Post on 01-May-2015
LA SIFILIDELA SIFILIDE
“ “ He who knows syphilis knows medicine” He who knows syphilis knows medicine” Sir William Osler (1849-1919)Sir William Osler (1849-1919)
La sifilide è una malattia infettiva trasmessa principalmente per via sessuale, causata dal Treponema pallidum subsp.pallidum, batterio mobile spiraliforme appartenente all’Ordine Spirochetales, Famiglia Treponematacee.
Il batterio filiforme,appare filamentoso ed avvolto a spirale e le sue Dimensioni in lunghezza sono nell’ordine di 5 mi-cron – 15 micron con un diametro trasverso tra 0,1 micron e 0,2 micron.
Si moltiplica per scissione semplice con divisione trasversale ed al contrario di molti consimili della sua famiglia, per le sue particolari esigenze nutritive e metaboliche, non può essere coltivato in vitro o meglio può esserlo solo per breve tempo con un massimo sopravvivenza di 7 giorni a 35°, in terreno particolarmente arricchito ed in presenza di CO2.
Non sopravvivono più di 48 ore nel sangue da trasfondere conservato nelle emoteche. In azoto liquido mantengono la loro vitalità, mentre proliferano in maniera eccellente nei testicoli di coniglio.
Rothschild B.M. Existence of syphilis in a Pleistocene bearNature. 335 (6191):595, 1988 Oct 13Wright D.J.Syphilis and Neanderthal manNature . 229 (5284):409, 1971 Feb 5
Una patologia che viene da lontano….. nel tempo?
…o nello spazio?
LA CLINICA
EVOLUZIONE NATURALE DELLA SIFILIDE
Studio di Oslo 1404 pazienti non trattati seguiti dal 1890 al 1941
sifilide I ---> sifilide II | latenza ---> 25% recidive | < 2 anni | sifilide latente tardiva (sifilide III)
DEFINIZIONI Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide
l’OMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi l’OMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi alla seguente classificazione:alla seguente classificazione:
a) infezioni primarie e secondariea) infezioni primarie e secondarieb) infezioni latenti recenti ( <2 anni)b) infezioni latenti recenti ( <2 anni)c) infezioni latenti tardive (>2 anni)c) infezioni latenti tardive (>2 anni)d) infezioni tardive sintomatiched) infezioni tardive sintomatichee) infezioni connatali in soggetti con meno di due e) infezioni connatali in soggetti con meno di due
anniannif) infezioni connatali in soggetti con due anni o piùf) infezioni connatali in soggetti con due anni o più
Si definisce sifilide latente recente un’infezione Si definisce sifilide latente recente un’infezione diagnosticata sierologicamente, la cui durata non diagnosticata sierologicamente, la cui durata non oltrepassi i due anni; dopo due anni si definisce oltrepassi i due anni; dopo due anni si definisce sifilide latente tardiva.sifilide latente tardiva.
LATENZA Periodo di silenzio clinico caratterizzato dall’assenza di
lesioni e/o sintomi compreso tra:
contagio e comparsa del sifiloma (1° latenza o incubazione)
regressione delle lesioni primarie e comparsa delle eruzioni cutanee secondarie (2° latenza o recente)
regressione delle eruzioni cutanee secondarie e comparsa delle manifestazioni terziarie cutanee e/o sistemiche (3° latenza o tardiva)
DIAGNOSI
La diagnosi di sifilide si basa su:
- clinicaclinica
- anamnesianamnesi
- laboratorio laboratorio
Sarebbe un grave errore trascurare anche uno solo dei tre elementi
IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE
L’OSSERVAZIONE DI UN ESSERE VIVENTE PUO’ AVVENIRE PER RICONOSCIMENTO DIRETTO….
O INDIRETTO….
IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE
DIAGNOSI DIRETTA Dimostrazione in sede di lesione della presenzadel Treponema pallidum, indice certo di malattia
DIAGNOSI INDIRETTA o SIEROLOGICADimostrazione degli anticorpi anti Treponema pallidum, indice di infezione
DIAGNOSI DIRETTA dimostrazione del Treponema pallidum
1905: Identificazione del Tp al microscopio ottico
(Schaudinn F & Hoffmann E)
1907: Trasmissione del Tp dall’uomo al testicolo di coniglio
(Parodi U Giornale dell’Accademia Medica di
Torino 13:288;1907 )
1909: Microscopia in campo oscuro (Coles)
1948: Rabbit Infectivity Test (Magnuson)
1964: Immunofluorescenza diretta (Yobs AR)
1990: PCR (Hay)
Diagnosi diretta del treponema
• Cross section of a spirochete PF=periplasmic flagell OS=outer sheath
IL Treponema pallidum,Treponema pallidum, appartiene alla famiglia delle Treponematacee, batteri di forma elicoidale,
mobili, a divisione trasversale.lunghezza variabile da 8 a 14 micron
larghezza variabile da 0.15 a 0.20 micron.
TEM x60.000
Treponema pallidum
• Microscopia elettronica al Scansione (SEM)
Microscopia elettronica a scansione (SEM)
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM): spirocheta infiltrata nei tessuti
Struttura antigenica
Un antigene polisaccaridicoUn antigene lipidicoUn antigene proteicoAntigeni del corpo del treponema
La conoscenza antigenica del treponema pallido ha consentito l’uso di metodi diagnostici diretti specie specifici
(DFA-TP)
Trasmissione del Tp dall’uomo al testicolo di coniglio
Istopatologia: Treponema pallidum coltivato su testicolo di conoglio (whartin-Starry silver stain)
Il treponema pallido non cresce in vitro ma può essere coltivato nel testicolo di coniglio e identificato su preparato istopatologico colorato con sali di argento
1909: Microscopia in campo oscuroContrasto di fase: Questa tecnica si usa per evidenziare
preparati trasparenti che non possono assorbire luce. Il preparato è reso visibile perchè viene contrastato con un'altra angolazione di luce e quindi canbiandogli il proprio indice di rifrazione.
Campo oscuro: Viene inserito un disco opaco (chiamato “stop”) sul percorso della luce, cosicchè solo un cono vuoto di luce illumina il soggetto e permette la risoluzione di dettagli fini. L’illuminazione è obliqua e entra nell’obiettivo solo se rifratta dall’oggetto osservato, il fondo rimane scuro.
1909: Microscopia in campo oscuro
(PARABOLOIDE)La microscopia in campo oscuro è il metodo più veloce e diretto per diagnosticare la sifilide primaria e secondaria. I campioni devono essere esaminati immediatamente dopo il prelievo da parte di personale addestrato al riconoscimento del Treponema pallidum.
1964: Immunofluorescenza diretta (DFA-TP)
L’immunofluorescenza diretta mediante ab specifici (DFA-TP) può essere utilizzata per identipicare il T. pallidum. I vantaggi di questa tecnica rispetto alla microscopia in campo oscuro è che lo striscio non deve essere esaminato subito ed è specie specifico. Richiede tuttavia attezzature specifiche e personale con esperienza.
anticorpo monoclonale fluorescente diretto verso l’antigene lipoproteico di 47 kd. Courtesy of Sheila Lukehart
Il genoma del Treponema p. è stato completamente sequenziato
Fraser CM, Norris SJ, et al: Science 1998 Jul 17;281(5375):375-388
Il genoma di T. pallidum consiste di 1.138.006 paia di basi e contiene 1041 predicted open reading frames (ORF)
BIOLOGIA MOLECOLARELa conoscenza della sequenza genomica e di alcune proteine specifiche da esso codificate ha consentito l’uso di indagini biomolecolari :
• PCR x gene codificante proteina 47Kd sensibilità 10-50 spirochete
• PCR x DNApolimerasi I sensibilità 10-50 spirochete
• RT-PCR sensibilità 1 spirocheta
Attendibilità diagnosticaSENSIBILITÀ: amnios (100%), lesione mucose o cutanee esulcerate (96%), sangue (67%) liquor (60%)
SPECIFICITÀ: lesione cutanea (96%), amnios e sangue(100%) LIMITI:
CostiIncapacità distinguere TP vitali e tracce di TP morti Non indicato su liquorTempi di esecuzione
PCR x gene codificante proteina immunogena di membrana 47Kd
• Zoechling N. et al 1997: PCR nested per il gene di una proteina di membrana immunogenica di 47 Kd----- banda 196 pb
• H S Jethwa et al. J Clin Microbiol. 1995 January; 33(1): 180–183 ------banda 658pb
• Karina A. Orle Et al 1996. Multiplex PCR Haemophilus, Treponema (47KdProt.), Herpes.
