Post on 12-Jul-2020
Diagnóstico molecular de doenças hematológicas
Profa Elvira Shinohara
2010
Parte I
Hemoglobinopatias
Profa Dra Elvira Maria Guerra Shinohara
Mutação de ponto
HbS → variante da HbA
Posição 6 cadeia beta globina
HbA → HbS
Glu ValGAG GTG
(-) (neutro)
pI 3,2 pI 5,9
Profa Dra Elvira Maria Guerra Shinohara
Cotran, Kumar, Collins - Robbins Pathologic Basis of Disease, 1999
Fisiopatologia da anemia falciforme
Profa Dra Elvira Maria Guerra Shinohara
Alterações morfológicas presentes no sangue de um paciente
com anemia falciforme
Cotran, Kumar, Collins - Robbins Pathologic Basis of Disease, 1999
Profa Dra Elvira Maria Guerra Shinohara
HbC
HbC → variante da HbA
Posição 6 cadeia beta globina
HbA → HbC
Glu LisGAG AAG
(-) (+)
Profa Dra Elvira Maria Guerra Shinohara
Eletroforese em pH alcalino
AA AC AS AA AS F
(RN)
Parte II
Alteração no metabolismo do ferro
Andrews NC. N Engl J Med 1999;341:1986–1995 Reproduzido com permissão. © 1999 Massachusetts Medical Society. Todos os direitos reservados.
Ferro da dieta
Utilização Utilização
Duodeno
(média: 1 a 2 mg
por dia)
Músculos
(mioglobina)
(300 mg)
Fígado
(1,000 mg)
Medula
óssea
(300 mg)Hemáceas
circulantes
(hemoglobina)
(1.800 mg)
Macrófagos
Retículo-endoteliais
(600 mg)
Descamação das células mucosas
Descamação/Menstruação
Outras perdas de sangue
(média: 1 a 2 mg por dia)
Estoque
de ferro
Transferrina
plasmática
(3 mg)
Perda de ferro
Distribuição do Ferro
Hemocromatose hereditária
Sobrecarga de ferro primária
Fisiopatologia: aumento da absorção do ferro
Hemocromatose hereditária
Mutações de ponto no gene HFE
HFE C282Y (ou G845A)
substituição de cisteína pela tirosina na posição 282
a proteína HFE não é expressa na membrana da célula
HFE H63D (ou C187G)
substituição da histidina por ácido aspártico na posição 63
HFE S65C
substituição de serina por na posição 65
Hemocromatose hereditária
HFE controla a entrada de ferro ligada à transferrina para dentro da célula
HFE mutante não é capaz de se ligar ao TRf
A diminuição de ferro na célula leva a um sinal falso para que mais ferro seja absorvido
Hemocromatose hereditária
Pietrangelo, 2004
← 111 pb
250 pb �
140 pb �
Polimorfismo HFE C282Y
CC CY YY
Polimorfismo HFE H63D
225 pb
126 pb99 pb
62 pb
DD HH HH HD HD
Polimorfismo HFE S65C
202 pb
136 pb
79 pb
SC SS
Parte III
TROMBOSE VENOSA PROFUNDATVP
HemostasiaDeve haver equilíbrio entre:
� Formação do coágulo
� Dissolução do coágulo
Hemorragia TromboseVaso sanguíneo
PlaquetasFatores de coagulação
Vaso sanguíneoPlaquetasInibidores
Sistema fibrinolíticoFluxo sanguíneo
Formação do coágulo Prevenção da formação de coágulo de maneira disseminada
Incidência de trombose venosa
• Trombose venosa e ou embolismo pulmonar é uma desordem comum com incidência anual de
117 casos em 100.000 pessoas
• Essa incidência AUMENTA COM A IDADE
• Em gestantes: 1 caso em 1.000 – 20.000 gestações (National
Institutes of Health Consensus Development Conference, 1986)
Tromboembolismo pulmonar - TEP
Grande êmbolo derivado de uma trombose venosa de membros inferiores e agora impactada num ramo da artéria pulmonar
Mitchell in Bases Patológicas das doenças – Robbins & Cotran Patologia, 2005
Trombose
• Arterial Alto fluxo sanguíneo, agregados plaquetários e fibrina
Trombo não-oclusivo, pode formar as placas ateroscleróticas
• VenosaRegiões de fluxo sanguíneo lento (estase), compostos de eritrócitos, leucócitos, plaquetas e fibrina
Tende obstruir a circulação (oclusivo)
Tríade de Virchow
Fisiopatologia da trombose
• Alterações na parede do vaso
• Alterações no fluxo sanguíneo
• Alterações na coagulabilidade do sangue
