาเนองจากผาฝายมความแนนของเสนใยมากกวา [27] ทาใหการสกดตวอยางจากผาฝายนน ทาไดยากกวาเมอเทยบกบผากอส ดงนนการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult

Blood ควรคานงถงชนดของผาและความแนนของเสนใยดวย ตวอยาง D (คราบโลหตบนผาฝายบรเวณทโลงแจง) ใหผลการทดสอบเปนบวก เมอสกดตวอยางทงไวทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 12 ชวโมง การทดสอบทนทสกดตวอยางและสกดตวอยางทงไว 5 ถง 15 นาทนนใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆ เมออานผลการทดสอบหลงจากหยดตวอยางลงบนแถบทดสอบเปนเวลามากกวา 2 ชวโมง การสกดตวอยางเปนเวลา 30 นาท และ 60 นาท ใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆเมออานผลหลงจากการทดสอบ 60 นาท จากผลการทดสอบดงกลาวเปนไปไดวาการนาตวอยางไวบรเวณทโลงแจงโดยมทงฝนและแดด ทาใหมการทาลายตวอยางโดยธรรมชาตจากความชน ทาใหแบคทเรยยอยสลายตวอยางได [2, 12] และเมอมฝนชะลางตวอยางนนเทยบไดกบการเจอจางตวอยาง ทาใหความเขมขนของฮโมโกลบนลดลง จากทไดกลาวถงการเกบรกษาคราบตวอยางบนผาฝาย ทมความแนนของเสนใยมากนนเปนไปไดวา ตวอยางยงคงเหลออยบางสวน จงใหผลการทดสอบเปนบวกออนๆ เมอสกดตวอยางไวนานกวา 12 ชวโมง(ตารางท 4.8)

ขอเสนอแนะ 1. ขอเสนอแนะในการวจย จากการศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพของนายาทงสองชนดพบวา ชดทดสอบ FOB 1-Step

Fecal Occult Blood มความไว มความจาเพาะกบเลอดมนษย การใชงานงายและสะดวก ใชตวอยางในการทดสอบนอย ราคาไมแพง ไมเปนอนตรายตอผปฏบตงาน ไดผลการทดสอบรวดเรว อานผลงายและสามารถเกบผลการทดสอบไวเพอทวนสอบภายหลงได ทาใหเจาหนาทผปฏบตงานตรวจสถานทเกดเหต สามารถเลอกเกบชววตถพยานไดอยางมประสทธภาพ เปนประโยชนในการสบสวนสวบสวน จงเปนอกทางเลอกหนงทจะนาไปประยกตใชในงานตรวจสถานทเกดเหตหรอนาไปใชในหองปฏบตการนตวทยาศาสตร

2. ขอเสนอแนะในการศกษาวจยครงตอไป

2.1 ในการทาการวจยครงตอไปควรทาการศกษาเปรยบเทยบตวอยางคราบโลหตในสภาวะแวดลอมทหลากหลาย เชน คราบโลหตทถกฝงในเวลาตางๆกน รวมทงระยะเวลาการเกบตวอยางนานกวาน

2.2 ในการทาการวจยครงตอไปควรทาการศกษาความไวของชดทดสอบจากตวอยางคราบโลหตของมนษยทมความเขมโลหตผดปกต เพอดผลของชดทดสอบ โดยศกษาจากตวอยางโลหตมนษยทมความเขมโลหตสงกวาปกต จากตวอยางเลอดทารกแรกเกด และศกษาความไวจากตวอยางเลอดมนษยทมความเขมโลหตตากวาปกตในผปวยโรคโลหตจาง

61

2.3 ในการทาการวจยครงตอไปควรเพมจานวนชนดของตวอยางเลอดสตวชนดตางๆ

2.4 ศกษาผลของการใชชดทดสอบเมอนาตวอยางทเหลอไปตรวจวเคราะห DNA

62

รายการอางอง

[1] อรรถพล แชมสวรรณ และคณะ. (2552). นตวทยาศาสตรเพอการสบสวนสอบสวน 1.

พมพครงท 6. กรงเทพฯ: จ.บ.พ เซนเตอร. [2] _________________________. (2552). นตวทยาศาสตรเพอการสบสวนสอบสวน 2.