AMPLICOT Kit format (Roche Molecular system) colorimetric detection sistem
PCR x gene codificante DNA polymerase I.
Liu H, Rodes B, Chen CY, Steiner B.New tests for syphilis: rational design of a PCR method for detection of Treponema pallidum in clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene.
J Clin Microbiol. 2001 May;39(5):1941-6. agarose gel electrophoresis of polA PCR from serial dilutions of known concentrations of T. pallidum DNA extract. (A) Primer set I. The arrow indicates a 377-bp product. (B) Primer set II. The arrow indicates a 395-bp product. Lanes 1, 2
Sensibilità 95,8%; specificità 95.7%
N.L. Treponema pallidum Kit
•Estrazione mediante gel di silice
•Banda specifica per Treponema p. 273 pb
•Controllo interno 668pb Tempo di esecuzione
: in giornata
N. L. Treponema pallidum Kit•Estrazione mediante gel di silice
•amplificazione
N. L. Treponema pallidum Kit
•Banda specifica per Treponema p. 273 pb
•Controllo interno 668 pb
273 pb Treponema
668 pb Controllo interno
Treponema pallidum PCRcasistica centro MST
1° Clinica Dermatologica Torino
n. campioni
POSITIVI NEGATIVI
NO LUE 18 0 18LUE I 44 38 6*LUE II 13 12 1**LUE SIEROLOGICA RECENTE
2 0 2
* 3 lesioni alla cervice uterina 3 solco balano-prepuziale
** roseola del tronco
Isolamento del Tp da lesioni muco-cutaneeMICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO
• sensibilità buona (80%)
• specificità buona
• operatore-dipendente
• risposta immediata
• labilità del campione
• economico
• adatto a qualsiasi laboratorio
PCR
• sensibilità elevata (96%)
• specificità elevata
• operatore indipendente
• risposta in giornata
• invio dei campioni
• costo elevato
• laboratorio attrezzato
Indicazioni alla diagnosi diretta
La dimostrazione del T. pallidum
è raccomandata in:
•sifilide primaria sieronegativa
•sifilomi extragenitali (orale, anale)
•Sifiloma cervicale
•re-infezioni
•coinfezione con HIV
•Sifilide secondaria atipica
E’ poco utile nelle forme
secondarie e terziarie
DIAGNOSI SIEROLOGICA:dimostrazione di anticorpi anti T. pallidum
Il riscontro di anticorpi anti T. pallidum indica solo una risposta
immunitaria dell’ospite alla presenza del Treponema, presente o
passata.
Non esiste un unico test sierologico che fornisca informazioni
certe sullo stadio della malattia.
Solo l’esecuzione di più test in contemporanea associati alla
clinica ci può permettere di definire l’esatto stadio.
DIAGNOSI SIEROLOGICAdimostrazione di anticorpi anti T.
pallidum1906:Reaz. di Wassermann
1946: Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)
1949: Treponema Pallidum Immobilisation (TPI)
1956: Rapid Plasmin Reagin (RPR)
1964: Fluorescence Treponemal Antibody-absorption
(FTA-abs)
1965: Treponema Pallidum HemAgglutination (TPHA)
1975: ELISA
1988: Western Blot
CLASSIFICAZIONE DEI TEST
NON-TREPONEMICI : VDRL (aspecifici) RPR Test TREPONEMICI : TPHA (specifici) FTA-abs ELISA/EIA Western Blot
Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR)
Questi test rivelano anticorpi IgG e IgM diretti contro lipidi di membrana del Treponema pallidum e contro lipidi serici presenti nell’ospite per il danneggiamento di membrane mitocondriali causato da diverse patologie.A questo scopo si utilizza la cardiolipina di bue che cross-reagisce con questi antigeni
Pangborn MC. A new serologically active phospholipid from beef heart. Proc Soc Exp Biol Med. 1941;48:484.