(hipercoagulabilidade)
alteração nas concentrações de fatores de coagulação
função plaquetária
alteração no sistema fibrinolítico
Mutações em genes (Fator V, protrombina, fibrinogenio, etc)
Célula endotelial
Alteração no fluxo sanguíneo
• Estase (trombose venosa)
Imobilização por longo tempo, sedentarismo, obesidade, imobilização após cirurgias
• Hiperviscosidade em decorrência da Policitemia Vera (trombose venosa)
• Turbulência do fluxo sanguíneo (trombose arterial)
Hipercoagulabilidade
• Aumento da concentração
fibrinogênio, PAI-1, VIII, IX, X
• Diminuição da concentração
Anti-trombina, proteína C, proteína S, trombomodulina, plasminogênio
Condições em que há alterações nas concentrações de fatores de coagulação e dos inibidores
Aumento das [ ] dos fatores
Diminuição das [ ] dos fatores
Estresse I
Inflamação I
Gravidez I, VIII, IX, X XIII, XI, AT-III
Contraceptivos orais I, VIII, VII, IX, X
Hipermetabolismo
(hipertireoidismo)
I, VIII, plasminogênio
Infarto do miocadio I, VIII
Exercícios vigorosos VIII, XI, XII
Procedimentos cirúrgicos
I, VIII
Trauma I, VIII
Necrose tecidual I
Trombocitopenia crônica
VIII
Hipotireiodismo IX, XI, plasminogênio
Trombofilia
Termo utilizado para descrever a tendência hereditária de desenvolver trombose
• Deficiência de anti-trombina (ATIII)• Deficiência de proteína C• Deficiência de proteína S• Resistência a proteína C ativada (APC), mutação no fator V (fator V de
Leiden)• Mutação no gene da protrombina (FII G20210A)• Mutação MTHFR C677T• Mutações em genes de enzimas (MTHFR A1298C, MTR A2756G, MTRR
A66G) ou de transportadores de folato (RFC1 A80G) e de vitamina B12 (TC2 C776G) associados ao metabolismo da homocisteína
• Mutações no gene do fibrinogênio• Mutações no gene do PAI-1• Mutações em outros genes
Frequências de de trombofilias em indivíduos saudáveis e em paciente com trombose venosa
Trombofilias Indivíduos saudáveis Pacientes
Fator V Leiden 4,8% 40%
FII G20210A 2,7% 16%
Deficiência de Proteína C 0,3% 4,8%
Deficiência de Proteína S 0,19% 4,3%
Deficiência de ATIII 0,02% 4,3%
Fonte: Willians Hematology, 2007
Fatores adquiridos associados a trombose
• Dano tecidual (cirurgia, fratura, queimaduras)
• Repouso ou imobilização no leito prolongados
• Neoplasias
• Gravidez
• Uso de estrógeno (anticoncepcionais ou terapia de reposição hormonal)
• Anticorpos anti-fosfolípides
• Obesidade (estase)
• Hiperhomocisteinemia (deficiências nutricionais de ácido fólico e B12)
• Hiperviscosidade (Policitemia Vera)
• Hemoglobinúria Paroxística Noturna (HPN)
• Infarto do miocardio
• Fibrilação atrial
• Próteses (válvulas cardíacas)
Fatores de risco adquiridos relacionados a hipercoagulabilidade
• Idade avançada – susceptibilidade aumentada de agregação
plaquetária e liberação de PGI2 reduzida pelo endotélio
• Tabagismo
Interação entre fatores genéticos e estímulos adquiridos estão associados ao estado de hipercoagulabilidade
uma ou mais mutações
pró-trombóticas (interação gene-gene)
Estímulo(s) pró-trombótico(s) adquirido(s)
TROMBOSE
Eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo dos produtos de restrição enzimática com HaeIII da região de mutação A2756G
do gene Metionina sintase (MTR)
AG AA GG AG AA AG AA
421
289
132
82
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% corado com nitrato de prata dos produtos de restrição enzimática com MboII da região de mutação A1298C do gene da MTHFR
Papel do fator V
• Na cascata de coagulação
• Ação dos inibidores fisiológicos da coagulação
Cotran, Kumar e Collins, Robins Pathologic – Basis of Disease, 2005
FORMAÇÃO DO COÁGULO
CONTROLE DO PROCESSO DE COAGULAÇÃO
