Post on 02-Mar-2019
MODUL
EVALUASI KOMPONEN BIOAKTIF TANAMAN UNTUK KESEHATAN
(EVALUATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS OF PLANTS FOR HEALTH)
Oleh:
Nurheni Sri Palupi
Southeast Asian Food And Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center
Research and Community Service Institution BOGOR AGRICULTURAL UNIVERSITY
http://seafast.ipb.ac.id
DISCLAIMERThis publication is made possible by the generous support of the American
people through the United States Agency for International Development (USAID).
The contents are the responsibility of Texas A&M University and Bogor Agricultural
University as the USAID Tropical Plant Curriculum Project partners and do
not necessarily reflect the views of USAID or the United States Government.
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 1 | H a l a m a n
MODUL
Evaluasi Komponen Bioaktif Tanaman untuk Kesehatan (Evaluation of Bioactive Compounds of Plants for Health)
Nurheni Sri Palupi
Sejalan dengan meningkatnya kesadaran masyarakat akan pentingnya hidup sehat,
dan berkembangnya pemikiran back to nature maka penggunakan produk-produk alami
untuk mendukung kesehatan seseorang semakin meningkat. Penggunaan bahan-bahan
sintetis untuk pengobatan atau pencegahan terhadap suatu penyakit selain menyebabkan
ketergantungan, juga harganya relatif mahal dan kemungkinan menimbulkan bahaya
bagi kesehatan. Keadaan tersebut mendorong dilakukannya eksplorasi berbagai
komponen bioaktif asal tanaman. Berdasarkan Badan Kesehatan Dunia (WHO), hampir
sekitar 80 persen penduduk dunia menggantungkan pengobatan secara tradisional
menggunakan ekstrak utuh atau komponen bioaktifnya untuk pertolongan pertama
terhadap gangguan kesehatan. Komponen bioaktif merupakan senyawa di luar zat gizi
yang biasanya berada dalam jumlah kecil di dalam suatu bahan pangan. Senyawa tersebut
banyak dipelajari secara intensif untuk menguji khasiatnya terhadap kesehatan.
Beberapa studi epidemiologi menunjukkan bahwa mengonsumsi bahan pangan
berbahan baku tanaman dapat memberikan efek pertahanan terhadap penyakit jantung
koroner (cardiovascular disease/CVD) dan kanker. Hingga saat ini telah banyak ditemukan
senyawa bioaktif, yang dapat dikelompokkan berdasarkan struktur kimia dan fungsinya.
Senyawa fenolik yang merupakan kelompok flavonoid, banyak dijumpai hampir pada
semua tanaman dan yang telah dipelajari secara ekstensif adalah yang terkandung dalam
serealia, polong-polongan, kacang-kacangan, sayuran, buah-buahan, teh, dan sebagainya.
Banyak senyawa fenolik menunjukkan aktivitasnya sebagai antioksidan, dan beberapa
studi telah menunjukkan manfaatnya terhadap penyakit trombosis dan tumorogenesis.
Meskipun beberapa studi epidemiologi telah melaporkan manfaat perlindungan dari
senyawa flavonoid atau fenolat lain terhadap cardiovascular deaseas (CVD) dan kanker,
namun hasil penelitian lain tidak menemukan manfaat tersebut. Berbagai fitoestrogen
yang terdapat dalam kedelai, biji-bijian, buah-buahan, dan sayuran juga memiliki sifat
antioksidan. Beberapa studi baik menggunakan model hewan percobaan maupun kultur
sel kanker, menunjukkan efek menguntungkan terhadap faktor-faktor risiko CVD lainnya.
Namun, karena fitoestrogen bertindak baik sebagai agonis estrogen secara parsial
maupun antagonis, efeknya terhadap kanker cenderung kompleks. Hidroksitirosol
(hydroxytyrosol) yang merupakan salah satu senyawa fenolat dalam minyak zaitun
merupakan antioksidan kuat. Senyawa resveratrol yang ditemukan dalam kacang-
kacangan dan anggur merah, menunjukkan aktivitas antioksidan, antitrombotik, anti-
inflamasi, dan menghambat karsinogenesis. Likopen yang merupakan antioksidan
karotenoid kuat yang terkandung dalam tomat dan buah-buahan lainnya, diperkirakan
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 2 | H a l a m a n
dapat melindungi terhadap penyakit kanker prostat dan kanker lainnya, serta
menghambat pertumbuhan sel tumor pada hewan. Organosulfur senyawa dalam bawang
putih dan bawang, isotiosianat dalam sayuran, serta monoterpen dalam buah jeruk, ceri,
dan rempah-rempah memiliki aktivitas sebagai antikanker serta kardioprotektif. Singkat
kata, senyawa bioaktif banyak memiliki kontribusi yang baik terhadap kesehatan. Banyak
penelitian ilmiah perlu dilakukan sebelum kita dapat memberikan rekomendasi diet yang
berlandaskan ilmu pengetahuan. Namun demikian, mengonsumsi bahan pangan yang
banyak mengandung senyawa bioaktif terbukti dapat direkomendasikan. Dengan kata lain
dapat dianjurkan untuk mengonsumsi diet yang kaya komponen bioaktif dalam berbagai
buah-buahan, sayuran, biji-bijian, kacang-kacangan, minyak, dan kacang-kacangan.
Komponen bioaktif yang juga dikenal sebagai komponen pangan non gizi
merupakan senyawa xenobiotik yang terdapat secara alamiah dalam bahan pangan.
Selain seperti yang telah disebutkan sebelumnya, khlorofil pada daun-daunan, karotenoid
yang berwarna kuning jingga pada sayuran dan buah-buahan, antosianin yang berwarna
ungu, komponen fenolik juga merupakan senyawa bioaktif. Senyawa alamiah ini,
meskipun merupakan senyawa xenobiotik, dalam proses ekskresinya dari tubuh tidak
menghasilkan senyawa metabolit reaktif dan sering menstimulir aktivitas enzim fase 2
yang bersifat melarutkan dan antikarsinogen. Komponen bioaktif dalam proses
pencernaan akan terlepas dari matriks pangan dan dapat terserap kedalam darah, dibawa
menuju hati. Setelah sampai di hati sebagian akan mengalami metabolisme sebagian akan
terdistribusi ke sel-sel lain dalam tubuh dan menjadi tersedia (bioavailable) untuk
metabolisme di tingkat seluler. Salah satu keuntungan dari senyawa-senyawa ini adalah
sifatnya sebagai antioksidan yang dapat menangkal senyawa radikal sehingga mencegah
kerusakan sel.
Secara umum, bahan pangan baik olahan maupun segar dapat merupakan sumber
komponen bioaktif yang bermanfaat bagi tubuh. Pada dasarnya aktivitas senyawa bioaktif
yang secara fisologis mendukung kesehatan dihubungkan dengan tiga sistem regulasi di
dalam tubuh, yaitu sistem imun, sistem hormon (endokrin) dan sistem saraf. Manfaat
komponen bioaktif terhadap kesehatan dapat dievaluasi atau ditentukan dengan
melakukan pengujian-pengujian, baik secara kimia, biokimia maupun biologi. Sebagian
besar pengujian komponen bioaktif dikaitkan dengan kemampuannya sebagai
antioksidan, antikanker, antihiper-kolesterolemia, antidiabetik, antitrombosis maupun
sebagai imunomodulator. Berbagai teknik pengujian terkait dengan kemampuan
komponen bioaktif dalam mendukung kesehatan tersebut akan dibahas selanjutnya.