พมพครงท 6. กรงเทพฯ: จ.บ.พ เซนเตอร. [3] สนต สขวจน. (ม.ป.ป). นตวทยาศาสตร 1. กรงเทพฯ: ม.ป.ท. [4] Cox, M. (1991). "A study of the sensitivity and specificity of four presumptive tests for blood."

Journal of Forensic Sciences 36.5: 1503.

[5] Virkler, Kelly, and Igor K. Lednev. (2009). "Analysis of body fluids for forensic purposes: from

laboratory testing to non-destructive rapid confirmatory identification at a crime scene."

Forensic Science International 188.1: 1-17. [6] Tobe, Shanan S., Nigel Watson, and Niamh Nic Daeid. "Evaluation of Six Presumptive Tests for

Blood, Their Specificity, Sensitivity, and Effect on High Molecular Weight DNA." Journal

of forensic sciences 52.1 (2007): 102-109.

[7] ศรพร พนธศร. (2549). “การตรวจพสจนคราบเลอด”วารสารเทคนคการแพทยเชยงใหม ปท :

39 ฉบบท: 3 หนา: 25 [8] Alex Mattioli and Reena Roy,Ph.D., Ferrets Or Us:How Similar Are We. Pennsylvania State

University,Eberly College of Science, Forensic science Program.

[9] Castelló, Ana, Francesc Francés, and Fernando Verdú. (2011). "An Alternative to the Human

Hemoglobin Test in the Investigation of Bloodstains Treated with Active Oxygen: The

Human Glycophorin A Test. " The Scientific World Journal 11: 907-916.

[10] Johnston, Emma, et al. (2008). "Comparison of presumptive blood test kits including hexagon

OBTI" Journal of forensic sciences 53.3: 687-689.

[11] ตรทพย รตนวรชย. (2555). ชวเคมของเลอดเชงบรณาการ. พมพครงท 1. กรงเทพฯ: จฬาลงกรณ มหาวทยาลย.

[12] วน เชยชมศร. โลหตวทยา เขาถงโดย http://pirun.ku.ac.th/~fsciwcc/HEMATO2.PDF เขาถงเมอ 21 ธนวาคม 2555.

63

[13] Indiana Hemophilia &Thrombosis Center. Hematopoiesis In Human. เขาถงเมอ 15 ธนวาคม 25 5 5 . เ ขา ถ งโดย http://www.ihtc.org/wp-content/uploads/2010/05/Hematopoiesis_

In_Humans.jpg.

[14] University of Miami Department of Chemistry. Blood. เขาถงเมอ 12 พฤศจกายน 2555. เขาถงได จาก http://www.as.miami.edu/chemistry/2086/chap19/newchapter%2019-part1.htm

[15] ศศธร เพชรจนทร, (2546). ธนาคารเลอด. (ม.ป.พ.). กรงเทพฯ: ม.ป.ท. [16] wisegeek. What is a White Blood Cell. เขาถงเมอ 12 มกราคม 2556. เขาถงโดย http://us.

123rf.com/400wm/400/400/apple1/apple10902/apple1090200001/4262889-white-

blood-cells-as-seen-under-microscope.jpg [17] เลยงชย จตรส. วตถพยานทางนตเวชศาสตร.เขาถงเมอ 10 ธนวาคม 2555. เขาถงไดจาก forenmed.md.kku.ac.th/site_data/myort2_74/3/DNA411. doc

[18] Midlands Technical Colleg. Practical Applications of Immunology. เขาถงเมอ 16 มนาคม 2556. เขาถงไดจาก http://classes.midlandstech.com/carterp/Courses/bio225/chap18 /18-03_Precipitin_1.jpg

[19] อรรถพล แชมสวรรณ และคณะ. (2544). นตวทยาศาสตรเพอการสบสวนสอบสวน 3.

กรงเทพฯ: จ.บ.พ เซนเตอร. [20] อาคม ภสฤทธ,นฏนร คาเกษ. Immunochromatographic Assay. เขาถงเมอ 10 พฤศจกายน 2555. เขาถงไดจาก http://tueakom.tripod.com.

[21] Biological laboratory. immunochromatographic assay. เขาถงเมอ 12 พฤศจกายน 2555. เขาถงไดจาก http://bl-inc.jp/images/immuno_ge.gif

[22] Product Literature . One Step Fecal Occult Blood Test Device (Feces) Package Insert .

