Post on 02-Feb-2016
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EL ANALISIS MOLECULAR DEL DNA HA SIDO POSIBLE EL ANALISIS MOLECULAR DEL DNA HA SIDO POSIBLE MEDIANTE EL CLONADO DE DNAMEDIANTE EL CLONADO DE DNA
TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES
mRNA DNAmRNA DNA
cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido
((doble cadena metilado)doble cadena metilado)
DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE
INTRDUCCION EN CELULA HUESPEDINTRDUCCION EN CELULA HUESPED
LIBRARY (Screening-subclonado)LIBRARY (Screening-subclonado)
VECTORESVECTORES
Construidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturalesConstruidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturales
CaracteristicasCaracteristicas
1) REPLICON ESTABLE 1) REPLICON ESTABLE : : Posee secuencias que permiten su Posee secuencias que permiten su propagaciónpropagación
2) MCS: (multiple cloning site) 2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios únicos para varias ERclonar- Posee sitios únicos para varias ER
3) MARCADORES DE SELECCIÓN: 3) MARCADORES DE SELECCIÓN: Confieren propiedades Confieren propiedades fenótípicas a la célula huesped.fenótípicas a la célula huesped.
TIPOS DE TIPOS DE VECTORESVECTORES
1) VECTORES DE CLONADO- 1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de Aislamiento de fragmentos de DNADNA
2) VECTORES DE EXPRESION- 2) VECTORES DE EXPRESION- Expresión de genes clonadosExpresión de genes clonados
3) VECTORES ESPECIALES- 3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génicasecuencias regulatorias de la expresión génica
TIPOS DE VECTORES DE CLONADOTIPOS DE VECTORES DE CLONADO
PLASMIDOSPLASMIDOS: : Límite clonado 0.1- 10 KbLímite clonado 0.1- 10 Kb
FAGOSFAGOS: : Derivados del bacteriófago Lambda, 8-25 KbDerivados del bacteriófago Lambda, 8-25 Kb
COSMIDOSCOSMIDOS: : Combinación fago Combinación fago y plásmido, 35-50 Kby plásmido, 35-50 Kb
BACBAC (Bacterial Artificial Chromosomes) (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plásmido F, 75-300 Kb Derivados plásmido F, 75-300 Kb
Vectores derivados de Vectores derivados de Bacteriofago P1Bacteriofago P1 , 100 Kb , 100 Kb
YACYAC (Yeast artificial Chromosome) (Yeast artificial Chromosome) cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kbcromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb
PLASMIDOSPLASMIDOS
Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb)
FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOSFUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS
Resistencia a antibióticos Resistencia a antibióticos
Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)
Producción de toxinas (ej E.coli enterotoxinas)Producción de toxinas (ej E.coli enterotoxinas)
Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)
Inducción de tumores (plantas)Inducción de tumores (plantas)
Sistemas de Restricción-modificaciónSistemas de Restricción-modificación
Producción de antibióticos (ej Streptomyces)Producción de antibióticos (ej Streptomyces)
Resistencia a metales pesadosResistencia a metales pesados
CLASIFICACÓN DE PLASMIDOSCLASIFICACÓN DE PLASMIDOS
Nº DE COPIAS: Nº DE COPIAS: Alto o bajo Nº de copias.Alto o bajo Nº de copias.
El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación
30 Replicones diferentes30 Replicones diferentes
Bajo Nº de copias:1-5 copias Bajo Nº de copias:1-5 copias
Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)
CONJUGATIVOS O NOCONJUGATIVOS O NO
GRUPO DE COMPATIBILIDADGRUPO DE COMPATIBILIDAD
REPLICACION ColE1REPLICACION ColE1
REPLICACION pMB1 o ColE1 : REPLICACION pMB1 o ColE1 :
plásmidos multicopia 30 copias plásmidos multicopia 30 copias
-500 -400 -300 -200 -100 ori 100 200 300 400 500 600
rop rop gengen
RNAIRNAI
Rop proteina (63 aminoácidos)Rop proteina (63 aminoácidos)
RNAasa HRNAasa H
RNAII
Dirección de Dirección de DNA replicaciónDNA replicación
RNA I
RNAII primer
ori
Clivaje por RNAasa H
RNAII primer
ori
Clivaje por RNAasa H
-555 -265 -20REPLICACION
Rop
NO REPLICACION
Grupos de compatibilidadGrupos de compatibilidad
Grupo de compatibilidadGrupo de compatibilidad: set de plásmidos cuyos miembros son : set de plásmidos cuyos miembros son capaces de coexistir en la misma bacteriacapaces de coexistir en la misma bacteria
Plásmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados uno Plásmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados uno del otro en algún aspecto que es esencial para su mantenimiento: ori del otro en algún aspecto que es esencial para su mantenimiento: ori de replicación y/o sistema de segregaciónde replicación y/o sistema de segregación
Sistema de segregación: proteínas que permiten la segregación de Sistema de segregación: proteínas que permiten la segregación de los plásmidos en las células hijaslos plásmidos en las células hijas
PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADOPLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO
CARACTERISTICASCARACTERISTICAS
1) ORI (derivados de ColE1)1) ORI (derivados de ColE1)
2) POLILINKER (MCS)2) POLILINKER (MCS)
3) MARCADORES DE SELECCIÓN3) MARCADORES DE SELECCIÓN
4) SECUENCIAS PARA SCREENING: 4) SECUENCIAS PARA SCREENING: GalactosidasaGalactosidasa
MARCADORES DE SELECCIONMARCADORES DE SELECCION
Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :
- Marcadores de resistencia a antibioticos- Marcadores de resistencia a antibioticos
- Marcadores de auxotrofía (permiten S! de un componente - Marcadores de auxotrofía (permiten S! de un componente esencial ej aminoácidos)esencial ej aminoácidos)
Antibioticos, ej: Antibioticos, ej:
Ampicilina , Tetraciclina , Kanamicina, ZeocinaAmpicilina , Tetraciclina , Kanamicina, Zeocina
Ampicilina: Ampicilina: Interfiere con síntesis de pared bacterianaInterfiere con síntesis de pared bacterianaResistencia:Resistencia: gen gen bla bla lactamasalactamasa
Tetraciclina: Tetraciclina: Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad ribosomal 30sribosomal 30sResistencia:Resistencia: gen gen tet tet proteína proteína que se une a membrana que se une a membrana bacteriana y impide transporte del antibióticobacteriana y impide transporte del antibiótico
Kanamicina: Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNAmRNAResistencia:Resistencia: gen gen kan kan aminoglicosido fosfo transferasa aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibiotico modifica el antibiotico
Zeocina: Zeocina: Se intercala al DNA gen Se intercala al DNA gen zeo zeo proteína que proteína que se une a antibiotico y evita su unión al DNA se une a antibiotico y evita su unión al DNA
pBR322
pUC19
FAGOS FILAMENTOSOSFAGOS FILAMENTOSOS
Trasformación
CLONADO EN PLASMIDOSCLONADO EN PLASMIDOS
DIGESTION ER : DIGESTION ER : Plásmido y DNA a clonarPlásmido y DNA a clonar
LIGACION LIGACION (in vitro, ligasa)(in vitro, ligasa)
TRANSFORMACION TRANSFORMACION ( bacterias competentes)( bacterias competentes)
SELECCIÓNSELECCIÓN
SCREENINGSCREENING
TRANSFORMACION Y SELECCIONTRANSFORMACION Y SELECCION
TRANSFORMACION
Bacterias competentes:
Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc
Eficiencia:107 cel/g DNA
Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos )
Ef: 108cel/g DNA
SELECCIÓN
Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico
SCREENINGSCREENING
ScreeningScreening :
para detectar la mólecula de plásmido que posee insertopara detectar la mólecula de plásmido que posee inserto
galactodiasa (no es concluyente)galactodiasa (no es concluyente)
Mapeo de restricción Mapeo de restricción
PCR (colony PCR)PCR (colony PCR)
Hibridización in situ en la colonia con sonda Hibridización in situ en la colonia con sonda específicaespecífica
LIBRARYLIBRARY
TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES
mRNA DNAmRNA DNA
cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido
((doble cadena metilado)doble cadena metilado)
DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE
INTRDUCCION EN CELULA HUESPEDINTRDUCCION EN CELULA HUESPED
LIBRARYLIBRARY cDNA o genómicacDNA o genómica
Screening y subclonado
Fago
Formación de placa de lisis
Selección
1) CI lisogenia
CI lisis
Cepas hfl - No proteasa degrada CII S! CI
lisogenia . Fagos CI forman placas de lisis en cepas hfl-
2) red gam (genes involucrados en recombinación )
fenotipo Spi+ (sensible a interferencia P2)
red-gam- fenotipo Spi- ,
replican en cepas lisogenas P2(rec+).
Preparación de flibrary en fago
1
2
Screening library en fago
Library de expresion
Screening
VECTOR ZAP
SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1ER CADENA
5´cap
mRNA
Transcriptasa reversa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAAAAA(A)nA 3´
oligodT (12-18) primer
AAAAAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
cDNA:mRNA
SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1ER CADENA
5´cap
mRNA
Transcriptasa reversa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAAAAA(A)nA 3´
AAAAAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
cDNA:mRNA
Random primers
SINTESIS DE cDNA SINTESIS 2ª CADENA
AAAAAA(A)nA
cDNA:mRNA
RNAasa H + DNA pol
dNTPs
cDNA doble cadena
1)
AAAA mRNA
RToligodT
TTTTT AAAA
degrad. RNA
TTTTT
Transferasa TerminaldCTP TTTT
Klenow poldNTPs- oligoG
AAAAA
TTTTTT
CCCC
GGGGGCCCCC
cDNA Sintesis Transferasa terminal
2)
En este caso el clonado permitido es NO direccionado.
Si en síntesis de la primera cadena de cDNA se usa un oligo T con secuencia para ER1 y luego al cDNA se unen los adaptadores con sitio para ER2 , al cortar con las dos enzimas se podrá clonar direccionalmente.