Bioremediacja gleb z ropy i jejproduktów

Joanna Nowak

absolwentka Wydzia³u Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa

Bioremediation of soil contaminated with petroleum products

S u m m a r y

Bioremediation is a process by which microoorganisms degrade or trans-form the environmental contaminants into less toxic forms. A wide variety ofbacterial and fungal genera are known to be capable of degrading, and in manycases, completely mineralizing chemical substances present in petroleum prod-ucts at present. Three types of bioremediation are predominant in the industry:natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation. Selecting the mostappropriate strategy to treat a specific site can be quided by considering threebasic principles: the amenability of the pollutant to biological transformation toless toxic products, the accessibility of contaminant to microorganisms(bioavailabilty) and the opportunity for optimization of biological activity. Mi-crobial activity is affected by a range of environmental factors, including nutri-ents, moisture content, pH, temperature, and oxygen concentration. Differentaspects of bacterial degradation of petroleum contaminants in soil and how toimprove the efficiency and reproducibility are discussed in this review.

Key words:

bioremediation, biostimulation, bioaugmentation, attenuation, bioavailability,polycyclic aromatic hydrocarbons, petroleum derivatives.

1. Wprowadzenie

Od kilkunastu lat praktycznie we wszystkich uprzemys³owio-nych krajach œwiata istnieje problem ska¿enia gruntów rop¹ naf-tow¹ i jej produktami. Zanieczyszczenia te dostaj¹ siê do glebg³ównie w wyniku procesów wydobywczych ropy i jej przerobuw rafineriach oraz awarii podczas magazynowania paliw. W Polscesilnie ska¿one s¹ tereny by³ych baz i poligonów poradzieckich,

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Joanna Nowak,ul. Sikorskiego 1/31,05-101 Nowy DwórMazowiecki.

1 (80) 97–108 2008

gdzie wylewano niegdyœ zu¿yte oleje i smary oraz grunty w pobli¿u rafinerii, stacjibenzynowych, warsztatów naprawczych taboru samochodowo-kolejowego, lotnisk(1,2).

Niektóre wêglowodory aromatyczne wystêpuj¹ce w ropie (benzen, toluen, ksy-len, fenol) s¹ bardzo szkodliwe dla cz³owieka, ze wzglêdu na toksyczne i kancero-genne dzia³anie (3,4). Zwi¹zki te charakteryzuj¹ siê bardzo du¿¹ rozpuszczalnoœci¹w wodzie, w zwi¹zku z czym ³atwo przedostaj¹ siê do wód podziemnych, a nastêp-nie do ujêæ wodnych. Zanieczyszczenie gleb produktami ropopochodnymi wp³ywaniekorzystnie na produkcjê roœlinn¹ oraz na jakoœæ wód powierzchniowych i pod-ziemnych (5).

W artykule przedstawiony zostanie aktualny stan wiedzy na temat zastosowaniabioremediacji do oczyszczania gruntów z produktów ropopochodnych. W tej sto-sunkowo nowej technologii wykorzystuje siê szlaki i cykle metaboliczne mikroorga-nizmów do redukcji zanieczyszczeñ lub ich transformacji w formy mniej szkodliwe(6-8).

2. Czynniki warunkuj¹ce efektywnoœæ procesów bioremediacyjnych

Efektywnoœæ bioremediacji gruntów z ropy i jej pochodnych zale¿y od temparozk³adu tych zanieczyszczeñ przez mikroorganizmy glebowe, na które maj¹ wp³ywtakie czynniki jak: budowa chemiczna, stê¿enie wêglowodorów i ich toksycznoœæw stosunku do mikroflory, mikrobiologiczny potencja³ gleby (stê¿enie biomasy, ró¿-norodnoœæ populacji, aktywnoœæ enzymów), fizykochemiczne parametry œrodowiska(m.in. odczyn, temperatura, zawartoœæ materii organicznej, wilgotnoœæ) oraz do-stêpnoœæ wêglowodorów dla komórek mikroorganizmów (1,6,9).

