Post on 10-Oct-2020
19-10-2016
1
Het belang van moleculairediagnostiek
bij hematologische aandoeningen
Apr. Biol. Barbara Denys
GAB 18 oktober 2016
2
Overzicht
Organisatie UZ Gent: labo Moleculaire Diagnostiek Hematologie (Klinische Biologie) – Centrum Medische Genetica Gent (CMGG)Pre-analytische fase - aanvraagformulierenMoleculaire diagnostiek bij acute leukemieënMoleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieveaandoeningenMoleculaire diagnostiek bij lymfomenTechnieken komen beperkt aan bodRIZIV terugbetaling / aanrekening
3
� Morfologie/histologie (beenmerg/perifeer bloed/biopsie)
! Microscopie = basis van de hematologischediagnostiekvoordeel: snel – geen geavanceerde technieknadeel: beperkte gevoeligheid – geenbijkomstige info
Rol van het labo binnen de hemato-oncologie
4
� Verfijning van diagnostiekfenotypering: flowcytometrie met monoklonale
antilichamen
→ niveau van eiwit (functie van cel)genotypering: karyotypering - FISH –
PCR/microarrays – sequencing→ niveau van genoom/DNA/RNA
Detectie en/of analyse van nucleïnezuren in klinische stalen
Rol van het labo binnen de hemato-oncologie
5
Organisatie binnen UZ Gent
Centrum Medische Genetica Gent
(CMGG)Erferlijk overdraagbaarTechnieken: karyotypering, FISH en arraysAnalysen binnen hemato-oncologie (verworven):
karyotypering, FISH bij diagnose AL en MDSKaryotypering, FISH en array CGH bij multiple myeloom en CLLKaryotypering en BCR-ABL FISH bij CMLKaryotypering en FISH bij diverse lymfomen
Labo Moleculaire Diagnostiek
(labo Klinische Biologie)VerworvenTechnieken: PCR, RT-qPCR, sequencingAnalysen:
Opsporen en kwantificeren van fusiegenen en oncogen overexpressie (CML, lymfomen en leukemie)Opsporen van klonaliteit(lymfomen)Opsporen van mutaties oa AML/MDS/CMML – MPN -lymfomen
6
Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie)
18 Centra voor Moleculaire Diagnostiek (CMDs) voor moleculaire diagnostiek (KB ’98) afgeschaft door ar rest Raad van State in 20052005 – 2007: ex-CMD’s niet meer betaald door RIZIV, o p kosten van ziekenhuisArt 33bis in voege vanaf 01/08/2007:
“De verstrekkingen moeten uitgevoerd zijn in een laboratorium dat, een ISO 15189 accreditatie, of een accreditatie volgens een gelijkwaardige laboratoriumnorm bezit voor de uitgevoerde verstrekkingen”
April 2009: CMD UZG accreditatie behaald4 MLT’s (~3 FTE) voor de testen binnen hemato-oncol ogie> 25 verschillende testen (waaronder ook NGS panels )~3000 stalen/analysen per jaar (geaccrediteerd binn en art. 33bis)
19-10-2016
2
7
Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie)
Stalen naar labo Klinische Biologie sturenAanvraagformulier ‘Bijzondere stolling en hematologie’ (achterzijde)Eigen doorstuurformulier met duidelijke specificatie van test en klinische inlichtingen (voor sommige analysen vereist)Labgids: www.labgids.gent
AanvraagformulierAfdeling selecteren – overzicht van alle testenHeel veel informatie: stalen –antwoordtijd - terugbetaling –klinisch belang/interpretatie 8
Startmateriaal - celtypeStalen:
beenmerg, bloed, biopten, parafinnecoupesEDTA tubes (GEEN heparine)
PB/BM -> WBC isolatie door lyse RBC (routine, dagelijks)Bewaring op -80 °C in 75 % EtOH (cellen dood)DNA en RNA isolatie mogelijk (vnl toepassingen op RNA)
Bepaalde toepassingen op DNA -> rechtstreekse DNA-isolatie vanuit volbloed
JAK2V617F mutatie
MNC (Lymfoprep) voor AML/ALL Dx stalen (research)Bewaring in vloeibare N2 (+ DMSO = cryoprotectant)
Cellen levensvatbaarDNA, RNA en eiwitisolatie mogelijk
9
CMGGStalen naar Medische Genetica sturenAanvraagformulier Genetisch Onderzoek voor Maligne Cellen (verworven aandoeningen)Labgids: www.cmgg.be
AanvraagformulierInformatie per pathologie
Stalen: bloed, beenmerg, klieren, bioptenNa/Li-heparine buis met steriel medium (RPMI) (door CMGG geleverd) – bewaring bij 4°C –check houdbaarheid
10
Startmateriaal: RNA versus DNA (1)
DNA stabiel in klinische stalenRNA niet stabiel in klinische stalen
Beide kunnen geïsoleerd worden uit lichaamsvloeistoffen; verse en paraffine ingebedde
weefsels
Aanwezigheid degraderende enzymesDNase relatief instabiel/inactiefRNase heel stabiel / renatureert na autoclaveren, zit op vingertoppen
Bij lyse, sterven cel: RNasen actief
11
Startmateriaal - RNA versus DNA
RNAOnstabiel (RNase)
Beperkte variabiliteit bijfusiegenen resulterend uittranslocaties
genexpressie is abnormaal in neoplastische cellen -> meer (mRNA), tot duizenden kopijen/ cel: betere gevoeligheid
Correlatie met aantal tumorcellenmoeilijk te bepalen (patiënt- en staalafhankelijk)
Interne controle: ABL qPCR(variatie in populatie?)