(células endoteliais ÍNTEGRAS)
Cotran, Kumar e Collins, Robins Pathologic – Basis of Disease, 2005
Fator V
• Proteína Ca cliva o FV em três pontos: Arg306, Arg506 e Arg679
Várias mutações foram descritas:
• Arg506Gln (FV Leiden)
• Arg306Thr (FV Cambridge)
• Arg306Gly (FV Hong Kong)
• Outras mutações
Mutações no gene do Fator V
Fator V Leiden (FVL), mutação G1691A
• Acarreta a substituição de uma arginina por uma glutamina na posição 506 (R506Q) do fator V
• O Fator Leiden é resistente à clivagem pela proteína C ativada
• Estudos cinéticos mostraram que a variante mutada do fator V (Leiden) é inativada mais lentamente (10 X) do que a variante selvagem
Freqüência do fator V de Leiden (FVL) em indivíduos saudáveis (% de heterozigotos)
• Rara em africanos e orientais (0,05%) (Willians Hematology, 2007)
• No mundo, 4,8% dos caucasianos saudáveis (Willians Hematology, 2007)
• 11 a 14% dos indivíduos na Suécia (Willians Hematology, 2007)
• No Brasil:
• 2,0% em Campinas (Arruda et al, 1995)
• 1,6% em mulheres saudáveis em Ribeirão Preto (Souza et al, 1999)
• 2,2% em São Paulo (Rodrigues et al., 2004)
• 1,1% no estado de MG (Sabino et al, 2006)
Fator V de Leiden
• 60 a 80 % dos pacientes com história familiar de trombose venosa profunda ( TVP) apresentam a mutação Leiden
• Estudo brasileiro com 42 pacientes portadores de trombose venosa cerebral e 134 indivíduos saudáveis
FVL foi encontrada em 4,8% dos pacientes e em 2,2% do grupo controle (Rodrigues et al, J Thromb Haemost , 2004)
BRATROS (Brazilian Thrombosis Study)FCM Ribeirão, FCM Botucatu, FCM UNIFESP
434 Pacientes com trombose venosa e 434 controles saudáveis
Mutações Pacientes ControlesFVL 10,1% 2,3%
FII G20210A 6,2% 0,9%
TC2 C776G 64,3% 62,7%
MTHFR C677T 57,6% 56,7%
MTHFR A1298C 46,3% 42,4%
CBS 844ins68 24,6% 23,7%
Pereira et al, Thrombosis Research, 2007
Mutação G20210A no gene FII (protrombina)
• Essa mutação está localizada na região não traduzida 3’ do gene FII e está associada com concentrações aumentadas de protrombina
• Essa mutação foi descrita em 7% dos pacientes com TVP
(Rosendaal et al, 1997)
• Portador da mutação C20210A tem risco três vezes maior de TVP comparado ao indivíduo com genótipo homozigoto selvagem
• Estudo brasileiro com 42 pacientes portadores de trombose venosa cerebral e 134 indivíduos saudáveis
Mutação G20210G foi encontrada em 16,7% dos pacientes e em 0,7% do grupo controle (Rodrigues et al, J Thromb Haemost , 2004)
Freqüência da mutação G20210A no gene FII em indivíduos saudáveis
(% de heterozigotos)
• Rara em africanos e orientais (0,06%)
• No mundo, 2,0% dos indivíduos saudáveis são heterozigotos para essa mutação (Rosendaal et al, 1998)
• No Brasil:
• 0,7% em São Paulo (Rodrigues et al, 2004)
• 1,0% em mulheres saudáveis em Ribeirão Preto (Souza et al, 1999)
• 3,6% % em MG (Sabino et al, 2006)
BRATROS (Brazilian Thrombosis Study)FCM Ribeirão, FCM Botucatu, FCM UNIFESP
434 Pacientes com trombose venosa e 434 controles saudáveis
Mutações Pacientes ControlesFVL 10,1% 2,3%
FII G20210A 6,2% 0,9%TC2 C776G 64,3% 62,7%
MTHFR C677T 57,6% 56,7%
MTHFR A1298C 46,3% 42,4%
CBS 844ins68 24,6% 23,7%
Pereira et al, Thrombosis Research, 2007
Mutação C677T no gene da metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR)
• Alelo T (genótipos CT e TT)
↓ concentrações de folato
↑ concentrações de homocisteína total
Alelo T foi associado ao maior risco de ter trombose venosa
BRATROS (Brazilian Thrombosis Study)FCM Ribeirão, FCM Botucatu, FCM UNIFESP
434 Pacientes com trombose venosa e 434 controles saudáveis
Mutações Pacientes ControlesFVL 10,1% 2,3%
FII G20210A 6,2% 0,9%