Minimalna liczebnoœæ mikroorganizmów w glebie ska¿onej produktami ropopo-chodnymi konieczna dla efektywnej biorekultywacji wynosi ponad 105 komórek/gs.m. gruntu (1). W powierzchniowych warstwach gleby, zawieraj¹cych odpowiednistosunek C:N:P wystêpuje od 107 do 109 komórek/g gruntu, z tego od 0,1 do 1,0%stanowi¹ organizmy zdolne do rozk³adu substancji ropopochodnych. W glebachska¿onych produktami ropopochodnymi liczba bakterii mo¿e zwiêkszyæ siê od 100do 1000 razy (5).

Wiêkszoœæ metod biologicznego oczyszczania zaolejonych gruntów oparta jestna intensyfikacji procesu poprzez zastosowanie odpowiednio dobranych i przygoto-wanych zespo³ów wspó³dzia³aj¹cych ze sob¹ mikroorganizmów – biocenoz lub kon-sorcjów mikroorganizmów, wyspecjalizowanych w rozk³adzie wêglowodorów naf-towych. Biocenozy te, zwane biopreparatami, zawieraj¹ specjalnie wyselekcjonowa-ne ze œrodowiska naturalnego okreœlone gatunki drobnoustrojów. Wprowadzane s¹do gleb jako zaszczepy biologiczne (inokulum) zawieraj¹ce ok. 109 komórek/cm3.Takie biopreparaty znacznie wspomagaj¹, a niekiedy warunkuj¹, biodegradacjê za-nieczyszczeñ (10).

Joanna Nowak

98 PRACE PRZEGL¥DOWE

W³aœciwoœci i cechy œrodowiska w przewa¿aj¹cym stopniu decyduj¹ o mo¿liwoœ-ci przeprowadzenia bioremediacji in situ na danym terenie, bowiem wp³ywaj¹ na mi-krobiologiczn¹ aktywnoœæ (np. temperatura, wilgotnoœæ) oraz transport (g³ównieprzez dyfuzjê) zanieczyszczeñ do wnêtrza komórek drobnoustrojów (np. zawartoœæi jakoœæ materii organicznej). W tabeli 1 przedstawiono g³ówne czynniki œrodowiskawp³ywaj¹ce na bioremediacjê gleb z produktów ropopochodnych.

T a b e l a 1

G³ówne czynniki œrodowiska wp³ywaj¹ce na bioremediacjê gleb z produktów ropopochodnych

Czynnikiœrodowiska

Znaczenie w bioremediacjiZabiegi zwiêkszaj¹ce efek-

tywnoϾ bioremediacjiLiteratura

pierwiastkibiogenne

azot i fosfor wystêpuj¹ w glebie czêsto w iloœciach limituj¹cychwzrost mikroorganizmów; substancje ropopochodne powoduj¹niekorzystny dla metabolizmu bakterii wzrost stosunku wêgla doazotu

wzbogacanie gleby po¿ywka-mi zawieraj¹cymi azot i fos-for

(1,25)

wilgotnoœæ woda umo¿liwia rozpuszczenie wêglowodorów (w takiej formies¹ ³atwiej pobierane przez mikroorganizmy) oraz zmniejsza ad-sorpcjê s³abo rozpuszczalnych WWA do powierzchni cz¹stek mi-neralnych gleby

zraszanie gleby wod¹ lub wpro-wadzanie wody do gruntu

(1,50)

temperatura wp³ywa na intensywnoœæ biodegradacji oraz rozpuszczalnoœæ ali-fatycznych i wielopierœcieniowych aromatycznych wêglowodorów,a tym samym ich biodostêpnoœæ

regulacja temperatury w bio-reaktorze; kompostowanie

(51,52)

pH produkty ropopochodne mog¹ powodowaæ obni¿enie odczynugleby (podczas degradacji wêglowodorów powstaj¹ kwasy)

wapnowanie gleby w celuzwiêkszenia pH

(1)