DNAStabiel(er)
Sterke verschillen in breukpunten bijverschillende patiënten
1 kopij/cel: minder gevoelig
Correlatie met aantaltumorcellen gemakkelijkerte bepalen
Interne controle: CRP qPCR(± constant in populatie)
12
Staal voor DNA isolatie (PB, BM en paraffine)
Tussen de 10 5 en 107 cellen
Maximaal 2 dagen op kamertemperatuur
Tot 5 dagen bij 2-8 °C
Paraffinecoupes en “oude” stalen: fragmentatie PCR
Bepaling aanwezigheid inhibitorenBepalen fragmentatie genomischDNA
Lenze et al., 2011
Fragmentatie PCR
19-10-2016
3
13
Stalen voor toepassing op RNA (PB of BM)
Tussen de 10 6 en 108 cellen<2x 106: proberen maar vooral problematisch voor negatieve stalenStandaard RNA isolatie: 15.106 cellenLiever meer beschikbaar zodat herhaling mogelijk is
Aparte ongeopende EDTA (geen heparine)
Transport zo snel mogelijk naar Klinische Biologie: binnen 24u zodat isolatie WBC max 48 na afname kan gebeuren! Bewaring staal in tussentijd in koelkastBij verdeling stalen steriel verwerken! Onder lafkast !
14
Instabiliteit RNA – praktisch voorbeeld
Staal werd geïncubeerd bij kamertemperatuur of bij 4 °C: aantal kopijen controlegen daalt drastisch, zelfs na één dag bij KT => maat voor gevoeligheid specifiek target
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3
Aan
tal k
opije
n co
ntro
lege
n
KT
4° C
15
Stalen voor karyotypering/FISH
Na/Li-heparine tubeStaal bewaring op kamertemperatuurBuis binnen 24h naar CMMG
16
Apart blauw aanvraagformulier voor speciale hematologie
http://www.labgids.gent
17
Apart blauw aanvraagformulier voor speciale hematologie
http://www.labgids.gent
18
Belang diagnose, prognose en follow-up !
Moleculaire diagnostiek bij ACUTE LEUKEMIEËN
19-10-2016
4
19
Klinisch belang moleculaire diagnostiek
• DIAGNOSEclassificatie van patiënten met acute leukemie
• PROGNOSEbehandeling patiënten aanpassen (‘risk-adapted’ therapy)
• FOLLOW-UPopsporen minimale residuele ziekterest (MRD)opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling
20
NIEUWE DIAGNOSE ACUTE LEUKEMIE
Bij voorkeur BM – staal voor
Karyotypering FISHMoleculaire Diagnostiek
Klinische biologie CMGG
EDTA
Na/Li-heparine buis
Flowcytometrie
21
Uitwerking acute leukemieCentrum Medische
Genetica Gent (CMGG)
Karyotypering
FISH - kwalitatieve detectie meest belangrijke fusiegenen
• t(8;21)• t(9;22)• MLL herschikkingen• t(15;17)• inv(16)/t(16;16)• EVI herschikkingen;
inv(3)/t(3;3)• t(12;21)
Array-CGH analyse –kinderen met ALL
Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische
Biologie)
Kwalitatieve PCR : detectie van fusiegenen m.b.v. multiplex PCR
Kwantitatieve qPCR : � kwantificatie
fusiegenexpressie � Opsporen en kwantificatie
WT1 overexpressie
Mutatieanalyse m.b.v. NGS
22
Screening translocaties leukemieHemaVisionTM is een kwalitatieve multiplex RT-PCR test ontwikkeld om 28
verschillende translocaties of chromosomale herschikkingen, inclusief meer dan 145 breekpunten of splice variants, te detecteren
t(1;11)(p32;q23) MLL/AF1p, t(1;11)(q21;q23)MLL/AF1q, t(1;19)(q23;p13)E2A/PBX1, t(3;21)(q26;q22)AML/EAP/MDS/EVI1, t(3;5)(q25.1;q34)NPM/MLF1, t(4;11)(q21;q23)MLL/AF4, t(5;12)(q33;p13) TEL/PDGFRb, t(5;17)(q35;q21)NPM/RARa, t(6:11)(q27;q23) MLL/AF6, t(6;9)(p23;q34)DEK/CAN, t(8;21)(q22;q22)AML1/MGT8, t(9;11)(q22;q23) MLL/AF9, t(9;12)(q34;p13) TEL/ABL, t(9;22)(q34;q11)BCR/ABL, t(9;9)(q34;q34)SET/CAN, t(10;11)(p12;q23)MLL/AF10, t(11;17)(q23;q21)MLL/AF17, t(11;17)(q23;q21) PLZF/RARa, t(11;19)(q23;p13.1) MLL/ELL, t(11;19)(q23;p13.3) MLL/ENL, t(12;21)(p13;q22)TEL/AML1, t(12;22)(p13;q11) TEL/MN1, t(15;17)(q22;q21)PML/ RARa , t(16;21)(q11;q22)TLS/ERG, t(17;19)(q22;p13) E2A/HLF, inv(16)(p13;q22)CBFb/MYH11, t(X;11)(q13;q23)MLL/AFX, TAL1deletion(p34)SIL/TAL1
23
HemaVision
inv16
Screen = 8 multiplex PCR reacties (nested)
Split-out PCR voor exacte identificatie
translocatie / breekpunt
24
Fusiegenen in acute lymfatische leukemie (ALL)
Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004)
19-10-2016
5
25
Prognostisch belang translocaties in ALL
Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004)26
Adult
Pediatric
Genetische diversiteit fusiegenen bij AML
10% PML-RARA