TC2 C776G 64,3% 62,7%
MTHFR C677T 57,6% 56,7%MTHFR A1298C 46,3% 42,4%
CBS 844ins68 24,6% 23,7%
Pereira et al, Thrombosis Research, 2007
Eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo dos produtos de restrição enzimática com HinfI da região de mutação C677T do gene MTHFR
Molécula do Fibrinogênio
Cadeias:
αααα, ββββ e γγγγ
Fatores associados com o aumento das concentrações de fibrinogênio
• Idade
• Índice de massa corpórea
• Estresse
• Inflamação crônica
• Sedentarismo
• Hipertensão arterial
• Diabetes melitus
• Infecções
• Tabagismo
• Mutações nos genes das cadeias: α, β e γ
Wu, Int J Clin Lab Res, 1997
Fibrinogênio e trombose
Mutações nos genes das cadeias
• α : Thr312Ala (Rasmussen-Torvik et al, Thrombosis Research, 2007)
• β : G455A (Weng et al., Thromb Haesmost, 1999)
G845A (Ferdinand et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999)
C148T (Deloughery, Current Opinion in Lipidology, 1999)
• γ : C10034T (Grunbacher et al, Thrombosis Research, 2007)
Consequências dessas mutações• Aumento das concentrações de fibrinogênio e/ou
• Alteração na estrutura da molécula (disfibrinogenemias) com comprometimento na fibrinólise e/ou
• Aumento da afinidade ao fator XIII
Fatores que influenciam no aumento das concentrações do inibidor do ativador tecidual do plasminogênio (PAI-1)
AUMENTO DAS CONCENTRAÇÕES PAI-1 = diminuição da fibrinólise
• Tabagismo• Índice de massa corpórea• Concentrações elevadas de triglicérides • Concentrações de elevadas de TNF-α (Scarpati et al, J Biol Chem, 1989)
Mutação 4G/5G na região promotora do gene do PAI-1
• PAI-1 (inibidor do ativador tecidual do plasminogênio)
• alta freqüência de genótipo PAI 4G/4G em gestantes com história de TVP quando comparadas as mulheres do grupo controle (Vora et al, 2007)
Parte IV
Leucemias
Leucemias
• São neoplasias de medula óssea (MO)
• Caracterizada pelo aumento da proliferação de células hemopoéticas neoplásicas na MO (hiperplasia), substituindo as normais
• Podem apresentar alterações de diferenciação (displasia)
• Em algumas leucemias há a parada de maturação celular (anaplasia), aparecendo os BLASTOS
• Pode ocorrer citopenias de outras linhagens na MO e sangue periférico devido a infiltração da MO por estas células neoplásicas
As formas clínicas de manifestação são agrupadas em leucemias agudas e crônicas
Principais tipos de leucemias� Leucemia Mielóide Aguda
� Leucemia Mielóide Crônica
� Leucemia Linfóide Aguda
� Leucemia Linfóide Crônica
Tipos de anomalias genéticas que levam à doença hematopoética maligna
Fonte: Hoffbrand e cols – Fundamentos em Hematologia, 2004.
LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
LEUCEMIAS MIELÓIDES CRÔNICAS
• Caracteriza-se por proliferação de células mielóides granulocíticas que mantém sua capacidade de diferenciação
• É doença de origem clonal, surgindo em decorrência de anomalia da Stem Cell da medula óssea
• O clone anômalo se expande e infiltra o parênquima medular de modo lento, progressivo, em detrimento da proliferação das células normais
LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
• Incidência: 1 a 2 casos por 100.000 habitantes/ano
• A LMC com Ph+ é responsável por ∼ 15% das leucemias em adultos
• Faixa preferencial entre 45 a 55 anos, porem pode ocorrer, mais raramente, em idosos, crianças e adolescentes
• Ocorre em ambos os sexos
(relação masculino/feminino =1,4/1)
LMC
Foi a primeira neoplasia descrita relacionada consistentemente com uma anormalidade
genética adquirida
Etiopatogenia da LMC
• 90% dos casos de LMC apresentam anomalia cromossômica, translocação t(9, 22), cromossomo Philadelphia (Ph).