tlen dostêpnoœæ tlenu w glebie mo¿e byæ ograniczona w wyniku s³abejprzepuszczalnoœci gruntu lub obecnoœci ³atwo rozk³adalnychzwi¹zków pokarmowych; produkty ropopochodne czêsto powo-duj¹ powstanie w glebie rozleg³ych stref beztlenowych

wprowadzanie tlenu w g³¹bgruntu lub oranie gleby

(25,28)

dostêpnoœæakceptoraelektronów

obecnoœæ akceptora elektronów jest niezbêdna w procesie roz-k³adu wêglowodorów ropopochodnych w warunkach beztleno-wych

wprowadzanie do gleby akcep-torów elektronów, np. azota-nów, siarczanów

(49)

Dostêpnoœæ wêglowodorów naftowych dla komórek mikroorganizmów (biodo-stêpnoœæ) zale¿y od ró¿nych czynników fizycznych, chemicznych i mikrobiologicz-nych, które wp³ywaj¹ zarówno na transport tych zwi¹zków, jak i migracjê mikroor-ganizmów w glebie. S³abo rozpuszczalne wêglowodory alifatyczne i aromatycznez czterema i wiêksz¹ liczb¹ pierœcieni ³atwo ulegaj¹ adsorpcji na ziarnach gruntu(11). Istotn¹ rolê w kierowaniu bakterii w stronê wêglowodorów naftowych (i in-nych zanieczyszczeñ), które uleg³y sorpcji na cz¹stkach gleby odgrywa chemotaksja(12-14). Do cz¹stek gleby, g³ównie materii organicznej i frakcji gliny (posiadaj¹ do-brze rozwiniêt¹ i ujemnie na³adowan¹ powierzchniê), mog¹ równie¿ zostaæ zwi¹-zane mikroorganizmy o hydrofobowych os³onach komórkowych (15,16).

Bioremediacja gleb z ropy i jej produktów

BIOTECHNOLOGIA 1 (80) 97-108 2008 99

Najlepsz¹ metod¹ poprawienia transportu wêglowodorów naftowych do komó-rek mikroorganizmów i ich biodostêpnoœci jest u¿ycie œrodków powierzchniowoczynnych (SPC), które obni¿aj¹ napiêcie powierzchniowe i interfazowe cieczy orazemulguj¹ substancje lipofilowe powoduj¹c zwiêkszenie powierzchni wymiany i roz-puszczalnoœci (17-19).

Liczne mikroorganizmy degraduj¹ce wêglowodory naftowe produkuj¹ œrodki po-wierzchniowo czynne, zaœ w literaturze przedmiotu mo¿na znaleŸæ wiele prac do-tycz¹cych efektywnoœci biologicznych SPC w remediacji gleb zanieczyszczonych ro-p¹ naftow¹ (17,20). W sprzeda¿y dostêpne s¹ równie¿ ró¿nego rodzaju syntetyczneœrodki powierzchniowo czynne, jednak wiele z nich ma ograniczone zastosowaniew bioremediacji, poniewa¿ s¹ zbyt ³atwo degradowane przez mikroorganizmy lubdzia³aj¹ toksycznie na ich komórki. Korzystniejsze jest wprowadzanie do zanie-czyszczonych gruntów biologicznych SPC ze wzglêdu na ich biodegradowalnoœæw œrodowisku i nisk¹ toksycznoœæ. Jednak wysokie koszty ich produkcji sprawiaj¹,¿e powszechniej wykorzystuje siê syntetyczne SPC. Prowadzone s¹ badania maj¹cena celu skonstruowanie rekombinowanych mikroorganizmów zdolnych do rozk³aduwêglowodorów naftowych i produkuj¹cych œrodki powierzchniowo czynne (19,21).

Prawid³owy przebieg procesu biodegradacji mo¿e prowadziæ do prawie 100% re-dukcji zanieczyszczeñ w ci¹gu zaledwie kilku tygodni. Obecnie usuniêcie z gruntówlekkich takich zanieczyszczeñ jak paliwo Diesla, benzyna, nafta lotnicza nie stanowi¿adnej kwestii. Problem pojawia siê w przypadku bioremediacji gleb (w szczególno-œci ciê¿kich) z czystej ropy lub frakcji ciê¿kich (22).