27Grimwade D, Morzek K; Hematol Oncol Clin N Am 2011
Belang fusiegenen bij AML = PROGNOSE
28
Cytogenetica -> risicogroepen
• Karyotype = belangrijkste prognostische waarde bij diagnose• AML: 30% translocaties / 10-15% non-random
chromosomale afwijkingen• Dus 40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML)
Risicogroepen
Favorable t(8;21)(q22;q22) – t(15;17)(q22;q21) – inv(16)(p13.1;q22)
Intermediate t(9;11)(p22;q23)
Adverse Inv(3)(q21;q26.2 of t(3;3)(q21;q26.2) – t(6;9)(p23;q34) –
11q23 – complex karyotype – del(5q) of -5 – abnl(17p)
29
Belang mutaties bij AML
40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML) = intermediair risicogroep
Betere risico stratificatie vereist
Steeds uitbreidende genetische afwijkingen hebben e en significant impact op prognose:
mutaties en overexpressie bepaalde genen
30
Moleculaire landschap in AML
25% / ongunstig
30% of > 50% CN-AML / gunstig
19-10-2016
6
31
4 grote Europese studies op meer dan 1000 CN-AML patiënten identificeerden een aparte subgroep:
Enkel NPM1 mutatie in afwezigheid van FLT3-ITD = geassocieerd met betere OS/DFS en lager risico op h erval
Schnittger et al, Blood 2005Dohner et al, Blood 2005Verhaak et al, Blood 2005Thiede c, Blood 2006
Prognose NPM1/FLT3-ITD
32
Prognose FLT3/NPM1/CEBPa
Schlenk et al, NEJM 2008, 358:1909-18
33
Moleculair landschap in AML
• Ontdekking van additionele moleculaire merkers die een belangrijke rol
spelen in de prognose van : DNMT3A mutaties (27%), IDH1/2 (18%), TET2
(~10%), RUNX1 (~10%), TP53 (~10%)
The Cancer Genome Atlas Research Network. N Engl J M ed 2013 / TCGA)
200 patiënten met AMLWGS/ WES1623 genen met een mutatie260 genen met tenminste 2 mutatieSlechts in 3 stalen geen mutatie4-5 afwijkingen per patiënt23 genen die het meest gemuteerd zijn (fig)
34
Moleculair landschap in MDS
944 patiënten met MDS2764 mutaties in 96 genen Mediaan: 3 afwijkingen per individu
(range 0 – 12)
Haferlach et al, Leukemia 2014
35
Toepassing voor AML/MDS in diagnostiek?
Rationale:Wat is de klinische nood om voor een bepaalde mutat ie te testen?
1/ Diagnostisch• MDS: klonale ziekte?
2/ Prognostisch• Risicostratificatie• Beslissing allo-SCT
3/ Target voor behandeling• Gerichte therapie• Biomerker voor predictie respons
4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte o f MRD 36
Diagnostische criteria MDS
Verworven klonale mutaties zoals gezien in MDS komen voor in hematopoïetische cellen van gezonde individuen zonder MDSOp heden is de aanwezigheid van MDS-geassocieerde somatische mutaties op zich NIET VOLDOENDE voor een diagnose van een MDS, ook bij een patiënt met e en onverklaarde cytopenie (Arber et al, Blood 2016: WHO 2016 revision!) Bijkomende studies nodig om de link te onderzoeken tussen deze specifieke mutaties, mutatiefrequentie en combinaties van mutaties met de ontwikkeling tot MDS
19-10-2016
7
37© 2010 Universitair Ziekenhuis Gent
MDS metringsideroblasten
SF3B1 mutatiesGen: splicing factor 3b, subunit 1Belangrijke rol in splicing van mRNA. Mutatie in MDS (20-25%) / MDS met ringsideroblasten (~80%)prognostisch gunstig
Klassificatie MDS op basis van % ringsideroblasten en SF3B1 mutaties:
MDS-RS 5% + SF3B1 mutatiesMDS-RS 15% zonder SF3B1 mutaties
Cazzola M et al. Blood. 2013Arber et al, Blood 2016
38© 2010 Universitair Ziekenhuis Gent
Toepassing voor AML/MDS in diagnostiek?
Rationale:Wat is de klinische nood om voor een bepaalde mutat ie te testen?
1/ Diagnostisch• MDS: klonale ziekte?
2/ Prognostisch• Risicostratificatie• Beslissing allo-SCT
3/ Target voor behandeling• Gerichte therapie• Biomerker voor predictie respons
4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte o f MRD
39
Risicogroepen in AML
anno 2010
ELN paper, Dohner et al, Blood 2010 40
Nieuwe risicostratificatie in AML gebaseerd op geïntegreerde genetische analyse.
Patel JP et al. N Engl J Med 2012
41
Prognostisch belang van mutaties in AML
Metzeler et al. Blood 2016;128:686-698Papaemmanuil, et al. N Engl J Med 2016; 374:2209-2221 42
Moleculaire diagnostiek in AML en MDS?
Rationale:Wat is de klinische nood om voor een bepaalde mutat ie te testen?
1/ Diagnostisch• MDS: klonale ziekte?