• Várias situações poderiam levar a essa alteração cromossômica:1- radiações (raios X, radiação atômica)2- Intoxicação por drogas (benzeno)3- Infecção por virus
A translocação t(9, 22) dá origem a um cromossomo 9 atípico, denominado 9q +, e um cromossomo 22 também atípico, 22q-, denominado cromossomo Ph (Philadelphia)
Gene quimérico BCR-ABL resultante codifica uma proteína de fusão de tamanho 210kD, com atividade de tirosina-quinase excessiva
Cromossomo Philadelphia - Ph
Nowell e Hungerford descreveram o cromossomo Ph em 1960, quando descreveram que esta anomalia cromossômica era peculiar de LMC
Em 1973, Rowley descreveu que o Ph era fruto da translocação equilibrada entre os cromossomos 9 e 22
Década de 80 foi possível verificar que este rearranjo cromossômico proporcionava a translocação do gene ABL, localizado no cromossomo 9, para o BCR, no cromossomo 22, produzindo uma proteína quimérica, BCR/ABL, com atividade tirosina quinase aumentada, super-expressa nas células de pacientes com LMC
CROMOSSOMO PHILADELPHIACROMOSSOMO PHILADELPHIA
Translocação recíproca (9;22)
9 22 Ph1
CROMOSSOMO PHILADELPHIACROMOSSOMO PHILADELPHIA
Proteína de fusão BCR/ABL
Translocação t(9,22)
Hooffbrand e cols, 2001
Dois novos genes
Cromossomo 22 q- (cromossomo Philadelfia – Ph) bcr-abl
Cromossomo 9q+ abl-bcr
Gene abl-bcr é ativo, porem não está associado na etiologia da LMC
Dependendo do ponto de quebra no BCR, o produto de fusão pode ser:
• M-BCR (major), é o mais comum na LMC, expresso com 210 kD, p210 BCR-ABL
• m-BCR (minor) que codifica a p190 BCR-ABL , ocorre em 2/3 das leucemias linfóides agudas e menos frequente na LMC
• µBCR (micro), codifica a p230 BCR-ABL , o mais raro e observado na leucemia neutrofílica crônica (LNC)
Gene híbrido BCR-ABL
• Codifica uma proteína citoplasmática de atividade tirosina quinase, responsável pelo surgimento da leucemia
Papel da proteína de fusão
Estudos in vitro e in vivo em camundongos transgênicos e de transferência de genes mediadas por retrovírus para células hematopoéticas de murinos mostram que a expressão de BCR/ABL leva às manifestações clínicas da LMC, incluindo a progressão para crise blástica.
Estes resultados revelam a função do BCR/ABL e sua proteína de fusão como mediador central da proliferação mielóide e da transformação.
ADESÃOALTERADA
ATIVAÇÃOPROLIFERAÇÃO
INIBIÇÃO DA APOPTOSE
FENÓTIPOMALIGNO
BCR-ABLBCR-ABL
FENÓTIPO MALIGNO
Deininger et al, Blood: 96: 3343-3356, 2000.
EritróideMielóidePlaquetasLinfóide(B e T)Stem cell
Desenvolvimentoclonal
Diferenciação
InstabilidadeGenômica Fusão bcr/abl
t(9;22)
AnormalidadesCitogenéticasadicionais
Fase pré-leucêmica- Ph negativa Fase crônica - Ph positiva Crise blástica
+Ph+8; +19;i(17q)
Anti-apoptose??