Szybkoœæ rozk³adu ró¿norodnych produktów ropopochodnych w powierzchnio-wych warstwach gruntów zachodzi z prêdkoœci¹ od 0,02 do ponad 0,4 g/kg grun-tu/dobê, œrednio od 0,09 do 0,14 g/kg gruntu/dobê. W g³êbszych warstwach gruntuszybkoœæ degradacji maleje z powodu ni¿szego stê¿enia tlenu oraz mniejszej liczbydrobnoustrojów (5).

3. Planowanie i kontrola procesów bioremediacji

Przed zastosowaniem technik bioremediacji na okreœlonym stanowisku powinnosiê oceniæ podatnoœæ zanieczyszczeñ na degradacjê (na podstawie analizy fizyko-chemicznej), mo¿liwoœæ osi¹gniêcia ca³kowitej mineralizacji, liczebnoœæ mikroorga-nizmów zdolnych do rozk³adu zanieczyszczeñ oraz okreœliæ stê¿enie, rozpuszczal-noœæ w wodzie i reaktywnoœæ zwi¹zków wchodz¹cych w sk³ad ska¿enia z innymisk³adnikami œrodowiska.

Kontrola przebiegu procesu bioremediacji gruntów z produktów ropopochod-nych polega na przeprowadzaniu analiz fizyczno-chemicznych i mikrobiologicz-nych. Okreœla siê (metodami chromatografii gazowej i spektrofotometrii w podczer-wieni) zmiany ca³kowitej iloœci wêglowodorów naftowych, a proces prowadzi siê douzyskania ich dopuszczalnego stê¿enia. Monitorowanie obejmuje równie¿ pomiary

Joanna Nowak

100 PRACE PRZEGL¥DOWE

zawartoœci wilgoci i sk³adników od¿ywczych, pH oraz oznaczanie iloœciowe i jako-œciowe mikroorganizmów (1).

Wiêkszoœæ (90-99%) gatunków mikroorganizmów glebowych bior¹cych udzia³w biodegradacji wêglowodorów in situ nie tworzy koloni na pod³o¿ach hodowla-nych. St¹d te¿ poza standardowymi metodami oceny iloœciowej i jakoœciowej stosu-je siê pomiary biomarkerów lipidowych, szczególnie fosfolipidów (PLFA), które in-formuj¹ o zmianach w biomasie bakterii gramujemnych oraz techniki molekularne.Za pomoc¹ PCR przeprowadza siê amplifikacjê genów koduj¹cych enzymy katabo-liczne lub 16S rDNA, które po elektroforezie w gradiencie ¿elu denaturuj¹cego(DGGE) analizuje siê (TRF) w celu identyfikacji gatunków bakterii (14,23).

Do monitorowania bioremediacji gleby zanieczyszczonej wêglowodorami nafto-wymi mo¿na wykorzystaæ takie bioindykatory jak enzymy (lipazy i dehydrogenazy),liczebnoœæ lub bioluminescencjê mikroorganizmów, kie³kowanie nasion oraz prze-¿ywalnoœæ d¿d¿ownic. Trzeba jednak zaznaczyæ, ¿e s¹ to metody niebezpoœrednie,s³u¿¹ce raczej do oceny jakoœciowej, a nie iloœciowej (24).

4. Strategie stosowane w procesach bioremediacji

Bioremediacjê gruntów mo¿na przeprowadzaæ sposobem in situ – w miejscuwystêpowania ska¿enia lub ex situ – po wybraniu zanieczyszczonej gleby z danegoterenu i umieszczeniu w specjalnie przygotowanym miejscu (25). Technologia in situ

stosowana jest w przypadku braku mo¿liwoœci usuniêcia ska¿onej ziemi, na przy-k³ad na obszarach przeznaczonych pod budownictwo, dróg, awarii miejscowychpod ruroci¹gami i instalacjami, ska¿eñ du¿ych obszarów. G³ównymi metodami bio-remediacji gleb in situ s¹: uprawa gleby, biowentylacja, bioekstrakcja. Technologiaex situ umo¿liwia skuteczniejsze wykonanie procesowych zabiegów intensyfikacyj-nych bioremediacji ska¿eñ, co prowadzi do skrócenia ca³kowitego czasu rekultywa-cji. Wœród metod oczyszczania ex situ wymieniæ nale¿y: uprawê gleby, kompostowa-nie, biostosy i bioreaktory (1,25-28).