2/ Prognostisch• Risicostratificatie• Beslissing allo-SCT
3/ Target voor behandeling• Gerichte therapie• Biomerker voor predictie respons
4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte o f MRD
19-10-2016
8
43
Gerichte therapie in AML
Gen Drug Werking Status
FLT3 Sorafenib Inhibitie Phase 2/3
Midastaurin Inhibitie Phase 3
Quizartinib Inhibitie Phase 3
IDH1/2 AG-120/AG-221 Inhibitie Phase 1/2
DNMT3A / TET2
Azacytidine verwacht
Decitabine
44
Mutatiedetectie in een routinelab
•HRM = ‘High Resolution Melting’
•High resolution = een verschil van 1 bp kan gedetecteerd worden
•Techniek die toelaat om gekende SNPs op te sporen
•Fragmentanalyse mbv capillaire elektroforese (GeneScan)
•Opsporen van deleties/inserties, !geen puntmutaties
•Techniek laat 1 bp resolutie toe (insertie/deletie)
•Gevoeligheid beperkt tot 5%
Sequentiebepaling voor ieder staal niet haalbaar voor een routine labo � mutatie scanning techniek
FLT3 WT
FLT3-ITDNPM1 WT
NPM1 + 4
bp
45
NEXT GENERATION SEQUENCING
MDG of ‘Moleculaire diagnostiek Gent’: nieuw platform waar technieken voor verschillende toepassingen ter beschikking staan; samenwerking Medische Genetica, Klinische Biologie en PathologieNGS: next generation sequencing = hoofdtechniek; andere (nieuwe) moleculaire technieken kunnen ook aan bod komen (toekomst)
In-house NGS protocol:MiSEQ
Bestaande workflow voor constitutionele aandoeningenVoordelen: heel flexibel, snel genen toevoegen aan bestaande panelsNadelen: meer validatiewerk 46
2 NGS panels
Gen Aandoeningen
CALR ET, PMF
CSF3R CNL, aCML
JAK2 PV, ET, PMF
MPL ET, PMF
SETBP1 CMML, aCML, CNL
SRSF2 CMML
Gen Exon Codon
ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646
CEBPA 1 Alle codonsDNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot
op R882FLT3 14-15
(ITD)20 (TKD)
ITD: alle codonsTKD: D835 en I836
IDH1 4 R132IDH2 4 R140 en R172KIT 8/17 Exon 8: T417-R420
Exon 17: D816, D820, N822
NPM1 12 Alle codons, hotspot W288
NRAS 2-3 Codons 12, 13, 61
RUNX1 3-8 Alle codonsSF3B1 14-16 Alle codonsSRSF2 1 P95TET2 1-9 Alle codonsTP53 4-9 Alle codons
U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 (exon 6)
AML/MDS/CMML panel
MPN
AML/MDS uitwerking
• Translocatiescreening m.b.v. HemaVision
• WT1 overexpressie (qPCR)
• MLL-PTD (qPCR)
• AML/MDS panel met NGS indien klinisch relevant *:
FLT3, NPM1, CEBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1,
IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1 * < 65 jaar altijd; > 65 jaar te bespreken op MOC
Diagnose en herval AML
of MDS-EB-2
• MLL-PTD (enkel bij MDS)
• AML/MDS panel met NGS bij bewezen MDS/CMML/PMF en indien klinisch relevant */**: FLT3, NPM1, CEBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1, IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1
* < 65 jaar en te bespreken op MOC / ** NGS uitwerking bij
twijfelachtige diagnose MDS/CMML enkel na overleg op MOC
Nieuwe diagnose MDS: MDS-(RS)-SLD, MDS-(RS)-MLD, MDS del(5q), MDS-
EB-1, MDS-U
of CMMLof PMF
4848© 2008 Universitair Ziekenhuis Gent
Terugbetaling RIZIV AML/MDS
Acute leukemie: 5xaanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten)Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1jRAEB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt wordenMUTATIE-analyse kunnen niet worden aangerekend
Op heden – tem 31/10/2016
Acute leukemie: 8xaanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten)Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1jMDS-EB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt wordenKost MUTATIE-analyse met NGS gedekt
Vanaf 1 november 2016
19-10-2016
9
4949© 2008 Universitair Ziekenhuis Gent
Terugbetaling RIZIV voor MDS
Geen RIZIV tussenkomst voor mutatie-analyse bij MDS patiënten (< 10% blasten)Op heden ook GEEN diagnostisch criteriumCAVE oudere mensenUitwerking wel mogelijk, enkel in duidelijk overleg
50
Klinisch belang moleculaire diagnostiek
• DIAGNOSEclassificatie van patiënten met acute leukemie
• PROGNOSEbehandeling patiënten aanpassen (‘risk-adapted’ therapy)
• FOLLOW-UPopsporen minimale residuele ziekterest (MRD)opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling
51
Belang detectie fusietranscripten bij follow-up
BELANG gevoelige detectie en kwantificatie
‘minimal residual disease’ (MRD):
Real-time PCR kwantificatie van fusietranscripten bij leukemie is relevant voor
de follow-up and detectie van minimaleresiduele ziekte of MRD
52
� monitoring respons op therapie�selectie verder therapiekeuze
�indeling risicogroepen: zo snel mogelijk na inductietherapiehigh risk patiënten (hoge kans op herval) identificeren ondanks
CR
� predictie prognose: voorspelling verder klinischverloop
� detectie vroeg/laat herval
BELANG evaluatie minimale ziekterest (‘minimal residual disease’ of MRD)
Continue monitoring/follow up
53
Overzicht kwantitatieve qPCR UZ GentTarget
(transl/mut/overexpr)Gene Fusions Incidence Prognosis
t(9;22) (q34;q11) ABL/BCR: p190 en p210
Pre B-cel ALL: 25-30% volwassenen; 2-5% kinderen
Slechte prognose
t(8;21) (q22;q22) ETO/AML1 AML: 5-12 %, AML M2: 30 % Goede prognose