Abon Biopharm Hangzhou Economic and Texhnological Development China. Number

1155965002. Effective date 2010.

[23] Hochmeister, Manfred N., et al. "Validation studies of an immunochromatographic 1-step test for

the forensic identification of human blood. " Journal of forensic sciences 44.3 1999.

[24] Glaister, John. "The Kastle-Meyer Test for Blood." British Medical Journal 1.3409 (1926):

808-808.

64

[25] Medical Sciences of Cornell University. Investigating CSI Background material. เขาถงเมอ 21 ธนวาคม 2555. เขาถงโดย http://biomedsci.cornell.edu/graduate_ school/shared /gradschool

/ Outreach/Invest_CSI_Background.pdf.

[26] NNNS chemistry blog. CSI in trouble. เขาถงเมอ 12 มนาคม 2556. เขาถงไดจาก

http://chem.vander-lingen.nl/info/item/November_2008/id/141/mid/140. [27] Cox, M. (1990). "Effect of fabric washing on the presumptive identification of bloodstains."

Journal of forensic sciences 35.6: 1335.

[28] Castelló, Ana, et al. (2009). "Active oxygen doctors the evidence. " Naturwissenschaften 96.2:

303-307.

[29] Hermon, Dalia, et al. (2003). "The Use of the Hexagon OBTI Test for Detection of Human Blood

at Crime Scenes and on Items of Evidence Part 1: Validation Studies and

Implementation." Journal of Forensic Identification 53.5: 566-575.

[30] Misencik, Amanda, and Dale L.Laux. (2007). "Validation study of the seratec hemdirect

hemoglobin assay for the forensic identification of human blood. " Midwestern Association

of Forensic Scientists Newsletter 36.2: 18-26.

[31] Swander, Connie J., and J. G. Stiles. (1998). "Evaluation of the ABAcard HemaTrace™ for the

Forensic Identification of Human Blood." Paper submitted to the Michigan Association of

Forensic Science Annual Meeting, Michigan USA.

[32] ไชยวฒน ไชยสมบรณ. (2555). “การทดสอบ Kastle-Meyer และการประยกตใชในทางวทยาศาสตร การแพทย” วารสารนตวทยาศาสตร ปท, 4 ฉบบท 2: 178-184

[33] แสงชย นทวรนารถ. (2552). “การเปรยบเทยบชดทดสอบ Guiac กบนายา Kasle-Meyer” วารสาร นตเวช ป ท 2 ฉบบท 3 (กนยายน-ธนวาคม): 6-10.

[34] อญชล เขมโชคนท. (2552). “การตรวจOccult blood โดยวธ Hema-Screen Occult Blood

Test เทยบ กบวธการตรวจ Occult blood โดยใช One Step Fecal Occult Blood Test Strip” เขาถงเมอ 10 พฤศจกายน 2555. เขาถงไดจาก http://www.msdbangkok. go.th /dowload %20file/Personal/Succeed/Medical Technician/w_ancharee.pdf .

65

[35] Forensic Science Laboratory. Examination of blood and bloodstain. เขาถงเมอ 15 มนาคม 2 5 5 6 . เ ข า ถ ง โ ด ย http://www.jaypeedigital.com /books/9788184489941/Chapter%

20wise%20Pdf/38914/Chapter-07_Forensic%20Science%20Laboratory

%20Practice%20and%20Procedur.pdf. [36] สนตราษฎรวทยาลย. การงานและอาชพ การทาความสะอาดเสอผาเครองแตงกาย . เขาถงเมอ 15 มนาคม 2556. เขาถงไดจาก http://www.str.ac.th/service106/ElearnM4/NG41101/p_3.htm

66

ภาคผนวก

67

ภาคผนวก ก การเตรยมนายาและเตรยมตวอยางในการทดลอง

68

ภาพผนวก ก.1 เตรยมนายา Kastle-Mayer test โดยผสม phenolphthalein 2.0g, potassium hydroxide 20 g, นากลน 100 mL แลวเตมผงสงกะส 20 g

ภาพผนวก ก.2 นาไปตมโดยใช reflux condenser ตมประมาณ 2-3 ชวโมง

69

ภาพผนวก ก.3 หลงจากตม 2-3 ชวโมงไดสารละลายใสไมมสเตมผงสงกะสอกเลกนอยเกบไวในขวดสชา เปน stock solution