FISIOPATOLOGIA E PROGRESSÃO
�� Fase crFase crôônica (3 a 5 anos) nica (3 a 5 anos) –– ANTES DO IMANITIBEANTES DO IMANITIBE
-- expansexpansãão predominante da so predominante da séérie granulocrie granulocííticatica
-- leucocitose (100 a 300.000/mmleucocitose (100 a 300.000/mm33) e ) e linfocitopenialinfocitopenia
-- hiperplasia mielhiperplasia mielóóide e cide e céélulas maduraslulas maduras
-- cromossomo Philadelphia (citogencromossomo Philadelphia (citogenéética)tica)
-- fosfatase alcalina diminufosfatase alcalina diminuíídada
PROGRESSÃO DA LMC
�� Fase aceleradaFase acelerada
-- anemiaanemia
-- trombocitopeniatrombocitopenia
-- basofilia e eosinofiliabasofilia e eosinofilia
-- blastos no sangue perifblastos no sangue periféérico de 15% a 19%rico de 15% a 19%
-- 30% promiel30% promielóócitoscitos
-- evoluevoluçãção clonal (30% casos)o clonal (30% casos)
PROGRESSÃO DA LMC
�� Fase blFase bláásticastica
- ≥ 20% de blastos20% de blastos leucleucêêmicos na M.O. micos na M.O.
-- anemia acentuadaanemia acentuada
-- trombocitopeniatrombocitopenia
-- leucocitoseleucocitose
-- fenfenóótipo linftipo linfóóide (20ide (20--30%), miel30%), mielóóide (50ide (50--60%) e indiferenciada 60%) e indiferenciada
(~10 a 15%)(~10 a 15%)
-- evoluevoluçãção clonal (80% casos)o clonal (80% casos)
-- NNãão responde ao tratamentoo responde ao tratamento
PROGRESSÃO DA LMC
Características clínicas gerais da LMC
Sintomas:
• Relativos a hipermetabolismo (perda de peso, anorexia, e sudorese noturna)
• Esplenomegalia
• Anemia, dispnéia e taquicardia (fase acelerada)
• Equimoses, epistaxe, menorragia e hemorragia em decorrência da função anormal das plaquetas
• Gota e insuficiência renal causadas pela hiperuricemia pelo catabolismo excessivo de purina podem ser problemas.
• Distúrbios visuais e priapismo
A doença evolui de forma lenta, porem progressiva
Achados laboratoriais da LMC
Sangue periférico
• Número de leucócitos: ↑ 100.000/ul (75% dos pacientes)
• Suspeita de LMC: > 25.000/ul
• Aumento de basófilos e eosinófilos
• Trombocitose: +/- 50% dos paciente (1.000.000 de plaquetas/ul)
• Plaquetas bizarras e micromegacariócitos
• Morfologia pseudo Pelger-Huet (acentua após quimioterapia)
• Na LMC pode haver maior porcentagem de mielócitos (20%) do que
• metamielócitos e bastontes (desvio à esquerda NÃO escalonado)
• Fosfatase alcalina dos neutrófilos é BAIXA
Medula ósseaHipercelular, Relação G/E: 20:1 ou maior
Monitoramento da LMC
• Citogenética
• FISH
• RT-PCR qualitativo e quantitativo
• Mutações do ABL
Citogenética
• Antes do tratamento
Ph negativo pior prognóstico, não responde aos inibidores de tirosinoquinases
• Após tratamento
• Remissão molecular = desaparecimento da alteração molecular
• Procura de outras alterações cromossômicas = pior prognóstico
FISH BCR/ABL ES - VYSISFISH BCR/ABL ES - VYSIS
BCR-ABLES
PCR quantitativo
• Evolução do tratamento da doença
• Detecção da doença residual mínima após tratamento
• Sinais de resistência ao tratamento (mutações)
Sensibilidades das diversas técnicas utilizadas para detecção do cromossomo Ph e da BCR-ABL:
• Determinação do cariótipo, sensibilidade de 1/ 20 a 25
• Hibridação in situ por fluorescência - FISH (Fluorescence in situ
hybridization) detecta o gene de fusão bcr-abl em amostras de sangue periférico e de medula óssea com sensibilidade de 1/250
• Reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa (RT-PCR) detecta o rearranjo BCR-ABL em amostras de sangue periférico e medula óssea com sensibilidade de 1/105 a 1/106
Com estas técnicas, cerca de 1 a 5% dos casos de LMC são Ph negativos
� Quimioterápicos: hidroxiuréia
� Interferon-alfa e infusão de linfócitos (imunoterapia)
� Transplante de medula óssea (CURA)
� Inibidores de Tirosinaquinase:
- Mesilato de Imatinibe (Glivec®, STI-571, Novartis)
- Dasatinibe (Sprycel®, BMS-354825, Bristol Myers Squibb), aprovado para uso no Brasil. Segunda escolha quando há resistência ao Imatinibe. Capaz de inibir mais de 50 formas de mutação