t(4;11) (q21;q23) V/MLL11q23 abnormaliteiten
5% pre B-cel ALLMeest frequente 11q23 abnormaliteit bij pre B-ALL
Slechte prognose
t(9;11) (p22;q23) MLL-AF9 Precursor B-cel ALL11q23: 5-6 % van AML (M4-5)
Intermediaire prognose
t(12;21)(q12;q22) TEL/AML-1 25% pre B-ALL bij kinderen Goede prognose
inv(16) (p13;q22) MYH11/CBFbeta 8-12 % van AML, zeer hoge associatie met AML M4 eos
Goede prognose
t(1;19) (q23;p13) E2A-PBX1 3-5% kinderen - 3% volwassen ALL
prognose controversieel
t(15;17)(q22;q21) PML/RARalfa 5-8 % van AML, associatie met AML M3: > 95%
Goede prognose54
Overzicht kwalitatieve RT-PCR UZ Gent
Target (transl/mut/overexpr) Gene Fusions Incidence Pr ognosis
t(6;9) (p23;q34) DEK/CAN 1% AML Slechte prognose
t(1;22)(p13;q13) OTT-MAL AML7 (children) Slechte prognose
Microdeletie 1p32 SIL-TAL 5-25% T-ALL ? controversieel
Target (transl/mut/overexpr)
Gene Fusions Incidence Prognosis
NPM1 mutatie / 25-35% AML (~50% CN-AML) Good
WT1-overexpressie / 80-90% /
Overzicht kwantitatieve qPCR UZ Gent
19-10-2016
10
55
Belang fusietranscript BCR-ABL bij CML
Belang mutatie JAK2V617F, CALR, MPL,… bij Phi-negatieve MPN
Moleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieve
aandoeningen (MPN)
56
- Chronic myelogenous leukaemia, BCR-ABL1 positive
- Chronic neutrophilic leukaemie (CNL)
- Polycythemia vera (PV)
- Primary myelofibrosis (PMF)
- Essential thrombocythaemia (ET)
- Chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified (CEL, NOS)
- Mastocytosis
- Myeloproliferative neoplasm, unclassifiable
Myeloproliferatieve Aandoeningen
o WHO classificatie 2008:
o MDS/MPD: CMML, JMML, atypic CML (BCR-ABL1 negative),MDS/CMD unclassifiable
57
2016 update
Geen significante veranderingen indelingVeranderingen diagnostische criteria
Nieuwe mutatiesBeter inzicht in morfologisch kenmerken
Mastocytose ≠ MPNMDS/MPN met ringsideroblasten en trombocytose = aparte categorie (niet meer provisoir)
58
Chronic myeloid leukemia or CML
CML accounts for 15-20% of all adult leukaemias(incidence: 1-2 cases per 100.000)
Median patient age at diagnosis: 55-60 years3 phases: chronic – accelerated – blast crisisMajority (>80%) of cases of CML diagnosed in chronicphase (CML-CP)
CML is the first cancer to be shown to be caused by anunderlying genetic abnormality
59
Enige CMPD die geassocieerd is met een‘specifieke’ genetische
afwijking:
> 95% t(9;22)(q34;q11)
BCR-ABL1
Gerelateerd aan pathogenese !
60
Tyrosine kinase inhibitoren (TKI):Imatinib mesylate (Gleevec, Glivec, STI-571)
19-10-2016
11
61
M-Bcr = ‘major’ breakpoint cluster region
m-Bcr = ‘minor’ breakpoint cluster region
CML
ALL
genome/DNA
mRNA
Nashed et al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003)
BCR-ABL1
62
Diagnose CML
Perifeer bloed voor detectie BCR-ABLdoor moleculaire genetische techniekenKaryotypering t(9;22)(q34.1;q11.2)
BM aspiraat is essentieel bij diagnoseComplete karyotypering (bijkomende abnormaliteiten)Ziektestadium bepalen
63
NIEUWE DIAGNOSE CML
staal voor
Karyotypering FISHqPCR
Klinische biologie CMGG
EDTA
Na/Li-heparine buis
PB BM
64
Belang moleculaire monitoring bij FU CML
Response to treatment (imatinib); most patients in CP have an excellent response to imatinib (CCyR)Some patient, however, still progress
Early detection of relapse, progression or treatmentfailure provides an opportunity for alternative therapy(second generation TKI)Prognostic information: MMR
Clinical need for the additional risk stratification is necessary
65IRIS Study,update 2004
No CCyR<3 log reduction>=3 log reduction
% w
ithou
t pro
gres
sion
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Months since randomization0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51
estimated rate of survival without progression at 42 months:
n=138 75% PFSn=94 90% PFSn=136 98% PFS
Progression-free Survival on 1 st-line Imatinib by Molecular Response (MR) at 12 months
MMR
66
Definition of the response to TKI (any TKI) first-lin e treatmentRecommendation of European LeukemiaNet: incorporatin g
molecular responses at 3, 6, 12 and 18 months
Baccarani et al, Blood 2013
EvaluationTime
Optimal Warning Failure
3 months BCR-ABL1 ≤ 10%and/orPh+ ≤ 35%
BCR-ABL1 > 10%and/orPh+ ≤ 36-95%
No CHRand/orPh+ > 95%
6 months BCR-ABL1 ≤ 1%and/orPh+ 0
BCR-ABL1 1 - 10%and/orPh+ 1 - 35%
BCR-ABL1 > 10%and/orPh+ >35%
12 months BCR-ABL1 ≤ 0.1% (MMR) BCR-ABL 1 0.1 - 1% BCR-ABL1 > 1%and/orPh+ > 0
After 1 year and any time
BCR-ABL1 ≤ 0.1% Clonal chromosomeabnormalities (CCA) in Ph-cells (-7, or 7q-)
Loss of CHR, loss of CCyR, confirmed loss of MMR (>0.1%), mutations, CCA/Ph+
19-10-2016
12
67
Definitions of CMR
68
JAK2V617F mutatieInvolvement of Janus Kinases in Cytokine Signal Transduction (Panel A) and Structural Map of Janus Kinase 2 (Panel B)
Goldman JM, NEJM 2005
� verworven puntmutatie chrom 9 exon 14; G naar T op codon 617 => Valine naar phenylalanine
� 2005: first reports by 4 groups
� gain-of-function point mutation, resulting in a constitutive tyrosinephosphorylation activity -> cytokine-independent activation of JAK-STAT pathway