A. Pengujian Komponen Bioaktif Sebagai Antioksidan
1. Pengujian Aktivitas Antioksidan, metode ransimat (Metrohm, 1999)
Metode rancimat banyak digunakan dalam industri pangan terutama untuk
mendeteksi adanya kerusakan oksidatif. Beberapa komponen bahan pangan sensitif
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 3 | H a l a m a n
terhadap oksidasi, misalnya vitamin, asam amino dan asam lemak tak jenuh. Selain itu,
aktivitas senyawa fenol sebagai antioksidan yang terkandung banyak dalam tanaman,
juga dapat diuji menggunakan metode ini. Pada prinsipnya metode rancimat
menggunakan aliran udara yang dihembuskan melalui sampel pada suhu antara 50-
220oC, sehingga akan mengoksidasi asam lemak dalam beberapa tahap. Oksidasi akan
berlangsung berdasarkan reaksi radikal berantai, yang pada akhirnya akan terbentuk
produk-produk oksidasi yang bersifat mudah menguap, terutama asam formiat. Senyawa
tersebut akan ditransfer oleh aliran udara ke dalam tabung yang mengandung air
deionisasi, dan konduktivitas akan terukur. Plotting konduktivitas terhadap waktu
menghasilkan kurva oksidasi, dan titik belok dikenal sebagai periode induksi.
Sebanyak satu ml sampel ditambahkan ke dalam 10 ml minyak kedelai murni dan 3
ml tween 80 ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Setelah campuran dikocok, lalu
ditimbang 3 g dan dimasukkan ke dalam tabung ransimat untuk dianalisis menggunakan
alat ransimat pada 100oC. Metode ini menggunakan kontrol negatif minyak kedelai murni
dan kontrol positif campuran 200 ppm BHT dalam minyak kedelai murni. Alat ransimat
akan memberikan data berupa periode induksi (PI). Aktivitas antioksidan ditentukan
dengan rumus :
2. Analisis Kadar Total Fenol Metode Folin-Ciocalteu (Nantitanon et al. 2010 yang
dimodifikasi)
Pada prinsipnya total fenol dapat diukur berdasarkan kemampuan reagen Folin-
Ciocalteu (campuran fosfomolibdat dan fosfotungstat) dalam mereduksi gugus hidroksi
dari fenol. Inti aromatis pada senyawa fenol, yang berupa gugus hidroksi fenolik, dapat
mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat menjadi molibdenum yang berwarna biru.
Kandungan fenolik total dalam tumbuhan dinyatakan dalam GAE (Gallic Acid Equivalent)
yaitu jumlah kesetaraan miligram asam galat dalam 1 gram sampel.
Ekstrak pekat sampel dilarutkan dalam etanol absolut hingga diperoleh konsentrasi
akhir 0.2 mg/mL. Sebanyak 20 µL larutan ekstrak dalam etanol dicampurkan dengan 45 µL
reagen Folin-Ciocalteu dan didiamkan 3 menit. Sebanyak 135 µL Na2CO3 2 g/100 mL
ditambahkan ke dalam campuran, divorteks dan disimpan di tempat gelap pada suhu
ruang, 2 jam dan divorteks. Absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada 750
nm. Asam galat digunakan sebagai standar sehingga satuannya dinyatakan dalam mg
GAE/100 mg ekstrak. Kurva standar dibuat menggunakan asam galat (0-130 µg/ml).
Selain itu kurva standar juga bisa dipersiapkan dengan menggunakan asam tanat dalam
etanol 95% dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm.
Kadar total polifenol dihitung berdasarkan persamaan garis yang diperoleh dari
kurva standar. Absorbansi yang diperoleh diplotkan pada kurva standar. Kadar total
polifenol dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut:
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 4 | H a l a m a n
Keterangan: A = absorbansi sampel pada panjang gelombang 750 nm S = slope kemiringan pada kurva standar Fp = faktor pengenceran W = berat sampel (mg)
3. Aktivitas Antioksidan, Metode DPPH (Kubo et al. 2002 yang dimodifikasi)
Pada prinsipnya pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan mereaksikan sampel dengan radikal bebas DPPH, buffer asetat dan etanol dalam methanol sehingga terbentuk warna ungu. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil. Tingginya aktivitas antioksidan pada sampel akan ditunjukkan oleh banyaknya DPPH yang direduksi yang terlihat dengan semakin pudarnya warna ungu. Warna yang terbentuk dibaca dengan spektrofotometer pada 517 nm. Trolox digunakan sebagai standar yang merupakan analog vitamin E yang larut dalam air. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam satuan TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity).
Analisis dilakukan dengan memasukkan 1 ml buffer asetat 100 mM (pH 5.5), 1.87 ml etanol dan 0.1 ml radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3 mM dalam metanol ke dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung tersebut, divorteks dan diinkubasi pada 25oC, selama 20 menit. Sebagai kontrol digunakan 0.03 ml aquades sebagai pengganti sampel. Kemudian absorbansinya diukur pada 517 nm. Standar digunakan adalah Trolox ® (6-Hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 0; 1.25; 2.5 dan 5 mM sehingga satuannya dinyatakan dalam TEAC. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan.
B. Pengujian Komponen Bioaktif sebagai Antikanker
1. Pengujian secara in vitro
a. Persiapan media kultur dan pereaksi
Pembuatan Larutan RPMI 1640. Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI-
1640. Komposisinya dapat dilihat pada Lampiran 2. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g
dilarutkan dalam 1 liter aquabidest, kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilin-
streptomisin. Untuk kultur 90 ml RPMI-1640 ditambahkan 10 ml Fetal Bovine Serum
(FBS). Larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm.
Pembuatan MTT 0.5%. Bubuk MTT sebanyak 0.25 g dilarutkan dalam 50 ml PBS dan
diaduk hingga homogen. Larutan disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm.
Pembuatan Larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Dipipet sebanyak 23.4 μl HCl 37% (pekat)
dan ditambahkan 8.9766 ml isopropanol p.a, kemudian diaduk sampai homogen sehingga
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 5 | H a l a m a n
didapatkan larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Larutan ini harus dibuat segar setiap kali
hendak digunakan.
Pembuatan larutan Concanavalin-A. Sebanyak 1 mg Con-A dilarutkan dengan sedikit
larutan RPMI-1640, diaduk hingga rata, kemudian dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan
ditambahkan larutan RPMI-1640 hingga tanda tera. Larutan stok tersebut divorteks
hingga homogen. Larutan tersebut disterilisasi dengan menggunakan membran steril 0.20
μm . Larutan stok tersebut disimpan direfrigerator. Pada saat persiapan kultur, diambil
sebanyak 0.2 mg larutan Con-A, selanjutnya dilarutkan dalam 0.8 ml larutan RPMI-1640.