ภาพผนวก ก.4 สารทใชในการเตรยม Kastle-Mayer test คอ 6 % hydrogen peroxide, ethanol และ Kastle- Mayer stock solution

70

ภาพผนวก ก.5 ชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood

ภาพผนวก ก.6 ภาพตวอยางคราบเลอดสาหรบการทดลองท 1 ภาพ A คราบเลอดไก, ภาพ B คราบเลอดหม ภาพ C คราบเลอดวว, ภาพ D คราบเลอดแมว, ภาพ E คราบเลอดสนขและภาพ F คราบเลอดนก

71

ภาพผนวก ก.7 ตวอยางคราบเลอดสตวใชกรรไกรสะอาดตดแบงใหมขนาด 1x1 เซนตเมตร

ภาพผนวก ก.8 เครองตรวจนบเมดเลอดอตโนมต ( Automatic cell counter)ยหอ Nihon Kohden รน Celltac E MEK-7222

72

ภาพผนวก ก.9 ภาพการเจาะเกบเลอดจากอาสาสมคร

ภาพผนวก ก.10 การเตรยมตวอยางสาหรบการทดลองท 2 โดยเจอจางเลอดอาสาสมคร 17 ระดบ และ เตรยมเปนคราบเลอดโดยหยดลงบนผากอสสะอาดขนาด 1x1 เซนตเมตร

73

ภาพผนวก ก.11 ขนตอนการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยใสตวอยางลงใน ขวด extraction buffer ผสมแลวหยดลงบนชดทดสอบจานวน 2 หยด

ภาพผนวก ก.12 ขนตอนการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood โดยใชตวอยางทเปน สารละลายโลหต ปรมาตร 90 uL หยดลงบนแถบทดสอบ(ในการทดลองท 2)

74

ภาพผนวก ก.13 ตวอยาง A คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวซกดวยเครองซกผาอตโนมตโดยใชผลตภณฑซกผา(A) กอนซกและหลงซก(B)

ภาพผนวก ก.14 ตวอยาง B คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวซกมอดวยนาเปลากอนซก(A)และหลงซก(B)

75

ภาพผนวก ก.15 ตวอยาง C คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวเกบทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน

ภาพผนวก ก.16 ตวอยาง D คราบโลหตมนษยบนผาฝายสขาวเกบไวทโลงแจงเปนเวลามากกวา 2 เดอน

76

ภาพผนวก ก.17 ตวอยาง E คราบโลหตมนษยบนกอสเกบไวทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน

ภาพผนวก ก.18 ตวอยาง F คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนไมอดผวเรยบเปนเวลามากกวา 2 เดอน (B)

77

ภาพผนวก ก.19 ตวอยาง G คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนกระเบองเคลอบทอณหภมหองเปนเวลา มากกวา 2 เดอน (B)

ภาพผนวก ก.20 ตวอยาง H คราบโลหตมนษยบนผนงหองทเปนยปซมบอรด ทอณหภมหอง มากกวา 2 เดอน (B)

78

ภาพผนวก ก.21 ตวอยาง I คราบโลหตมนษยบนฝาเพดานทอณหภมหองเปนเวลามากกวา 2 เดอน

ภาพผนวก ก.22 ตวอยาง J คราบโลหตมนษยบนผากอสวางทงไวใหแหงทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมง

79

ภาพผนวก ก.23 ภาพ A ตวอยางคราบโลหต E บนผากอส, ภาพ B ตวอยางคราบโลหตกลม A, B, C และ D ใชกรรไกรสะอาดตดแบงขนาด 1x1 เซนตเมตร, ภาพ C ตวอยางคราบโลหตกลม F, G, H, I และ J เกบ โดยใชไมพนสาลสะอาด

80

ภาคผนวก ข ผลการทดสอบการทดลองท 1

81

ภาพผนวก ข.1 ภาพ A แสดงลกษณะเมดเลอดไกเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 40X, ภาพ B แสดงลกษณะเมดเลอดไกเมอยอมดวย Wright’s Stain กาลงขยาย 100X