Harris, A., A. A. Rosenberg, and L. M. Riedel. 1946. A microflocculation test for syphilis using cardiolipin antigen. Preliminary report. J. Ven. Dis. Inform. 27:169-174.
VDRLHarris, A., A. A. Rosenberg, and E. Del Vecchio. 1948. The VDRL slide flocculation test for syphilis. II. A supplementary report. J. Ven. Dis. Inform. 29:72-75.
Venereal Disease Research Laboratory. VDRL tests. In: Scheele L A. , editor; Scheele L A. , editor. Manual of serologic tests for syphilis. U.S. Washington, D.C: Government Printing Office; 1949. pp. 109–120.
La VDRL ha soppiantato la reazione di fissazione del complemento, descritta per la prima volta da Wassermann, Neisser & Bruck, in 1906, conosciuta sotto il nome di reazione di Wassermann
VDRLL’antigene VDRL, che è una miscela di cardiolipina, lecitina e colesterolo, è la base di tutti i test non treponemici.
Con varie modificazioni l’antigene è stato stabilizzato per essere usato in altri test aggiungendo stabilizzatori e pigmenti:USR (unheated serum reagin test) con siero non scomplementatoRPR (rapid plasma reagin test) con plasma non scomplementato TRUST (toluidine red unheated serum test) (TRUST) con siero non scomplementato e aggiunta di blu di toluidina.
La velocità del test ha favorito l’RPR, ma la VDRL rimane l’unico test consigliato dalla FDA americana per diagnosticare la neurosifilide su liquor. Inoltre la VDRL rimane il test più economico e perciò è preferito nei laboratori con scarse disponibilità finanziarie (“paesi poveri”).
Antigene:cardiolipina di bue +lecitina + colesterolo
VDRL
anticorpi del
pazienteflocculazione
VDRL
4 agitazione
2 siero
3 reattivo
1 inattivazione complemento
VDRL POS
VDRL
VDRL NEG
Tempo di esecuzione
45-50 minuti
5 lettura
RPR e' un test non-treponemico di flocculazione per la determinazione qualitativa e semiquantitativa delle reagine (anticorpi) in siero o plasma
Il test viene effettuato su siero o plasma. l'antigene è costituito da una sospensione colloidale di cardiolipina, lecitina e colesterolo miscelata a microparticelle di carbone. Quando un siero reattivo viene posto a contatto con l'antigene, si ha la formazione di una flocculazione macroscopica.
RPR (Rapid Plasma Reagin) Portinoy J, Garson W, Smith Ca.
Rapid plasma reagin test for syphilis.Public Health Rep. 1957 Sep;72(9):761-6.
RPRRPR è una variazione della tecnica standard VDRL, ha analoga specificità e sensibilità lievemente diversaoffre i seguenti vantaggi: Reagente pronto all’uso Stabilità elevata Non è richiesta l’inattivazione del campione Può essere usato sia siero che plasma
Lettura ad occhio nudo dei risultati.