- Nilotinibe (Tasigna®, AMN107, Novartis), aprovado EUA, foi submetido à aprovação da ANVISA, expectativa de ser lançado no Brasil em 2008
TRATAMENTO
Mesilato de Imatinibe
• O imatinibe ocupa o receptor de ATP no domínio abl quinase isto previne a fosforilação do substrato e a sinalização
• A ausência de sinalização inibe a proliferação e a sobrevida das células
• Efetiva no controle hematológico (redução do número de leucócitos, redução do tamanho do baço)
• Resposta citogénetica significativa mesmo na fase acelerada e blástica
MESILATO DE IMATINIBE
Monitorização das mutações
• Não é realizado pesquisa de mutações antes do tratamento com o imatinibe e naqueles que respondem a esse medicamento
• Foram descritas cerca de 50 mutações
• É útil naqueles pacientes em recidiva citogenética ou aumento significativo do PCR quantitativo na vigência do imatinibe
• T315I: novos inibidores de tirosina quinases (dasatinibe e nilotinibe) não funcionam. Inibidores Aurora quinase (estudos MK0457 da Merck)
• Y253H, E255V: melhor dasatinibe do que nilotinibe
• Outras mutações ou ausência de mutações: outros inibidores de tirosina quinases
LEUCEMIAS AGUDASLEUCEMIAS AGUDAS
HÁ DOIS GRUPOS DE LEUCEMIAS AGUDAS:
MIELÓIDES AGUDAS (LMA) - com 8 sub-tipos
80% dos casos ocorrem em adultos
LINFÓIDES AGUDAS (LLA) - com 3 sub-tipos
80% dos casos ocorrem em crianças
AMBAS RESULTAM DO ACÚMULO DE CÉLULAS BLÁSTICAS (MIELÓIDE OU LINFÓIDE) NA MEDULA ÓSSEA, SANGUE, LINFONODOS E OUTROS TECIDOS
Leucemia mielóide aguda - LMA
A parada de maturação pode ocorrer em qualquer etapa da granulopoese, eritropoese
ou plaquetopoese
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Células com aspectos variados (desde blastos até mais céulas mais diferenciadas)
BLASTOS NA MEDULA ÓSSEA > 20%
EstEst áágio de Diferenciagio de Diferencia çãção das LMAo das LMA
CLASSIFICAÇÃO DAS LMA (s)
Classificação MIC das LMA (s)
MIC (morfológica, imunológica e citogenética)
Classificação EGIL das LMA (s)
• LMA pouco diferenciada –M0
• LMA tipo mielomonocítica: blastos positivos com monoclonais CD13, CD33, CDw65 e/ou CD117 e anti-MPO
• LMA com linhagem eritróide – M6, de tipos imaturo e maduro (antiglicoforina A+)
• LMA de linhagem megacariocítica – M7: blastos positivos com CD41 e/ou CD61
• LMA-TdT positiva
• LMA com expressão antigênica linfóide
EGIL (European Group for the Immulogical Characterization of Leukemias)
CLASSIFICAÇÃO DAS LMA SEGUNDO A OMS
Categoria Freqüência Aproximada
� Leucemia Mielóide Aguda com Anormalidades Genéticas Recorrentes
• LMA com t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO)
5 - 12%
• LMA com eosinófilos anormais na m.o. e inv(16)(p13q22) ou t16;16)(p13;q22) (CBFβ/MYH11)
10 - 12%
• Leucemia Promielocítica Aguda com t(15;17)(q22;q12) (PML/RARα) e variantes
5 - 8%
• LMA com anormalidades 11q23 (MLL)
5 - 6%
� Leucemia Mielóide Aguda com displasia multilinhagem
� Leucemia Mielóide Aguda e Síndromes Mielodisplásicas, relacionadas à terapêutica
� Leucemia Mielóide Aguda não categorizada nos itens anteriores
LMA com Anormalidades Citogenéticas Recorrentes
CategoriaCategoria Gene de fusGene de fusããoo
LMA com t(8;21)(q22;q22)LMA com t(8;21)(q22;q22) AML1/ETOAML1/ETO
LMA com inv(16)(p13q22) ou LMA com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22)t(16;16)(p13;q22)
CBFCBFββ/MYH11/MYH11
Leucemia PromielocLeucemia Promielocíítica Agudatica Agudat(15;17)(q22;q12)t(15;17)(q22;q12)
PML/RARPML/RARαααααααα e e variantesvariantes
LMA com anormalidades 11q23LMA com anormalidades 11q23 MLLMLL
LMA com t(8;21)(q22;q22)
Epidemiologia
• 5 -12% das LMAs
• ~ 30% LMAs com maturação e anormalidades citogenéticas
• Predomina em jovens
Peculiaridades clínicas
• Sarcomas granulocíticos são comuns
• A detecção do gene de fusão AML1/ETO faz o diagnóstico mesmo se <20% de blastos na M.O.