ภาพผนวก ข.2 ภาพ A แสดงลกษณะเมดเลอดววเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 40X, ภาพ B แสดงลกษณะเมดเลอดววเมอยอมดวย Wright’s Stain กาลงขยาย 100X

82

ภาพผนวก ข.3 ภาพ A แสดงลกษณะเมดเลอดหมเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 40X, ภาพ B แสดงลกษณะเมดเลอดหมเมอยอมดวย Wright’s Stain กาลงขยาย 100X

ภาพผนวก ข.4 ภาพ A แสดงลกษณะเมดเลอดแมวเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 40X, ภาพ B แสดงลกษณะเมดเลอดแมวเมอยอมดวย Wright’s Stain กาลงขยาย 100X

83

ภาพผนวก ข.5 ภาพ A แสดงลกษณะเมดเลอดสนขเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 40X, ภาพ B แสดงลกษณะเมดเลอดสนขเมอยอมดวย Wright’s Stain กาลงขยาย 100X

ภาพผนวก ข.6 ภาพ A แสดงลกษณะเมดเลอดนกเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 40X, ภาพ B แสดงลกษณะเมดเลอดนกเมอยอมดวย Wright’s Stain กาลงขยาย 100X

84

ภาพผนวก ข.7 ภาพ A แสดงลกษณะเมดเลอดมนษยเมอดสดภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 40X, ภาพ B แสดงลกษณะเมดเลอดมนษยเมอยอมดวย Wright’s Stain กาลงขยาย 100X

ภาพผนวก ข.8 ผลการทดลองท1 การทดสอบ Kastle-Meyer Test ตวอยางเลอดไก

85

ภาพผนวก ข.9 ผลการทดลองท1 การทดสอบ Kastle-Meyer Test ตวอยางเลอดหม

ภาพผนวก ข.10 ผลการทดลองท1 การทดสอบ Kastle-Meyer Test ตวอยางเลอดวว

86

ภาพผนวก ข.11 ผลการทดลองท1 การทดสอบ Kastle-Meyer Test ตวอยางเลอดแมว

ภาพผนวก ข.12 ผลการทดลองท1 การทดสอบ Kastle-Meyer Test ตวอยางเลอดสนข

87

ภาพผนวก ข.13 ผลการทดลองท1 การทดสอบ Kastle-Mayer Test ตวอยางเลอดนก

ภาพผนวก ข.14 ผลการทดลองท 1 การทดสอบ FOB 1-Step Fecal Occult Blood เลอดสตว 6 ชนด ภาพ A เลอดไก, B เลอดหม, C เลอดวว, D เลอดแมว, E เลอดสนข, F เลอดนก

88

ภาพผนวก ข.15 การควบคมผลบวก(positive control)และการควบคมผลลบ(negative control)ของนายา KM test

ภาพผนวก ข.16 การควบคมผลบวก(positive control)และการควบคมผลลบ(negative control)ของชด ทดสอบ FOB

89

ภาคผนวก ค ผลการทดสอบการทดลองท 2

90

ภาพผนวก ค.1 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 100 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลายโลหต ทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบ ดวย KM test

ภาพผนวก ค.2 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 10, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

91

ภาพผนวก ค.3 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 50, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.4 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 60, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

92

ภาพผนวก ค.5 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 70, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.6 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 80, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

93

ภาพผนวก ค.7 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 90, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.8 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 100, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

94

ภาพผนวก ค.9 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 200, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.10 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 300, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

95

ภาพผนวก ค.11 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 400, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.12 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 500, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

96

ภาพผนวก ค.13 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 600, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.14 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 700, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

97

ภาพผนวก ค.15 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 800, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.16 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 900, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

98

ภาพผนวก ค.17 ผลการทดลองท 2 ระดบการเจอจาง 1: 1, 000, 000 ภาพ A ทดสอบดวย FOB ใชสารละลาย โลหตทดสอบโดยตรง, ภาพ B ทดสอบดวย FOB สกดตวอยางดวย Extraction Buffer, ภาพ C ทดสอบดวย KM test

ภาพผนวก ค.18 การควบคมผลการทดสอบการทดลองท 2 การควบคมผลลบ(negative control)และผลบวก (positive control)ของชดทดสอบ FOB