Wyró¿niæ mo¿na trzy typy bioremediacji gleb: bioremediacjê naturaln¹ (natu-raln¹ attenuacjê), biostymulacjê i bioaugmentacjê (29). W bioremediacji naturalnejwykorzystuje siê proces naturalnej biodegradacji (okreœlanej te¿ naturaln¹ attenu-acj¹) przeprowadzanej przez mikroorganizmy i wymaga jedynie prowadzenia regu-larnego monitorowania stê¿enia zanieczyszczeñ. Najpowszechniej stosowan¹ me-tod¹ bioremediacji gruntów jest biostymulacja polegaj¹ca na stymulowaniu wzrostui aktywnoœci rodzimych populacji drobnoustrojów (przyspieszaniu procesów biode-gradacji zanieczyszczeñ) poprzez dostarczenie im odpowiednich substancji pokar-mowych lub/i tlenu. Zdarza siê, ¿e rodzime populacje na danym terenie nie wyka-zuj¹ po¿¹danej aktywnoœci w degradacji zanieczyszczeñ. Jest to spowodowane tok-sycznym dzia³aniem zwi¹zków wchodz¹cych w sk³ad ska¿enia lub brakiem odpo-wiedniej iloœci i jakoœci organizmów. W takiej sytuacji mo¿na zastosowaæ bioaug-

Bioremediacja gleb z ropy i jej produktów

BIOTECHNOLOGIA 1 (80) 97-108 2008 101

mentacjê (20,30). Metoda ta polega na wprowadzeniu do œrodowiska odpowiednichmikroorganizmów. Mog¹ to byæ wyizolowane ze ska¿onego gruntu i namno¿oneszczepy, które wykazuj¹ najwiêksz¹ aktywnoœæ w rozk³adzie zanieczyszczeñ (rein-okulacja), rodzime drobnoustroje o selektywnie wzmocnionych w laboratorium zdol-noœciach funkcjonalnych lub mikroorganizmy modyfikowane genetycznie (GMM)(6,20,25,29-31).

Genetycznie zmodyfikowane mikroorganizmy mo¿na wykorzystywaæ nie tylkodo przyspieszenia biodegradacji w ska¿onej glebie, ale równie¿ do monitorowaniaobecnoœci wprowadzonych do gruntu bakterii oraz oceny biodostêpnoœci zanie-czyszczeñ (biosensory) i mo¿liwoœci ich eliminacji. W pierwszym przypadku bakte-rie s¹ wyposa¿one w odpowiedni konstrukt genowy, który jest ³atwo wykrywany.Wówczas gdy biodostêpnoœæ zanieczyszczeñ jest warunkiem koniecznym do prze-prowadzenia na danym terenie biologicznego oczyszczania mo¿na wykorzystaæbakterie zawieraj¹ce w swoim genomie promotor indukowany przez zwi¹zek, któ-rego biodostêpnoœæ jest badana. Promotor ten jest po³¹czony z genem, któregoprodukt mo¿na ³atwo obserwowaæ i zmierzyæ. Najpowszechniej u¿ywanymi genamireporterowymi s¹ geny bioluminescencji (luc, lux) oraz gen gfp koduj¹cy zielonebia³ko fluorescencyjne i jego pochodne (7,9,32).