Pembuatan larutan lipopolisakarida (LPS). Sebanyak 1 mg lipopolisakarida dilarutkan
dengan sedikit larutan RPMI-1640 dan diaduk hingga rata. Selanjutnya larutan tersebut
dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan larutan RPMI-1640 hingga tanda tera.
Larutan stok tersebut divorteks hingga homogen. Larutan LPS disterilisasi dengan
menggunakan membran steril 0.20 μm . Larutan stok tersebut disimpan di refrigerator.
Pada saat persiapan kultur, diambil sebanyak 0.2 mg larutan LPS tersebut dilarutkan
dalam 0.8 ml larutan RPMI-1640.
b. Pengenceran larutan stok dan pemeliharaan kultur sel kanker
Banyak alur sel kanker yang dapat digunakan untuk pengujian, namun pada modul
ini hanya akan dijelaskan untuk sel kanker K-562, sedangkan penggunaakn sel yang lain
pada prinsipnya sama, yang perlu mendapatkan perhatian adalah penggunaan media
pertumbuhan yang tepat. Perlu diketahui bahwa setiap jenis sel memerlukan media
pertumbuhan optimum yang berbeda-beda. Misalnya sel kanker K-562 dan hibridoma
MARK-3 baik tumbuh pada media RPMI, sedangkan sel HeLa lebih cocok tumbuh pada
medium DMEM. Untuk itu maka media yang digunakan untuk pertumbuhan dan
pemeliharaan sel K-562 adalah media RPMI 1640 yang disuplementasi dengan 10% serum
anak sapi (newborn bovine serum-NBS), serum janin sapi (fetal calf serum-FCS) atau
serum janin sapi (fetal bobine serum-FBS), serta gentamycin untuk menghambat
pertumbuhan bakteri (Palupi et al. 2000).
Sel K-562 dalam keadaan beku diencerkan (thawing) dengan meletakkan ampul
berisi sel beku di dalam penangas air (waterbath) pada suhu 37oC. Setelah mencair,
dengan segera sel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus steril kemudian ditambahkan 5
ml media pencuci (PBS), selanjutnya disentrifus pada kecepatan 1000 rpm selama 5
menit. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung sentrifus yang berisi endapan sel
ditambahkan 5 ml media pertumbuhan. Suspensi sel dipindahkan ke dalam tabung kultur
berukuran 10 cm2 dengan penambahan media pertumbuhan sebanyak 10 ml. Suspensi
sel diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.
Pemeliharaan sel kanker dilakukan dengan mengganti media pertumbuhan, apabila
telah terjadi perubahan warna media (sebagai indikator terjadinya perubahan pH), dan
apabila pertumbuhan selnya sudah rapat (pengamatan menggunakan mikroskop).
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 6 | H a l a m a n
Penggantian media kultur dilakukan dengan memindahkan suspensi sel ke dalam tabung
sentrifus steril, kemudian disentrifus pada kecepatan 1000 rpm selama 5 menit.
Supernatan dibuang dan endapan sel ditambah dengan media pencuci lalu disentrifus
kembali pada kecepatan dan waktu yang sama. Supernatan dibuang dan endapan sel
ditambah 5 ml media kultur baru lalu diaduk perlahan. Suspensi sel dimasukkan ke dalam
tabung kultur dan ditambah 10 ml media pertumbuhan kemudian diinkubasi.
Pemeliharaan sel dilakukan hingga diperoleh jumlah sel yang mencukupi untuk pengujian
antiproliferasi sel kanker. Penghitungan sel kanker dilakukan dengan metode trifan biru.
c. Kultur sel
Sebanyak 850 µL media RPMI yang telah mengandung FBS 10% dimasukkan ke
dalam tiap sumur pada lempeng dengan 24 sumur. Kemudian sebanyak 50 µL suspensi
sel dimasukkan ke dalam tiap sumur, selanjutnya sebanyak 100 µL sampel dan kontrol
dimasukkan ke dalam sumur sehingga setiap sumur berisi 1000 µL. Sebagai kontrol positif
antikanker digunakan senyawa doxorubicin sebanyak 6 µL dan 94uL media standar,
sedangkan kontrol negatif digunakan media standar. Inkubasi kultur dilakukan selama tiga
hari (3x24 jam).
d. Pemanenan dan penghitungan sel dengan metode trifan biru (trypan blue)
Setelah diinkubasi selama tiga hari, suspensi sel dalam tiap sumur diaduk perlahan-
lahan dengan mikropipet hingga homogen. Kemudian sebanyak 90 L suspensi tersebut
dipipet ke dalam salah satu sumur pada lempeng 96 sumur dan ditambahkan dengan 10
L larutan trifan biru 0,4%. Lalu campuran suspensi sel dan trifan biru tersebut dikocok
hingga homogen. Larutan suspensi sel dan trifan biru tersebut kemudian diteteskan di
atas hemasitometer dan ditutup secara perlahan-lahan dengan gelas penutup hingga
semua bagian di bawah gelas penutup dipenuhi larutan tersebut.
Penghitungan sel dilakukan dengan bantuan mikroskop cahaya menggunakan
perbesaran 40X. Sel yang dihitung adalah sel berbentuk bulat yang berada dalam 25 kotak
pada bagian tengah hemasitometer. Jumlah total sel adalah jumlah seluruh sel yang
hidup dan mati. Sel yang hidup tidak akan berwarna, sedangkan sel yang mati akan
berwarna biru. Jumlah sel per ml, persen proliferasi dan antiproliferasi dihitung dengan
rumus :
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 7 | H a l a m a n
e. Pengujian aktivitas antiproliferasi, metode MTT (Kubota et al. 2003)
Pada pengujian ini menggunakan lempeng kultur dengan 96 sumur. Jumlah sel
kanker yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1.5 x 105 sel/ml dalam media RPMI
steril. Sebanyak 100µL larutan sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam sumur pada
lempeng kultur, sebanyak 50 µL suspensi sel ditambahkan ke dalam sumur dan
selanjutnya diinkubasi selama dua hari. Pada 6 jam sebelum masa inkubasi berakhir,
ditambahkan 100µl larutan MTT 0.5% (dalam PBS) ke dalam suspensi sel pada setiap
sumur lempeng mikrokultur. Pada akhir masa inkubasi, sebanyak 100µl HCl-isopropanol
0.04N ditambahkan ke dalam setiap sumur, selanjutnya absorbansi diukur menggunakan
microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Jumlah sel hidup akan proposional
dengan nilai OD hasil pembacaan. Indeks penghambatan proliferasi sel kanker K-562
dinyatakan sebagai berikut :
2. Pengujian secara in vivo
a. Persiapan hewan percobaan
Pengujian aktivitas komponen bioaktif terhadap proliferasi limfosit secara in vivo
dilakukan menggunakan mencit sebagai hewan percobaan. Mencit yang digunakan
adalah mencit berumur 30 hari dengan jumlah 5-7 ekor untuk masing-masing perlakuan.