� proliferative and survival advantageto affected hematopoietic precursorsstimulatie erythropoïese zonder
groeifactoren zoals EPO
69
Klinisch belang JAK2V617F DIAGNOSTISCHE WAARDE:
! Belangrijke moleculaire merker bij diagnose van BCR-ABL negatieve chronische myeloproliferatieve aandoeningen; heterogene groep met vaak complexe histologische diagnose
JAK2 tijdperk: veel vereenvoudigdsimpele en relatief goedkope assay
� Ziekte van Vaquez of polycythemia vera (PV): >95% JAK2V617F positief
� Essentiële thrombocytemie (ET): ~50% positief
� Primaire myelofibrose (PMF): ~50% positief100% specifiek voor klonale aandoening
Geen onderscheid mogelijk tussen de verschillende MPD 70
JAK2 V617F qPCR
Controle PCR: amplificatie wild type en gemuteerd DNA
Mutatie PCR: amplificatie wild type allel geblokkeerd door LNA (locked nucleidacid) klem
Denys et al., J Mol Diagn 2010
71
Andere mutaties bij MPN
• MPL mutaties‘myeloproliferatieve leukemie virus’ gen codeert voor een trombopoïetine receptor (TPO)Trombopoïetine (TPO) en MPL-receptor reguleren de productie van trombocytenMeest voorkomende mutatie: MPLW515L en MPLW515K5% van PMF en 1% ET
• JAK2 exon 12 mutaties– Reeds meer dan 12 verschillende beschreven– JAK2V617F negatieve PV-patiënten (3-5%)
72
Mutation Calreticulin – CALR (1)December 2013: gelijktijdige publicatie NEJM (Nangalia et al + Klampfl et al)CALR exon 9 mutaties in meest ‘nonmutated JAK2’ MPN20-25% van alle patienten met ET of PMF (of ~60% van de JAK2/MPL negatieve ET/PMF)NIET bij PVInitiële papers JAK2 en MPL niet samen (mutual exclusivity); ondertussen reeds enkele gevallen beschreven wel beide positiefFrameshift inserties of deletiesOp heden meer dan 50 verschillende types mutaties in CALRMeest frequente (80% van CALR mutaties):
Type I: 52-bp deletieType II: 5-bp insertie
Buiten ET/PMF, enkele gevallen bij CMML, atypische CML, MDS, RARS-T
19-10-2016
13
73
Mutation CALR (2)
Belang1) Diagnostisch2) Klinisch/prognostisch
CALR-gemuteerd ET:
• minder risico op trombose
• eerder jonge personen
• Lagere WBC en Hb
• meestal hele hoge plaatjes
Indolent klinisch verloop
CALR-gemuteerd PMF: betere OS tov JAK2+/MPL+
Triple-negative PMF (nonmutated JAK2, CALR, MPL): slechtste OS met grootste risico op evolutie naar AML!
Recent werd ook aangetoond dat het type mutatie impact heeft op de prognose
Chao M P , and Gotlib J Blood 2014;123:1438-1440
74
Klinisch belang mutatieanalyse
WHO 2016 revisie
‘major’ diagnostic criteria
75
Diagnostisch belang – prognose
Belang mutaties bij MPN/MPN-MDS
JAMA Oncol. 2015 76
2016 WHO revisie
RARS-T has been accepted as a full entity (2016)New name: MDS/MPN with ring sideroblasts and thrombocytosis (MDS/MPN-RS-T)
True overlap disease
MDS like MPN like
Clinical refractory anemiatransfusion dependent
thrombocytosis(>450.000/µL)
Morphological dyserythropoiesis in the BM with ring sideroblasts (>15%)
large megakaryocytes with features resembling those in PMF or ET
Genetic SF3B1 mutation (80-90%) JAK2 mutatie (50-60%) rarely CALR/MPL
77
2 NGS panels
Gen Aandoeningen
CALR ET, PMF
CSF3R CNL, aCML
JAK2 PV, ET, PMF
MPL ET, PMF
SETBP1 CMML, aCML
SRSF2 CMML
Gen Exon Codon
ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646
CEBPA 1 Alle codonsDNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot
op R882FLT3 14-15
(ITD)20 (TKD)
ITD: alle codonsTKD: D835 en I836
IDH1 4 R132IDH2 4 R140 en R172KIT 8/17 Exon 8: T417-R420
Exon 17: D816, D820, N822
NPM1 12 Alle codons, hotspot W288
NRAS 2-3 Codons 12, 13, 61
RUNX1 3-8 Alle codonsSF3B1 14-16 Alle codonsSRSF2 1 P95TET2 1-9 Alle codonsTP53 4-9 Alle codons
U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 (exon 6)
AML/MDS panel
mini MPN-panel
78
Vermoeden MPN
Bloedstaal voor Klinische Biologie (beenmerg niet nodig)
PCR t(9;22) of BCR-ABL bij leukocytose en vermoeden CML
• Opvallende polycythemie, met normale O2 saturatie
• Trombocytose
• Leukocytose
• Cytopenie (vermoeden myelofibrose)
Mutatie JAK2V617F bij polycythemie, trombocytose of vermoeden PMF
OF/EN Mutatieanalyse
m.b.v NGS
OF/EN
19-10-2016
14
79
Diagnostische uitwerking MPN/MPN-MDS panel NGS- stra tegie
Mutatie JAK2V617F
qPCR
POSITIEF>1%
Bevestiging diagnose:
95% PV
~50-60% ET en PMF~50-60% RARS-T
zeldzaam CMML
NEGATIEF OF
POSITIEF maar minimale kloon,
< 1%
- Thrombocytosis (> 400 x 109/L) / vermoeden ET
- Vermoeden myelofibrose(cytopenie)
- Polyglobulie / vermoeden PV
Vermoeden CMML, JMML, aCML, MDS/PMN-U,
RARS-T
NGS MPN panel
NGS AML panel in geval van
CMML of PMF
F
80
Terugbetaling RIZIV MPN
BCR-ABL bij Dx CML (verstrekking 588512-588523): 1x aanrekenen (dus geen uitwerking op BM en PB)
CML FU (588593-588604): 4x aanrekenen
Mutatie JAK2V617F (589691-589702 ): 1x aanrekenen
Op heden – tem 31/10/2016
Verstrekking 589691-589702 voor JAK2V617F valt weg!Aanpassing verstrekking 588512-588523 waarbij genafwijkingen door middel van een moleculair biologische methode worden opgespoord in de diagnostische investigatiefase van een chronische myeloproliferatieve neoplasie (niet meer CML).Uitwerking MPN: 2x aanrekenen (B3500)
Vanaf 1 november 2016
81
Wanneer PCR nodig?