Praktyczne zastosowanie w bioremediacji gruntów z ropy i jej produktów mog¹mieæ bakterie ze wstawionymi do chromosomu genami enzymów uczestnicz¹cychw rozk³adzie wêglowodorów naftowych (np. genem tod koduj¹cym dioksygenazêtoluenu) czy chemotaksji (np. NahY koduj¹cym bia³ko uczestnicz¹ce w chemotaksjido naftalenu i salicylanu) lub z wprowadzonymi plazmidami degradacji wêglowodo-rów (np. plazmidem degradacji piranu z Mycobacterium sp.) (9,12,23,33,34).

5. Zastosowanie metod bioremediacji gleb zaolejonych w Polsce

Zastosowanie biologicznych metod oczyszczania gruntów ska¿onych produkta-mi naftowymi praktykowane jest w Polsce z dobrym skutkiem od kilkunastu lat. Jed-nym z pionierów usuwania z gleb zanieczyszczeñ ropopochodnych jest prof. J. Siutaz Instytutu Ochrony Œrodowiska w Warszawie, którego grupa prowadzi³a bioreme-diacjê w latach 80. i 90. ubieg³ego wieku. W pierwszej po³owie lat 90. w wielu in-nych oœrodkach naukowych i we firmach komercyjnych rozwinê³o stosowanie me-tod biologicznych do likwidacji ska¿eñ produktami ropopochodnymi w glebie (35).

Najwiêksze doœwiadczenie na rynku w dziedzinie oczyszczania gleb z substancjiropopochodnych maj¹ pracownicy Zak³adu Biologii Œrodowiska ISIŒ na PolitechniceWarszawskiej, którzy przy wspó³pracy z firm¹ Hydrogeotechnika Kielce przeprowa-dzili do 2003 r. skuteczn¹ bioremediacjê ponad 30 tys. ton gruntu (22).

Problematyk¹ biorekultywacji gleb zanieczyszczonych substancjami ropopo-chodnymi zajmuj¹ siê równie¿ pracownicy Zak³adu Biochemii Akademii Rolniczejw Krakowie. W swojej kolekcji drobnoustrojów zgromadzono wiele szczepów bak-

Joanna Nowak

102 PRACE PRZEGL¥DOWE

teryjnych i dro¿d¿owych, które s¹ wykorzystywane do konstrukcji biopreparatów,degraduj¹cych trudno rozk³adalne substancje ropopochodne w gruncie. Bank mi-kroorganizmów w Zak³adzie Biochemii zosta³ utworzony ze szczepów wyizolowa-nych z wielu ró¿nych Ÿróde³ zanieczyszczonych wód i gleb, wystêpuj¹cych na tere-nie ca³ej Polski. Bank ten jest wykorzystywany do badañ maj¹cych na celu opracowa-nie sk³adu biopreparatów rozk³adaj¹cych uci¹¿liwe zanieczyszczenia, g³ównie WWAi ich chlorowcopochodne. W Zak³adzie Biochemii AR w Krakowie przeprowadzonowe wspó³pracy z polskimi podmiotami gospodarczymi wydajn¹ bioremediacjê glebsilnie zanieczyszczonych wêglowodorami naftowymi. W tabeli 2 przedstawiono wy-niki wybranych projektów rekultywacji, przeprowadzonych metod¹ ex i in situ

(10,35).

T a b e l a 2

Przyk³ady bioremediacji gruntów

Pochodzeniei charakter ska¿enia

Metodaoczyszczania

Pocz¹tkowestê¿enie

wêglowodorów(mg/kg s.m.)

Koñcowestê¿enie

wêglowodorów(mg/kg s.m.)

Biodegradacja(%)

Czastrwaniaprocesu

(miesi¹ce)