Mencit diadaptasikan selama dua minggu. Selama masa adaptasi mencit diberi
ransum dan minuman secara ad libitum. Formulasi makanan mencit yang diberikan
menurut American Institute of Nutrition (2003). Mencit yang digunakan menpunyai berat
antara 23 gram hingga 28 gram Masing-masing dikelompokkan berdasarkan
perlakuannya. Setiap hari mencit diberi makanan, minuman standar dan dicekok ekstrak
sampel dengan dosis yang diujikan. Kelompok kontrol dicekok air minum. Setiap minggu
dilakukan pembedahan terhadap masing-masing kelompok dengan masing-masing
perlakuan. Pembedahan berfungsi untuk mengambil organ limfa dan selanjutnya dihitung
jumlah sel limfositnya.
b. Persiapan media dan pereaksi
Pembuatan larutan NH4Cl 0.85%. Bubuk NH4Cl sebanyak 0.85 g dilarutkan dalam
100 ml aquabidest dan diaduk hingga homogen. Larutan tersebut selanjutnya disterilisasi
dengan membran sterilisasi 0.20 μm.
Pembuatan Indikator Tryphane Blue 0.20%. Sebanyak 0.05 g bubuk trifan biru
dilarutkan dalam 20 ml PBS dan diaduk hingga homogen.
Pembuatan Larutan RPMI 1640. Media yang digunakan untuk kultur sel adalah
RPMI-1640. Komposisinya dapat dilihat pada Lampiran 2. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 8 | H a l a m a n
dilarutkan dalam 1 liter aquabidest, kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilin-
streptomisin. Larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm.
Pembuatan Phosphate Buffer Saline (PBS). Komposisi PBS yang digunakan dapat
dilihat pada Lampiran 3. Semua bahan tersebut dicampur dan dilarutkan dalam 500 ml
aquabidest dan diatur hingga mencapai pH 7.2. Kemudian larutan tersebut disterilisasi
dengan membran sterilisasi 0.20 μm.
c. Pembedahan dan isolasi dan penghitungan sel limfosit
Mencit diterminasi dengan cara dislokasi cervicalis dan dibedah untuk diambil
limfanya secara steril (Gambar 1). Limfa dicuci dalam RPMI-1640 steril, selanjutnya limfa
dipindahkan ke dalam cawan petri lain yang berisi 3 ml RPMI-1640 steril. Limfa tersebut
digerus sehingga didapatkan sel limfosit. Gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung
sentrifus steril 15 ml, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10
menit. Supernatan dibuang, pelet sel diberi 2 ml NH4Cl 0.85% steril untuk melisis sel-sel
darah merah selama 2 menit dan segera ditambahkan 3 ml RPMI-1640. Suspensi sel
kembali di sentrifus 3000 rpm selama 10 menit.
Gambar 1. Pengambilan organ limfa serta hati
Endapan mengandung sel limfosit, sedangkan supernatan yang berisi sel darah
merah yang telah lisis. Selanjutnya supernatan dibuang dengan menggunakan pipet
pasteur. Endapan sel limfosit dicuci kembali dengan RPMI-1640. Endapan yang sudah
dicuci, diencerkan dengan 2 ml media RPMI-1640 dan selanjutnya dihitung jumlah sel
yang hidup dengan bantuan pewarna tryphan blue serta hemasitometer. Jika 95% sel
limfositnya hidup, maka suspensi sel limfosit dapat diencerkan dengan RPMI-1640 agar
diperoleh jumlah sel (sel/ml) yang sesuai dengan yang diperlukan.
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 9 | H a l a m a n
Suspensi sel dalam media standar dihitung dengan bantuan hemasitometer.
Suspensi sel dicampur dengan tryphan blue dengan perbandingan 1: 1. Sebanyak 50 μl
campuran ditempatkan dalam hemasitometer. Penghitungan dilakukan dengan pada
perbesaran mikroskop 45 kali, sel yang hidup akan tidak berwarna sedangkan sel yang
mati terlihat biru seluruhnya. Jumlah sel yang hidup dihitung pada area 2 kotak besar (@
16 kotak kecil) lalu dihitung per ml suspensi dengan rumus:
Jumlah sel/ml = jumlah sel x fp x 104, dimana fp = 2
Sel yang terhitung merupakan proliferasi limfosit mencit secara in vivo. Sel limfosit yang
diperoleh digunakan sebagai kultur sel. Jumlah sel minimum dalam suspensi yang
digunakan untuk kultur limfosit minimal adalah 1x105 sel dengan 95% limfositnya hidup
(Tejasari et al. 2000).
C. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antihiperkolesterolemia
Pengujian senyawa bioaktif sebagai antihiperkolesterolemia dapat dilakukan dengan
mengukur total kolesterol, high density lipoprotein (HDL), trigliserida, low density
lipoprotein (LDL), penetapan indeks aterogenik, dan malonaldehida (MDA) dalam serum
darah sebagai parameternya.
1. Analisis Total Kolesterol (Metode CHOD-PAP)
Prinsip pengujian ini adalah mengoksidasi kolesterol hasil hidrolisis secara enzimatis. Hasil oksidasi tersebut menghasilkan senyawa kuinin (quinine) yang berwarna merah, sehingga dapat dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 2. Komposisi reagen kolesterol terdapat di Tabel 1. Nilai kadar kolesterol didapat dari persamaan berikut :
Kadar kolesterol (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl
Gambar 2. Prosedur Analisis Total Kolesterol.
0,01 ml serum/standar ditambah 1 ml reagen kolesterol
Dicampur
Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit
Dibaca absorbansi (A) pada λ 500 nm
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 10 | H a l a m a n
Tabel 1. Komposisi Reagen Kolesterol
Komposisi Jumlah
Good’s buffer pH 6.7 50 mmol/l Phenol 5 mmol/l 4-aminoantipyrine 0.3 mmol/l Kolesterol esterase >_ 200 U/I Kolesterol oksidase >_50 U/I Poroksidase >_ 3 kU/I Standar 200 mg/dl (5.2 mmol/l)
2. Analisis High Density Lipoprotein (HDL) (Metode CHOD-PAP)
Prinsip analisis HDL adalah dengan cara mengendapkan kilomikron, VLDL, dan LDL dengan menambahkan asam fosfotungstat dan ion Mg. Proses sentrifugasi akan memisahkan HDL dalam supernatan, yang kemudian ditentukan secara enzimatis menggunakan pereaksi DSI-cholesterol-FS. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 3. Komposisi reagen presepitasi terdapat di Tabel 2. Nilai kadar HDL didapat dari persamaan berikut :
Kadar HDL (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl
Tabel 2. Komposisi Reagen Presepitasi
Komposisi Jumlah
Asam fosfotungstat 1.4 mmol/l Magnesium klorida 8.6 mmol/l Standar kolesterol 0.3 mmol/l Standar kolesterol 200 mg/dl (5.2 mmol/l)
3. Analisis Trigliserida (Metode GPO-PAP)
Tahapan pengujian kandungan trigliserida dapat dilihat pada Gambar 3. Komposisi
reagen trigliserida yang digunakan tertera pada Tabel 3. Kadar trigliserida didapat dari
hasil perhitungan berikut :
Kadar TG (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl
4. Analisis Low Density Lipoprotein (LDL) (Friedward et al. 1972)
Setelah mendapatkan kadar total kolesterol, HDL dan TG, maka kadar LDL dapat
dihitung secara langsung menggunakan rumus :
Kadar LDL = total kolesterol – (HDL + TG/5); dengan asumsi TG/5 merupakan VLDL.