Belang diagnose en follow-up
Moleculaire diagnostiek bij lymfomen
82
Diagnostiek
Kliniek: anamnese en lichamelijk onderzoek (gezwoll en lymfeklier)LABO
Cytomorfologisch onderzoek (klierbiopsie, uitstrijkje bloed en beenmerg)
Hoe zien de cellen eruit? Normaal of afwijkend?
Histologisch onderzoek door anatomopatholoogHoe zien de cellen en het weefsel eruit?
Immunofenotypering m.b.v. flowcytometrie
Klonaliteitsonderzoek en algemene typeringMoleculaire diagnostiek
Klonaliteitsonderzoek en opsporen specifieke translocatie
83
1 2 3 4 5 6 66 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6
VH DH JH Cµs
D J joiningH H→
V D -J joiningH H H→
precursor mRNAIGH
mature mRNAIGH
transcription
RNA splicingV DJ Cµ
27
IgH
IgL IgL
V V
C C
J J
IgHV V
D DJ J
C C
C
C
C
C
C
C
CD
79a
CD
79b
translation
junctional region
Ig (en TCR) genherschikking
84
PCR gebaseerde klonaliteit
BIOMED-2 protocol
Multiplex PCR
Verbetering sensitiviteit
Gestandaardiseerd protocol: betere inter-lab vergelijking
19-10-2016
15
85
IgH Genescan
FR1 FR2 FR3
86
Immunoglobuline genherschikkingVDJ recombinatie is uniek voor elke B-cel5 multiplex PCRs:
3 voor zware keten (FR1, FR2 en FR3)2 voor kappa lichte keten (K+Kde)(IgL: beperkte variabiliteit, interpretatie moeilijk)
IGH IGK all IGH DH-JH
VH-JH DH-JH VH-JH Vκ-Jκ Kde Vκ-Jκ + IGK + Kde*
+DH-JH + Kde
MCL (n=54) 100% 11% 100% 94% 75% 100% 100% 78%
B-CLL/SLL (n=56) 100% 43% 100% 96% 61% 100% 100% 73%
FL (n=109) 84% 19% 86% 63% 59% 84% 100% 64%
MZL (n=41) 88% 51% 95% 68% 54% 83% 100% 68%
DLBCL (n=109) 79% 30% 85% 61% 58% 80% 98% 72%
TOTAL (n=369) 88% 28% 91% 73% 60% 88% 99% 70%
BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:207-241
87
T-cel receptor genherschikking
VDJ recombinatie specifiek voor elke cel5 multiplex PCRs
3 PCRs voor TCR beta keten2 PCRs voor TCR gamma keten
TCRB TCRG TCRB Vβ-Jβ Dβ-Jβ Vβ-Jβ Vγ-Jγ + TCRG
+ Dβ-Jβ
T-PLL (n=33) 94% 47% 100% 94% 100%
T-LGL (n=28) 86% 62% 96% 96% 100%
PTCL-U (n=47) 85% 67% 98% 94% 100%
AILT (n=37) 70% 61% 89% 92% 95%
ALCL (n=43) 70% 48% 74% 74% 79%*
TOTAL (n=188) 80% 58% 91% 89% 94%* (99%)
BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:207-241
88
Klonaliteitanalyse m.b.v. PCR
Startmateriaal: bloed, beenmerg, biopt (vers of in paraffine)
Paraffine coupes: minimum 3 coupes van 50 micron: voldoende weefsel
DNA isolatie
Klinische info !
89
VOORDELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse
Hoge klinische gevoeligheid (zie voorgaande tabelle n)Moleculaire diagnostiek vaak niet eerste lijn in de diagnostische uitwerking; vaak geen vers materiaal meer beschikbaarGefixeerd materiaal / paraffinecoupes nog bruikbaar voor PCR applicaties, FISH
CAVE belang fixatie protocol, waardoor beschadiging nucleïnezuren (gefragmenteerd); afh. Best gebufferde formol (4%) en minder dan 24h fixatieduur
90
NADELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse
ComplexInterpretatie vaak moeilijkVeel pitfallsAnalyse vereist voldoende kwantitatief en kwalitati ef (niet gefragmenteerd) DNA;
niet altijd mogelijk op paraffinecoupesCAVE pseudoklonaliteit door preferentiële amplificatie bepaalde herschikkingen (toevallige amplificatie van 1 kloon)
Vals negativiteit mogelijk: zeldzame herschikkingensomatische hypermutatie kan primer binding sites beinvloeden (vooral zware keten, lichte keten minder gevoelig)te weinig B/T cellen in gekregen materiaal
EXPERTISE VEREIST !