LMA com t(8;21)(q22;q22)
Abundante citoplasma basofAbundante citoplasma basofíílicolico
Grandes grGrandes grâânulos nulos (pseudo Chediak(pseudo Chediak--Higahi)Higahi)
Auer Auer éé comumcomum
LMA com t(8;21)(q22;q22)LMA com t(8;21)(q22;q22)
M.O. Sangue
Leucemia Mielóide Aguda com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22)
Epidemiologia
• 10-12% dos casos de LMA
• Acomete todas as idades, mas predomina em jovens
Peculiaridade Clínica
• Maior frequência de sarcomas granulocíticos
Aspecto monocitAspecto monocitóóideide
EosinEosinóófilos anormaisfilos anormais
Leucemia MielLeucemia Mielóóide Aguda com ide Aguda com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22)inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22)
LMA com inv(16)(p13q22)LMA com inv(16)(p13q22)DiferenciaDiferenciaçãção Mielo/Monocito Mielo/Monocitááriaria
Translocação t(15;17) (q22;q12) estáassociada LMA – M3
� É encontrada em pacientes com LMA tipo M3.
� O gene PML (promyelocitic leukemia) no cromossomo 15 funde-se com gene α do receptor de ácido retinóico (RARα), no cromossomo 17.
Pontos de clivagem BCR (breakpoint cluster region) 1, 2 ou 3. Consequência hátrês fusões diferentes de mRNAs, (chamadas longa (L), variável (v) e curta (S).
Translocação t(15;17) (q22;q12) estáassociada LMA – M3
� A proteína resultante da fusão PML- RARα atua como repressor da transcrição, enquanto que RARα normal (tipo selvagem) é um ativador.
� Proteína PML forma homodímeros com ela mesma, enquanto que a proteína RAR α forma heterodímeros com a proteína X do receptor retinóide, RXR.
� A proteína de fusão PML- RARαααα liga-se á PML e à RXR, evitando que elas se liguem com seus pares habituais.
Consequência: Parada de diferenciação celular
Translocação t(15;17) (q22;q12) estáassociada LMA – M3
� Pacientes com LMA –tipo M3 associados a t(15;17) respondem ao tratamento com altas doses de ácido trans-retinóico (ATRA)
� O uso de ATRA causa uma leucocitose, devido a maturação de um grande número de células leucêmicas
LMA com anormalidades do 11q23
Epidemiologia
• 5- 6% das LMAs
• Ocorrem em todas as idades, mas predominam na infância
• 2 grupos distintos
– Lactentes
– Associada a quimioterapia prévia (inibidores da topoisomerase II)
Anormalidades Citogenéticas do Lactente
Emerenciano M et al., 2006
Peculiaridades clínicas
• Infiltração tecidual
• Associação com CIVD
Citomorfológico
• Diferenciação monocítica ou mielomonocítica
LMA com anormalidades do 11q23
M5aM5a
LMA com anormalidades do 11q23LMA com anormalidades do 11q23
M5aM5a
LMA com anormalidades do 11q23LMA com anormalidades do 11q23
M5bM5b
LMA com anormalidades do 11q23LMA com anormalidades do 11q23
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS COMUNS NAS LEUCEMIAS AGUDAS
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS COMUNS NAS LEUCEMIAS AGUDAS
♦ Anemia →→→→ fraqueza, cansaço e palidez
♦ Neutropenia →→→→ infecções bacterianas e fúngicas
♦ Linfocitopenia →→→→ infecções virais
♦ Plaquetopenia →→→→ sangramentos
♦ Alteração metabólica →→→→ perda de peso e sudoração
♦ Superpopulação celular →→→→ massas tumorais