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 11 | H a l a m a n
Gambar 3. Prosedur Analisis Total HDL.
Gambar 4. Prosedur Analisis Total Trigliserida Standar.
5. Indeks Aterogenik (Balsinska 1998)
Indeks Aterogenik (IA) dihitung dengan rumus sebagai berikut :
IA = (total kolesterol – HDL)/ HDL
0,01 ml Serum/standar trigliserida ditambah 1 ml reagen trigliserida
Dicampur
Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit
Dibaca absorbansi (A) pada λ 500 nm
100 µl supernatan/standar ditambahkan 1 ml pereaksi kolesterol
Dicampur
Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit
Dibaca absorbansi (A) pada λ 500 nm
200 µl serum ditambah 500 µl reagen presipitasi
Dicampur
Diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit
Disentrifuse 4000 rpm, 10 menit
Supernatan siap dianalisis
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 12 | H a l a m a n
Tabel 3. Komposisi Reagen Trigliserida
Komposisi Jumlah
Good’s buffer pH 7.2 50 mmol/l 4-klorofenol 4 mmol/l ATP 2 mmol/l Mg 2+ 15 mmol/l glycerokinase >_ 0.4 kU/I peroksidase >_2 kU/I Lipoprotein lipase >_2 kU/I 4-Aminoantipyrine 0.5 mmol/l Glycerol-3-phosphate-oxidase >_ 0.5 kU/I Standar 200 mg/dl (2.3 mmol/l)
6. Analisis Malonaldehida (MDA) (Conti et al. 1999)
Analisis MDA ini dilakukan pada sampel organ hati dan limpa tikus. Prinsip analisis
MDA yaitu bahwa pemanasan akan menghidrolisis peroksida lipid sehingga MDA yang
terikat akan dibebaskan dan akan bereaksi dengan TBA dalam suasana asam membentuk
kompleks MDA-TBA yang berwarna merah. Intensitas warna merah tersebut dapat diukur
pada panjang gelombang 532 nm. Prosedur analisis MDA pada hati dan limpa dapat
dilihat pada Gambar 5.
Sebagai standar MDA digunakan 1,1,3,3 tetraetoksipropana (TEP). Pada suasana
asam, TEP terhidrolisis dan menghasilkan hemiasetal dan etanol. Hemiasetal yang
terbentuk kemudian terdekomposisi menjadi etanol dan malonaldehida. Penentuan kurva
standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan kadar MDA sampel
berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Konsentrasi TEP yang
digunakan yaitu 0,0; 1,2; 2,4; 3,6; 4,8; 6,0; 7,2; 15,0; dan 24,0 x10-3 pmol/ml.
D. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antidiabetes
Indeks glikemik adalah angka yang menunjukkan kemampuan suatu bahan pangan
untuk meningkatkan kadar gula darah. Dengan kata lain merupakan tingkatan suatu
bahan pangan menurut efeknya terhadap kadar glukosa darah. Dalam memilih makanan,
penderita diabetes harus memilih jenis bahan pangan sumber karbohidrat yang tidak
mudah meningkatkan kadar gula darah. Terdapat jenis karbohidrat yang cepat diserap
tubuh sehingga dapat meningkatkan kadar gula darah secara cepat, namun akan segera
merasa lapar lagi. Ada pula jenis karbohidrat yang lambat diserap, sehingga kadar
glukosa darah lebih stabil dan merasa kenyang lebih lama. Pengujian indeks glikemik
dilakukan untuk mengukur efek suatu bahan pangan yang mengandung karbohidrat
dalam meningkatkan kadar gula darah setelah dimakan, dibandingkan dengan glukosa
murni atau roti putih. Sebagai ilustrasi, bahan pangan dengan indeks glikemik tinggi
adalah bahan pangan yang cepat dicerna dan diserap sehingga dapat segera
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 13 | H a l a m a n
meningkatkan kadar gula darah secara signifikan. Sebaliknya, bahan pangan dengan
indeks glikemik yang rendah akan lambat dicerna dan diserap, sehingga peningkatan
kadar glukosa dalam darah akan terjadi secara perlahan-lahan.
Gambar 5. Prosedur Analisis MDA pada Organ Hati dan Limpa.
Namun demikian, bahan pangan yang mempunyai indeks glikemik tinggi belum
tentu akan meningkatkan kadar gula darah secara signifikan jika dikonsumsi dalam jumlah
sedikit. Untuk itu maka jumlah konsumsi karbohidrat dalam bahan pangan harus
diperhitungkan karena sangat berkonstribusi menyebabkan terjadinya perubahan kadar
gula darah. Perkiraan banyaknya suatu jenis bahan pangan dalam meningkatkan kadar
glukosa darah seseorang setelah dimakan disebut sebagai beban glikemik (glycemic load).
Untuk itu maka beban glikemik atau bobot glikemik atau glycemic load (GL) adalah
perkiraan jumlah suatu jenis bahan pangan dalam meningkatkan kadar glukosa darah
Organ hati ditimbang sebanyak 1 g
Ditambah larutan PBS dingin sebanyak 9 ml
Dihancurkan dengan cara digerus
Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit
Diambil supernatan 4 ml
Ditambah 1 ml larutan TCA 15%
Ditambah 1 ml TBA 0.37% dalam HCL 0.25 N
Dipanaskan di dalam water bath pada suhu 80 oC selama 15
menit
arutan TCA 15%
Didinginkan sampai suhu ruang
Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit
Diukur absorbansi supernatan pada λ 532 nm
Organ limpa ditimbang dan dicatat beratnya
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 14 | H a l a m a n
seseorang setelah makan makanan tersebut. Satu satuan beban glikemik kira-kira setara
dengan efek mengkonsumsi satu gram glukosa. Beban glikemik didasarkan pada indeks
glikemik (IG), untuk itu maka beban glikemik adalah jumlah gram karbohidrat yang
terdapat dalam bahan pangan dikalikan dengan indeks glikemik dibagi 100. Misalnya,
pepaya memiliki indeks glikemik tinggi, tetapi umumnya satu takaran saji pepaya adalah
satu potong sehingga tidak banyak mengandung karbohidrat, sehingga efek glikemik
makan pepaya rendah.engan kata lain maka pepaya mempunyai beban glikemik rendah.
Dengan demikian kalau indeks glikemik didefinisikan untuk tiap jenis makanan, maka
biasanya beban glikemik didefinisikan per takaran saji, atau per hari konsumsi. Dengan
konsep beban glikemik maka mudah dipahami bahwa mengonsumsi 25 gram makanan
yang memiliki IG 75 memiliki efek glikemik yang sama dengan mengkonsumsi 75 gram
makanan yang memilki IG 25.
Pada umumnya pengujian indeks glikemik suatu bahan pangan dilaksanakan dalam tiga tahapan yaitu: seleksi subjek, pengujian IG produk dan perhitungan BG produk.