Svantaggi: non può essere usata su liquor
Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR): pregi e difetti
test quantitativi, se titolati follow-up
alta sensibilità
basso costo ed esecuzione semplice e rapida
positivizzazione precoce (80% positivi nella Sifilide I)
negativizzazione entro 2 anni dalla terapia
variabilità d’interpretazione legata all’operatore
fenomeno prozona
bassa specificità (30% falsi positivi)
TEST TREPONEMICI(TPPA, FTA-ABS, ELISA, WB)
test qualitativi (TPPA e FTA titolo) alta sensibilità (falsi neg eccezionali) buona specificità (rari falsi pos) positivizzazione variabile (IgM > FTA >TPPA) negativizzazione assente (o molto tardiva) costo variabile tempi più lunghi, laboratorio attrezzato
TPHA/TPPA
TPHA (T. Pallidum HemAgglutination)
TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)
Il TPHA, ideato nel 1965 è stato recentemente sostituito dal TPPA, più sensibile e utilizza particelle di gelatina al posto di emazie di pollo o altri volatili
Particelle di gelatina
particelle sensibilizzateantigeni treponemici
particelle sensibilizzate
anticorpi del paziente agglutinazione
TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)
TPHA/TPPA2 siero
3 particelle sensibilizzate e non
1 tampone sorbent
4 lettura
Tempo di esecuzione: circa 2h30’
TPHA/TPPA2 siero titolazione
FTA (Fluorescent Treponemal
Antibody)Deacon WE, Falcone VH & Harris A.Fluorescent Test for Treponemal Antibodies.Proc. Soc. Exper. Biol. & Med.96: 477-489, 1957
FTA-absHunter Ef, Deacon We, Meyer Pe. An Improved Fta Test For Syphilis, The Absorption Procedure (Fta-abs). Public Health Rep. 1964 May;79:410-2.
E’ il test storicamente usato per l’dentificazione delle IgM (lue congenita), oggi affiancato da ELISA e WB
FTA IgG e IgM
vetrino con Treponemi
adesi
FTA-abs
anticorpi del paziente
(siero adsorbito)
rivelazione
legame antigene - anticorpo
anticorpi anti Ig umane
Tempo di esecuzione 2h30’ ore
ELISA/EIA test qualitativo rapido, di facile interpretazione ed
automatizzato per la ricerca di Ig (G+M), IgG e IgM
indicato per lo screening di grandi popolazioni a
bassa prevalenza di sifilide (donatori, gravide, etc)
I casi positivi devono essere confermati con un altro
test
sensibilità elevata - no fenomeno prozona
specificità buona
basso costo solo per grandi popolazioni
ELISA/EIA
Tempo di esecuzione < 2 ore
WESTERN BLOTTest qualitativo utilizzato come test di
conferma nei casi dubbi:
sifilide congenita: ricerca IgM neurosifilide: esclusione di infezione
in caso di negatività
sensibilità buona: nella s. congenita (83-98% > FTA-abs)
specificità alta : > TPHA > FTA-abs promettente per neurosifilide e
treponematosi endemiche
Tempo di esecuzione
1h30’
Treponema pallidum immobilization
(TPI o test di Nelson) Test altamente specifico
Oggi in disuso
•Necessita di uno stabulario attrezzato per l’allevamento dei conigli e le colture dei Treponemi
•Utilizzo di apposite celle per l’esecuzione del test
•Gli anticorpi del paziente insieme al complemento immobilizzano i treponemi.