99

ภาพผนวก ค.19 การควบคมผลการทดสอบการทดลองท 2 การควบคมผลลบ(negative control)และผลบวก (positive control)ของนายา KM test

100

ภาคผนวก ง ผลการทดสอบการทดลองท 3

101

ภาพผนวก ง.1 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบตวอยาง A ภาพ A แสดงผลการทดสอบดวยชดทดสอบ FOB ภาพ B แสดงผลการทดสอบดวยนายา KM test

ภาพผนวก ง.2 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง B ภาพ A แสดงผลการทดสอบเมอสกดตวอยางไวมากกวา 6 ชวโมง ภาพ B ทดสอบทนทหลงจากสกดตวอยางและอานผลหลงจาก 1 ชวโมง ภาพ C ทดสอบทนทหลงจากสกดตวอยางและอานผลใน 10 นาท ภาพ D แสดงผลการทดสอบดวยนายา KM test

102

ภาพผนวก ง.3 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง C ภาพ A ทดสอบเมอทาการทดสอบและอานผลใน 10 นาท ภาพ B ทดสอบเมอทดสอบทนทหลงจากสกดตวอยางและอานผลหลงจาก 60 นาท ภาพ C ทดสอบเมอสกดตวอยางไวมากกวา 30 นาท ภาพ D ทดสอบดวยนายา KM test

ภาพผนวก ง.4 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง D ภาพ ทดสอบเมอทาการทดสอบและอานผลใน 10 นาท ภาพ B และ C ทดสอบทนทหลงจากสกดตวอยางและอานผลหลงจาก 2 ชวโมง ภาพ C ทดสอบหลงจากสกดตวอยาง 30 นาท และอานผลหลงจาก 60 นาท ภาพ D ทดสอบเมอสกดตวอยางไวมากกวา 12 ชวโมงทดสอบดวยนายา KM test

103

ภาพผนวก ง.5 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง E ภาพ A ทดสอบทนทและอานผลใน 10 นาท ภาพ B ทดสอบดวยนายา KM test

ภาพผนวก ง.6 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง F ภาพ A ทดสอบเมอทาการทดสอบทนทและอานผลใน 10 นาท ภาพ B ทดสอบดวยนายา KM test

104

ภาพผนวก ง.7 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง G ภาพ A ทดสอบเมอทาการทดสอบทนทและอานผลใน 10 นาท ภาพ B ทดสอบดวยนายา KM test

ภาพผนวก ง.8 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง H ภาพ A ทดสอบทนทและอานผลใน 10 นาท และผลควบคมทเปนลบ (Neg) ภาพ B ทดสอบดวยนายา KM test

105

ภาพผนวก ง.9 ผลการทดลองท 3 ผลการทดสอบของตวอยาง I ภาพ A ทดสอบทนทและอานผลใน 10 นาท, ควบคมผลลบ (Neg) และควบคมผลบวก (J) ภาพ B ทดสอบดวยนายา KM test

106

ประวตผวจย

ชอ – สกล ทอย ททางาน E mail ประวตการศกษา พ.ศ. 2542 พ.ศ. 2551 พ.ศ. 2554 ประวตการทางาน พ.ศ. 2542 – 2550 พ.ศ. 2551 – ปจจบน

นางสาวศศญดา ศรนวม 93/3 หม 14 ตาบลนาสก อาเภอสว จงหวดชมพร กลมงานเทคนคการแพทย โรงพยาบาลสว จงหวดชมพร s.srinoum@hotmail.com, sasiyada.ss@gmail.com สาเรจการศกษาประกาศนยบตรเจาพนกงานวทยาศาสตรการแพทย พยาธวทยาคลนก วทยาลยเทคโนโลยทางการแพทยและสาธารณสขกาญจนาภเษก สาเรจการศกษาวทยาศาสตรบณฑตสาขาเวชศาสตรการธนาคารเลอด คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล มหาวทยาลยมหดล ศกษาตอระดบปรญญามหาบณฑต คณะวทยาศาสตร ภาควชานตวทยาศาสตร บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร เจาพนกงานวทยาศาสตรการแพทย กลมงานเทคนคบรการ โรงพยาบาลสว นกวทยาศาสตรการแพทย(เวชศาสตรการธนาคารเลอด) ชานาญการ กลมงานเทคนคบรการ โรงพยาบาลสว