1. Seleksi Subjek
Sukarelawan yang digunakan sebagai subjek pada pengujian IG harus memenuhi
kriteria wanita dan laki-laki sehat berumur 20-38 tahun, tidak menderita penyakit
penyerta, yaitu penyakit metabolisme yang berkaitan dengan kelainan kadar glukosa
darah, seperti diabetes mellitus, hipoglisemia dan hiperglisemia; memiliki indeks massa
tubuh (IMT) 18.5-24.99 kg/m2 (WHO 2006); tidak hamil dan menyusui; memiliki kadar
glukosa darah normal (kadar glukosa darah puasa kurang dari 110 mg/dL dan glukosa
darah 2 jam post prandial kurang dari 140 mg/dL (Mayfield 1998); memiliki pola respon
kadar glukosa darah selama 2 jam pengujian yang normal yaitu naik dan kemudian turun;
tidak merokok serta bersedia menjadi subjek. Sukarelawan harus mendapatkan
penjelasan sesuai naskah penjelasan untuk mendapatkan persetujuan subjek dan mengisi
formulir persetujuan setelah penjelasan (informed consent) untuk menjadi peserta
pengujian IG.
Seleksi dilakukan dengan cara wawancara, penimbangan berat dan tinggi badan
subjek serta pengujian IG glukosa murni untuk melihat respon glukosa darah subjek.
Seleksi ini dilakukan sampai diperoleh 12 subjek yang memenuhi kriteria tersebut. Tahap
seleksi subjek dan pengujian IG dilakukan di bawah pengawasan dokter dan pengambilan
darah dilakukan oleh tenaga analis kesehatan.
2. Pengujian Indeks Glikemik (IG)
Setiap sukarelawan diberikan sampel (produk pangan) yang jumlahnya setara
dengan 50 gram karbohidrat total. Kadar karbohidrat sampel diperoleh melalui analisis
proksimat (by difference). Apabila sampel yang diuji lebih dari satu, maka pengukuran
sampel diberi selang waktu setiap 2 hari untuk menstabilkan kondisi pencernaan tubuh.
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 15 | H a l a m a n
Sebagai standar dapat digunakan 50 gram glukosa bubuk yang telah dilarutkan dalam 150
ml air.
Pengukuran kadar gula darah dilakukan setelah periode puasa selama 12 jam.
Selama dua jam pasca konsumsi bahan pangan yang diuji, diambil sampel darah
sukarelawan sebanyak 0.2 µl (finger-prick capillary blood samples method) diambil setiap
selang 30 menit sekali yaitu 0 menit (kadar gula darah puasa), 30 menit, 60 menit, 90
menit, dan 120 menit. Selang dua hari, hal yang sama dilakukan dengan memberikan 50 g
glukosa murni (sebagai pangan acuan) kepada sukarelawan. Hal ini dilakukan untuk
mengurangi efek keragaman glukosa darah dari hari ke hari. Pengukuran kadar gula darah
dilakukan dengan menggunakan glukometer merk one touch ultra.
Pengambilan darah dilakukan melalui pembuluh kapiler yang terdapat di jari
tangan. Pembuluh darah kapiler dipilih karena berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh
Ragnhild et al. (2004), menunjukkan bahwa darah yang diambil dari pembuluh darah
kapiler memiliki variasi kadar glukosa darah pada panelis yang lebih kecil dibandingkan
darah yang diambil dari pembuluh vena. Glukosa darah akan bereaksi dengan enzim
glucose oxydase (GOD) dan potasium ferosianida yang terdapat pada test strip, dan
dihasilkan potasium ferosianida. Jumlah potasium ferosianida yang dihasilkan setara
dengan jumlah glukosa yang terkandung pada sampel (Arkray 2001).
Nilai kadar gula darah ini kemudian diplotkan menjadi sebuah grafik dengan sumbu
X sebagai waktu pengukuran dan sumbu Y sebagai kadar gula darah. Indeks glisemik
dihitung sebagai perbandingan antara luas kurva kenaikan kadar gula darah setelah
mengkonsumsi sampel dan glukosa sebagai standar dikalikan 100 (Haliza et al, 2006). Nilai
indeks glisemik akhir adalah nilai rata-rata dari 8 orang sukarelawan tersebut.
3. Perhitungan Beban Glisemik (BG) Produk
Beban glisemik (BG) dihitung dengan mengalikan IG produk dengan kandungan
karbohidrat tersedia atau tercerna (available carbohydrate), atau kandungan pati dalam
satu takaran saji (serving size) pangan tersebut, dibagi 100 (Foster-Powell et al. 2002).
Perhitungan BG dilakukan untuk takaran saji kue basah dan cookies sebanyak 100 g. Hal
ini dilakukan karena kue basah dan cookies yang dijual dipasaran umumnya dikemas
untuk takaran saji dengan berat kurang lebih 100 g.
E. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antitrombosis
Trombosis merupakan proses koagulasi dalam pembuluh darah yang berlebihan sehingga menyebabkan terjadinya penghambatan aliran darah, atau bahkan dapat
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 16 | H a l a m a n
menghentikannya. Trombosis dapat terjadi di mana saja dalam sirkulasi darah manusia sehingga dapat menyebabkan berbagai gangguan terhadap kesehatan.
Pengujian senyawa bioaktif sebagai antitrombosis dilakukan dengan penentuan
kandungan trombosit darah secara in vivo. Trombosit berfungsi dalam sistem pembekuan
darah, dari trombosis jaringan yang rusak akan dikeluarkan tromboplastin yang bereaksi
dengan protrombin dan kalsium membentuk trombin. Trombin akan bereaksi dengan
fibrinogen membentuk fibrin yang akan menutupi jaringan yang terluka. Keadaan ini
sering terjadi pada penderita demam berdarah dengue (DBD).
1. Persiapan sampel darah
Pada pengujian ini digunakan hewan percobaan, yaitu rattus norvegicus dari galur
Sparague Dawley berumur tiga bulan dan berjenis kelamin jantan. Tikus yang digunakan
terdiri dari tiga kelompok perlakuan, dimana masing-masing kelompok terdiri dari enam
ekor tikus. Kelompok pertama hanya diberi ransum standar tanpa pemberian sari buah
jambu biji dan berfungsi sebagai kelompok kontrol. Kelompok kedua diberi ransum
standar dan sari buah jambu biji yang tidak dipasteurisasi, sedangkan kelompok ketiga
diberi ransum standar dan sari buah jambu yang sudah dipasteurisasi. Sari buah diberikan
pada tikus dengan cara pencekokan sebanyak 3 ml untuk masing-masing tikus. Pemberian
dilakukan satu kali sehari, selama 28 hari. Proses pencekokan tikus dilakukan perlahan-
lahan untuk mencegah agar tikus tidak terluka.
Sebelum dicekok, tikus diadaptasikan terhadap kandang dan ransum yang
digunakan terlebih dahulu selama 1 minggu. Ransum yang digunakan adalah ransum
standar dengan komposisi sebagai berikut (AOAC, 1995) :
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 17 | H a l a m a n
Pada awal pengujian, diambil satu ekor tikus dari masing-masing kelompok untuk
mengetahui jumlah trombosit awal tikus. Penghitungan jumlah trombosit dilakukan di
laboratorium klinis dengan sampel darah tikus yang diambil dari bagian jantung.
Kemudian tikus yang lain diberi perlakuan selama 28 hari. Setelah 28 hari, dilakukan
pengujian jumlah trombosit darah tikus-tikus tersebut dengan sampel darah yang diambil
dari bagian jantung. Darah yang diambil harus segera dimasukkan ke dalam tabung
vacutainer yang berisi antikoagulan EDTA dan disimpan dalam wadah kedap yang diberi
pendingin untuk mencegah kerusakan darah.