Il problema dei
FALSI NEGATIVI e
FALSI POSITIVI
REAZIONI FALSAMENTE NEGATIVEFENOMENO di PROZONA
Falsa negatività della VDRL per un meccanismo competitivo dovuto all’ inibizione della agglutinazione per una eccessiva quantità di anticorpi circolanti (TPHA 1:5120) Si verifica in corso di: sifilide secondaria sifilide latente recente reinfezioni HIV+
Si evita titolando la VDRL negativa fino a 1/16 La diluizione va eseguita solo in caso di sospetto clinico
REAZIONI FALSAMENTE POSITIVE
più frequenti nei test non treponemici (VDRL, RPR)
titolo stabile e basso (VDRL< 1: 8)
reazione falsamente positiva generalmente isolata
identificabili con i test di conferma
impossibilità a distinguere le treponematosi
endemiche (Framboesia, Bejel, ecc)
la reazione falsamente positiva può coesistere con
cicatrice sierologica rilevabile solo dall’anamnesi
Molto frequenti (1% pop. generale, 30% tossicodipendenti) La discordanza coi test treponemici permette la diagnosi
POSITIVITA’ RISCONTRATE SU 400 SIERI CHE DIMOSTRAVANO F.R.P. ALLA VDRL
(cortesia Dr. Panuccio Sanità pubblica Milano)
n. campioni positivi
%
Anti-HCV (epatite C) 89 22,3%
RA TEST (artrite reumatoide) 53 13,3%ASMA (anti muscolo liscio) 52 13%
Anti.HIV (AIDS) 40 10%APCA (anti cellule parietali)
14 3,5%ANA (anti nucleo) 14 3,5%AMA (anti mitocondrio) 4 1%HbsAg (epatite B)
ALTRE CAUSE4 1%
130 31,4%
TEST di CONFERMAnecessario per
• Esclusione di test falsamente positivi VDRL TPHA, FTA-abs ELISA TPHA + VDRL TPHA FTA-abs, Western Blot ELISA IgM (neonato) WB- IgM
• Esclusione di test falsamente negativi fen. prozona: VDRL VDRL diluita,
ELISA
APPLICAZIONE DEI TEST
SCREENING: VDRL/RPR + TPHAELISA (G+M)
TEST di CONFERMA: TPHA FTA-abs (FTA-IgM x sifilide
congenita) Western Blot
FOLLOW-UP: VDRL titolata
SCREENING PER POPOLAZIONIbanca del sangueostetricia (gravide)reparti neuro-psichiatrici
centro MST chirurgia d’urgenza espianto d’organo
VDRL/TPPA
test rapido:RPR o TPPA
ELISA(G+M)VDRL/TPPA
Screening per la sifilide negli utenti asintomatici di un Centro MST
VDRL / TPPA
VDRL - / TPPA +
anamnesi
infezione pregressa
posneg
ELISA,WB FTA-abs
ripetere TPPA > 15 gg
infezione recente
titolo VDRL
VDRL + / TPPA -
infezione pregressa
1:8 1:4
pos neg
infezione iniziale
falso positivo
neg
VDRL + / TPPA +
pos
INTREPRETAZIONE SIEROLOGIAVDRL TPHA IgM* DIAGNOSI
- - - No sifilide Sifilide pre-sierologica
- - + Sifilide I iniziale FTA-abs falso +
+ 1/ 8
- - Sifilide I iniziale VDRL falsa +
+ - + Sifilide I iniziale
+ + + Sifilide I-II, latente recente
+ + - Sifilide latente tardiva VDRL falsa + in sifilide pregressa
- + - Sifilide pregressa VDRL falsa – (f. prozona)
* FTA-abs, ELISA, WB
In caso di madre con sierologia positiva il siero neonatale sarà positivo per il passaggio transplacentare delle IgG materne ma non per le IgM
Gli anticorpi materni si negativizzano < 6° mese: test non treponemici < 15° mese: test treponemici La diagnosi sierologica di sifilide neonatale si basa
sulla dimostrazione delle IgMcon FTA-abs, ELISA e Western Blot (golden-standard e test di conferma)
IgM negative: assenza di infezione neonatale positivizzazione tardiva per infezione > VIII° mese ripetere test mensilmente per 3 mesi o trattare
IgM positive: infezione neonatale possibile falso positivo (Fatt. Reumatoide) conferma con WB
SIERO NEONATALE
IgG IgM
VALUTAZIONE DEL LIQUORpleiocitosi 5 cell/ccproteinorrachia 40 mg/dlVDRL + (nel 50-70% dei casi)TPPA/FTA-abs [Western Blot ]
Nelle forme recenti tutti i parametri sono alterati
Nelle forme tardive i test anticorpali possono essere l’unico parametro alterato
INTERPRETAZIONE dei test su liquor
VDRL TPPA
+ + NEUROSIFILIDE
- + Falso positivo, frequente
+ - Falso positivo, eccezionale
- - No neurosifilide
Il Treponema pallidum…..sfuggente come le Cerastes del Sahara…