19-10-2016
16
91
Toepassingen klonaliteitsanalyse met PCR
DIAGNOSEHistopathologische DD maligniteit vs reactief beeld: op vers en paraffine materiaalB-cel maligniteiten: uitwerking vermoeden klonaliteit met flowcytometrie (niet altijd duidelijk)T-NHL: uitwerking aberrant fenotype gevonden met flowcytometrie
STAGING (gevoeligheid 1-10 %)
Klonale verwantschap: klonaal verband aantonen tussen verschillende lymfoproliferatieve letsels bi j diagnose of evolutie klonale verwantschap in follow -up stalen
92
Niet geschikt voorBepaling lineage (T vs B vs NK): ook IgH herschikking mogelijk in T-cel abnormaliteit en vice versaFollow-up van behandeling (gevoeligheid is beperkt)Bepaling biklonaliteit (door combinatie van primer technisch meerdere pieken mogelijk te wijten aan 1 kloon)
Toepassingen klonaliteitsanalyse met PCR
93
Vermoeden lymfoproliferatieve aandoening
Bloedstaal voor:
TCR genherschikking PCR
B-cel: bepaling mKappa / mLambda expressie
T-cel: aantonen aberrante populatie (weinig specifiek)
OF/EN
PCR
Klinische biologie UZ Gent
Flowcytometrie:
Ig genherschikking PCR
94
BCL1-IgH of t(11;14)Genetic hallmark voor mantelcellymfomen (vrijwel al le)IgH-BCL1 herschikkingBCL1 (=CCND1):
cycline D1 (oncogen) onder controle van enhancer regio van IgHgeen abnormaal fusieproteïne gevormd, enkel verhoogde expressie van cycline D1
Variabiliteit in breukpunten (FISH is ‘golden stand ard’)
van Dongen et al.,Leukemia, 2003
95
BCL1-IgH of t(11;14)Variabiliteit in breukpunten (FISH is ‘golden stand ard’)PCR gebaseerde methode mbv 5’ MTC regio: 40% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerd
Indien PCR positief, wel nuttig voor MRD analyseGevoelige assay: 0,01%
van Dongen et al.,Leukemia, 2003
96
BCL2-IgH of t(14;18)
Folliculair lymfoom of grootcellig B-cel lymfoom
BCL2 (anti-apoptotisch):onder controle van enhancer regio van IgHgeen fusieproteine, enkel verhoogde expressie van BCL2geen supergevoelige PCR gebruiken (translocatie ook te vinden in gezonde individuen)
FISH = gouden standaard (detectie alle breekpunten)
PCR gebaseerde methode; 3 sets van primers 60% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerdMRD analyse
19-10-2016
17
97
BCL2-IgH of t(14;18)
4 belangrijk regio’s met frequente breukpunten 3 multiplex PCRs bij nieuwe DxGevoeligheid follow-up: 0.01-0.001%
van Dongen et al.,Leukemia, 200398
Vermoeden MCL of FLStaal voor:
Karyotypering FISHPCR
Klinische biologie CMGG
Flowcytometrie
FISH op celsuspensie
Geen karyotypering meer!
99
CLL-epidemiology
20-25% of all leukemic diseases
• Incidentie: 3 (2- 4,5) /100 000/jaar / western countries (>70 years: 50/100 000/jaar) / 20-25% van alle leukemieën
• Mediane leeftijd: 65–70 jaar
• Maligniteit van rijpe 5 (memory) B-cellen
• Monoclonale proliferatie van afunctionele lymfocyten met een niet gekarakteriseerd apoptosedefect.
100
CLL = heterogene aandoening
101
• Clinical staging Rai, Binet
• Lymphocyte doubling time (LDT)
• Pattern of marrow involvement (nodal, mixed, diffuse)
• Pattern of lymph node infiltration?
• Serum markers: LDH, beta2-microglobulin, thymidinekinase, sCD23, sCD54, sCD20
• Phenotype CD38, ZAP-70
• IGVH gene mutation status
• Genetic aberrations
CLL – prognostische factoren
102
Genetische afwijkingen bij CLL
Chromosomale afwijkingen bij 80% van de CLL patiënten
Meest frequente deleties en gains� Trisomie 12� Deletie 13q14� Deletie 11q22� Deletie 17p13
Verstoring p53 pathway
19-10-2016
18
103
CLL- prognose van cytogenetische afwijkingen
Döhner et al, NEJM 2000104
Genetische afwijkingen: detectiemethoden
Klassieke cytogenetica: karyotypering
FISH: slechts 50% van de chromosoomafwijkingen te detecteren
Array CGH (comparative genomic hybridisation)
105
Deletie 11q, trisomie 12, deletie 15q, deletie Xp?
Array-CGH
106
Genetische afwijkingen bij Multiple Myeloom
Chromosomale afwijkingen bij 90% van de MM patiëntenTranslocaties: IgH gen op chromosoom 14q32 (50-70%) -> t(4;14) / t(11;14) / t(14;16)Meest frequente deleties en gains� 1q afwijking (winst)� Deletie 13q14 (50%)� Deletie 17p13
TP53 mutaties
107
CLL en MMStaal voor:
Karyotypering FISH
PCR
Klinische biologie
CMGG
Flowcytometrie
108
Chronisch lymfoproliferatieve aandoeningen
19-10-2016
19
109
Nieuwe genetische afwijkingen in lymfoproliferatieve aandoeningen
BRAF V600E mutatieWHO 2008: 'no cytogenetic abnormality is specific for hairy cell leukemia’ BRAF V600E mutaties komen voor in hairy cell leukemie (HCL), maar niet in de morfologisch moeilijk te onderscheiden variant, HCL-vBelangrijke diagnostische waarde
MYD88 L265P mutatieTerug gevonden bij > 90% van de M. Waldenström of LPLBelang sensitieve techniekInvloed NF-kB pathway -> Velcade (bortezomib) werkt in op NF-kB pathway
110
MDGElien De Latter
Joni Van der Meulen
Klinische BiologieBarbara Denys
Karl Vandepoele
Centrum Medische Genetica
Nadine Van Roy
111
Postgraduaatvergadering Klinische Biologie
17/11/2016 – 20h
2016 revisie WHO classificatie hematopoïetischemaligniteiten