2. Penghitungan jumlah trombosit (Metode QBC, Becton Dickinson, 1989)
Penghitungan kadar trombosit sampel darah dilakukan dengan metode semi
otomatis QBC (Quantitative Buffy Coat). Sampel darah ditempatkan pada tabung kapiler
yang berisi acridine orange, kalsium oksalat, agglutinating agent, dan penstabil. Tabung
ini kemudian disentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit. Komponen-
komponen pada sampel akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Sel darah merah
merupakan komponen terbesar, sekitar 35-50% dari total volume sampel. Bagian lain sel
darah, yaitu sel darah putih dan platelet atau trombosit akan membentuk lapisan
kekuningan yang disebut buffy coat dan berada diantara lapisan sel darah merah dan
plasma.
Tabung kapiler yang digunakan pada analisa ini adalah pipa kaca yang berisi
pelampung berbentuk bola yang terbuat dari plastic. Berat jenis pelampung ini
sedemikian rupa sehingga dapat mengapung diantara lapisan sel darah merah dan lapisan
plasma. Adanya pelampung ini membuat ruang antara dinding tabung kapiler dengan
dinding pelampung. Buffy coat yang terbentuk selama sentrifugasi akan terkumpul pada
ruang tersebut, sehingga panjang lapisannya menjadi 10 kali lebih panjang dari semula.
Perpanjangan ukuran lapisan ini dimaksudkan agar buffy coat lebih mudah untuk
dianalisa dan diukur.
Pereaksi yang ada di dalam tabung akan menyebabkan tiap lapisan menampilkan
warna yang berbeda pada saat dianalisa dengan QBC Autoread. Acridine orange akan
diserap oleh nukleoprotein, sehingga akan menimbulkan warna pada saat terkena cahaya
ultraviolet. QBC Autoreader akan menguji intensitas warna yang dihasilkan oleh DNA dan
RNA atau lipoprotein. Perbedaan intensitas warna digunakan untuk mendeteksi
perbedaan antar sel pada buffy coat. Berdasarkan persamaan intensitas warna tersebut,
jumlah sel tiap komponen lapisan buffy coat dapat dihitung. Platelet atau trombosit
mempunyai intensitas warna yang lebih rendah dibandingkan dengan komponen sel
darah lain pada lapisan buffy. Jumlah trombosit dinyatakan dalam jumlah sel/μl darah
(Becton Dickinson, 1989). Perbedaan lapisan pada tabung kapiler setelah disentrifuse
dapat dilihat pada Gambar 6.
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 18 | H a l a m a n
F. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Imunomodulator
Imunomodulator adalah kemampuan untuk meningkatkan sistem imun. Beberapa senyawa yang dapat berperan sebagai imunomodulator antara lain karbohidrat, terpenoid, steroid, flavonoid, glikoprotein, alkaloid dan beberapa senyawa organik lain yang mengandung nitrogen. Pengujian senyawa bioaktif sebagai imunomodulator dapat dilakukan melalui mekanisme peningkatan proliferasi sel-sel dalam sistem imun, khususnya sel limfosit pada manusia. Adapun tahapan pengujiannya meliputi: (1) persiapan media kultur sel; (2) isolasi sel limfosit; (3) penghitungan jumlah sel limfosit; dan (3) pengujian proliferasi sel limfosit.
Gambar 6. Fraksi darah dalam tabung kapiler setelah sentrifugasi (Becton Dickinson, 1989).
1. Persiapan media kultur sel
Bahan yang digunakan sebagai media kultur sel berupa RPMI-1640 yang telah diperkaya dengan glutamin 10mM. Larutan RPMI standar dibuat dengan melarutkan RPMI dalam bentuk bubuk sebanyak 16.2g ke dalam 1L akuabides. Selanjutnya ditambahkan 2 g HaHCO3 sebagai bufer dan 10 mL penisilin-streptomisin (1%) sebagai antibiotik untuk mencega terjadinya kontaminasi. Apabila media standar tersebut akan digunakan sebagai media perttumbuhan sel diperlukan penambahan 10% serum yang dapatberupa serum darah AB manusia atau fetal calf serum (FCS), atau fetal bovine serum (FBS). Akhirnya larutan tersebut disterilkan menggunakan membran steril 0.22um.
Serum darah AB dapat diperoleh dari seorang donor darah sehat yang mempunyai golongan darah AB. Pengambilan darah dilakukan oleh tenaga medis dengan
Sel darah merah
Sel darah merah sekitar float
Granulosit
Limfosit dan monosit
Trombosit
Plasma
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 19 | H a l a m a n
menggunakan jarum precisionglideTM steril sekali pakai dan telah dihubungkan dengan vacutainer. Darah yang diperoleh selanjutnya disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 30 menit, kemudian serum dipisahkan dari endapan sel-sel darah menggunakan mikropipet. Serum yang diperoleh kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 56oC selama 30 menit dan selanjutnya disterilisasi dengan melewatkan melalui membran steril berukuran 0.22 um. Apabila digunakan FCS atau FBS dapat dibeli atau dipesan melalui agen atau toko bahan kimia.
2. Isolasi sel limfosit
Limfosit dapat diisolasi dari darah manusia. Darah diambil secara aseptis menggunakan syringe dan jarum butterfly nomor 23 sekali pakai yang telah dihubungkan dengan vacutainer yang telah berisi antikoagulan EDTA. Isolasi sel limfosit dari darah dilakukan di laboratorium dengan memisahkan dari komponen seluler menggunakan sentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Komponen seluler darah berupa eritrosit yang lebih berat dan berwarna merah akan berada pada bagian bawah, sedangkan serum darah yang berwarna kuning akan terpisah pada bagian atas. Kedua bagian tersebut dipisahkan oleh lapisan tipis yang disebut buffy coat, yang kaya akan sel limfosit.
Sebanyak 2 ml lapisan buffy coat dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 3 ml larutan ficoll-hystopaque (densitas 1.77 ± 0.001 g/ml) secara perlahan-lahan melalui dinding tabung sampai terbentuk dua lapisan. Selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit sehingga akan terpisah dua lapisan. Lapisan bagian atas yang mempunyai densitas lebih rendah dari larutan ficoll histopaque terdiri dari sel darah putih yang tidak bergranula atau agranulosit, seperti limfosit dan monosit. Sedangkan lapisan bagian bawah yang mempunyai densitas lebih tinggi terdiri dari sel darah merah dan sel lain yang bergranula atau granulosit. Lapisan bagian atas yang menyerupai cincin putih yang berisi sel limfosit kemudian diambil secara perlahan-lahan menggunakan mikropipet dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus. Selanjutnya disentrifugasi dengan menambahkan larutan RPMI standar dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit dan dilakukan sebanyak dua kali. Supernatan kemudian dibuang dan sel disuspensikan dalam larutan RPMI standar untuk dilakukan penghitungan jumlah sel sebelum sel limfosit digunakan untuk pengujian.
3. Penghitungan jumlah sel limfosit
Untuk mengetahui adanya perubahan jumlah sel selama pengujian, maka terlebih
dahulu harus dilakukan penghitungan jumlah sel limfosit awal. Penghitungan dapat
dilakukan menggunakan pewarna trifan biru dengan perbandingan suspensi sel dan
pewarna trifan biru sebesar 1:1. Sebanyak 50 µL pewarna trifan biru ditambahkan ke
dalam 50 µL suspensi sel di dalam sumur pada lempeng mikrokultur dan diaduk perlahan.
Sejumlah kecil suspensi sel dan pewarna diletakkan di hemasitometer (Gambar 7) dan
diamati di bawah mikroskop pada perbesaran 400x.
Sel limfosit yang hidup berwarna terang dan berbentuk bulat, sedangkan sel mati
berwarna biru dan berkeriput. Selain itu, sel yang hidup akan berukuran relatif lebih besar
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 20 | H a l a m a n
dibandingan dengan yang mati. Jumlah sel yang hidup dan mati dihitung minimal dalam
dua bidang pandang. Penghitungan sel hendaknya dilakukan dalam waktu tidak lebih dari
tiga menit untuk mencegah terjadinya penyerapan warna oleh sel hidup. Pewarna trifan
biru mempunyai afinitas yang kuat terhadap DNA sel. Jumlah sel dalam setiap mililiter
suspensi ditentukan sebagai berikut :
N = jumlah sel/ml V = jumlah sel hidup atau mati rata-rata per bidang pandang F = faktor pengenceran (2 yang diperoleh akibat penambahan trifan biru 1:1) 104 = volume 1 bidang pandang pada hemasitometer 1 mm3 = 10-4 ml
Gambar 7. Bidang pandang hemasitometer di bawah mikroskop
4. Pengujian proliferasi sel limfosit
Sebelum digunakan untuk pengujian harus dipastikan bahwa viabilitas sel harus
sebesar 95%. Sebanyak 80 uL suspensi sel (2x106 sel/ml) dalam media lengkap
dimasukkan ke dalam sumur lempeng mikrokultur, kemudian masing-masing
ditambahkan 20uL larutan ekstrak sampel yang mengandung komponen bioaktif. Selain
itu sel limfosit juga dikultur dengan 20uL lipopolisakarida (LPS) dan pokeweed (PKW) pada
konsentrasi 50ug/mL (mitogen) sebagai kontrol positif. Sebagai kontrol negatif (standar),
suspensi limfosit juga dikultur dalam media RPMI standar, tanpa mitogen. Semua
perlakuan dan kontrol masing-masing dibuat tiga ulangan dan masing-masing dibuat
catatan pemetaan perlakuannya. Selanjutnya lempeng mikrokultur diinkubasi dalam
inkubator pada suhu 37oC, dengan atmosfer yang mengandung CO2 5%, O2 95% dan RH
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 21 | H a l a m a n
96%, selama 3x24 jam (dapat bervariasi berdasarkan aktivitas komponen bioaktif
berdasarkan referensi penelitian terdahulu).
Enam jam sebelum inkubasi berakhir, ditambahkan 10uL pereaksi garam tetrazolium
(MTT) 5% ke dalam masing-masing sumur lempeng mikrokultur secara aseptis. Larutan
MTT 5% dibuat dengan cara melarutkan 0.25g bubuk MTT ke dalam 50 ml PBS dan diaduk
hingga homogen, kemudian disterilisasi dengan membran steril 0.22 um. Selanjunya
lempeng mikrokultur diinkubasi kembali sampai akhir masa inkubasi 3x24 jam. Setelah
masa inkubasi berakhir, ke dalam setiap sumur lempeng mikrokultur ditambah 80 μl HCl-
isopropanol 0,04N. Larutan HCl-isopropanol 0,04N dibuat dengan cara menambahkan
sebanyak 23.4 uL HCl 37% ke dalam 8.97 uL isopopanol PA. Selanjutnya dilakukan
pengukuran absorbansi setiap sumur lempeng mikrokultur menggunakan ELISA reader
pada panjang gelombang 570 nm. Nilai OD (absorbansi) hasil pembacaan bersifat
proporsional terhadap jumlah sel hidup. Indeks Stimulasi (IS) dihitung dengan
menggunakan persamaan berikut:
Referensi:
[AIN] American Institute of Nutrition. 1993. Components of the AIN-93 diets as improvements in the AIN-76 Diet. Journal of Nutrition 127 (5): 838S-841S.
[AOAC] Association of Official Analytical and Chemist. 1995. Official Methods of Analysis of AOAC International 16th edition. Airlington, Virginia.
Arkray. 2001. Instruction Manual for Glucometer. Arkray Corp. Kyoto, Japan.
Balasinska B. 1998. Hypocholesterolemic effect of food dietary evening primerose (Oenothera paradoxa) cake extract in rats. Food Chemistry 63(4):453-459.
Becton Dickinson. 1989. QBC Manual. Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes.
Conti M, Moramd PC, Levillain P, and Lemmonier A. 1999. Improve Fluorometric Determinant of Malonaldehyde. Am J Clin Nutr 53: 314-321.
Foster-Powell K, Holt SHA, Brand-Miller JC. 2002. International table of glycemic index and glycemic load values. Am J of Clin Nutr 76:5-56.
Tropical Plants Curriculum
Nurheni Sri Palupi 22 | H a l a m a n
Friedward WT, Levy RJ, Fredricken DS. 1972. Estimation of HDL-c in the plasma without the use of preparative ultracentrifige. Clin. Chem 18:449.
Haliza W, Purwani E Y, Yuliani S. 2006. Evaluasi Kadar Pati Tahan Cerna dan Nilai Indeks Glikemik Mi Sagu. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. 17:149-152.
Kubo I, Masuoka N, Xiao P, Haraguchi H. 2002. Antioxidant activity of deodecyl gallate. J Agric Food Chem 50:3533-3539.
Kubota T, Egawa T, Otani Y, Furukawa T, Saikawa Y, Yoshida M, Watanabe M, Kumai K, dan Kitajima M. 2003. Cancer chemoteraphy chemosensitivity testing is useful in evaluating the appropiate adjuvant cancer chemoteraphy for stages iii/iv gastric cancers without peritoneal dissemination. Anticancer Res 23(1B): 583-587.
Mayfield J. 1998. Diagnosis and classification of diabetes mellitus: new criteria. Am Fam Physician 58:1355-62, 1369-70.
Nantitanon W, Yotsawimonwat S, Okogoni S. 2010. Factors influencing antioxidant activities and total phenolic content of guava leaf extract. LWT-Food Science and Technology XXX:1-9.
Palupi NS, Franck P, Guimont C, Linden G, Dumas D, Stoltz J, Belleville-nabet F, Nabet P
and and Dousset B. 2000. Bovine -lactoglobulin receptors on transformed mammalian cell (hybridomas Mark-3): characterization by flow cytometry. J Biotechnol 78:171-184.
Tejasari, Zakaria FR, dan Sajuthi D. 2002. Aktivitas Stimulasi Komponen Bioaktif Rimpang Jahe (Zingiber officinale Roscoe) pada Sel Limfosit B Manusia Secara In Vitro. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. XIII(1) : 47-52.