Brzesko – teren by³ej bazy CPN (stacja prze-³adunku paliw)

in situ 51 076 680 98,7 25

ziemia zawieraj¹ca osady i pozosta³oœci porafi-neryjne

ex situ 23 993 6652 72,3 6

modernizacja stacji paliw w Zakopanem ex situ 9367 177 98,1 7

ziemia wybrana z terenu stacji paliw w Skawinie ex situ 8075 1211 85,0 0,8

wyciek spod ruroci¹gu – baza paliwowa Olsza-nica*

in situ 2000 110 94,5 17

teren stacji transformatorowej w Brzesku (ska¿e-nie gleby po wycieku oleju transformatorowego)

in situ 1382 677 51,0 10

*podczas rekultywacji nast¹pi³ dwukrotny wylew

6. Mikroorganizmy rozk³adaj¹ce wêglowodory naftowe

Zdolnoœæ do degradacji i/lub wykorzystywania wêglowodorów naftowych wyka-zuj¹ liczne rodzaje bakterii i grzybów, a tak¿e dro¿d¿e, niektóre Cyanobacteria i zie-lone glony (1,11). Jednak w bioremediacji gruntów, z wielu wzglêdów, wykorzystujesiê przede wszystkim bakterie. Charakteryzuj¹ siê one wysok¹ liczebnoœci¹, szyb-kim wzrostem i zdolnoœci¹ degradacji ró¿norodnych zanieczyszczeñ. Mo¿na je ³atwohodowaæ oraz poddawaæ manipulacjom genetycznym (28). Biologiczne oczyszcza-nie gleb z produktów ropopochodnych zachodzi g³ównie w wyniku dzia³alnoœcibakterii tlenowych, które wykorzystuj¹ wêglowodory naftowe jako Ÿród³o wêglai energii potrzebne do ich wzrostu i rozmna¿ania. Grzyby maj¹ ograniczone zasto-

Bioremediacja gleb z ropy i jej produktów

BIOTECHNOLOGIA 1 (80) 97-108 2008 103

sowanie w bioremediacji, poniewa¿ transformuj¹ wêglowodory naftowe najczêœciejkometabolicznie, wymagaj¹c podstawowego substratu wzrostu (glukoza lub celulo-za), a tempo przeprowadzanej przez nie degradacji jest niskie. Organizmy te nie po-trafi¹ dalej metabolizowaæ produktów kooksydacji, dlatego te¿ ca³kowita minerali-zacja zanieczyszczeñ ropopochodnych nastêpuje w wyniku aktywnoœci bakterii (36).

Bieszkiewicz i wsp. (37) przeprowadzili identyfikacjê bakterii pochodz¹cychz zaolejonej gleby. Wœród wyizolowanych szczepów najliczniejsz¹ grupê stanowi³ybakterie nale¿¹ce do rodzaju Arthrobacter. Mniej licznie by³y reprezentowane bakte-rie z grupy Anitratum oraz Flavobacterium i Vibrio-Aeromonas. Najwiêkszy i najszybszyprzyrost liczby komórek w hodowlach p³ynnych na pod³o¿u z olejami wykazywa³ygatunki nale¿¹ce do rodzaju Arthrobacter i Flavobacterium.

Boossert i Bartha w 1984 r. zaprezentowali listê (w malej¹cym porz¹dku) rodza-jów bakterii najbardziej aktywnych w biodegradacji wêglowodorów naftowych:Pseudomonas, Arthrobacter, Alcaligenes, Corynebacterium, Flavobacterium, Achromobacter,Micrococcus, Nocardia i Mycobacterium. Natomiast w badaniach Sztompki najwy¿sz¹aktywnoœæ w rozk³adzie 1% oleju napêdowego wykaza³y: Micrococcus sp., Chryseomonas

luteola, Bacillus sp., Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes xylosooxidans spp. denitryficans,Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter lwoffi (2).

D³ugo³añcuchowe wêglowodory (alkany i alkeny) s¹ rozk³adane przez wiele ga-tunków bakterii (z rodzaju Pseudomonas, Acinetobacter, Arthrobacter, Corynebacterium,Nocardia, Mycobacterium, Geobacillus), a tak¿e liczne dro¿d¿e (wiêkszoœæ gatunkówCandida), przy czym ich liczba i intensywnoœæ degradacji wzrasta wraz z d³ugoœci¹³añcucha (38,39). Mniej licznie wystêpuj¹ w glebach mikroorganizmy zdolne do bio-degradacji cykloalkanów, przy czym zachodzi ona przede wszystkim przy udzialekonsorcjum mikroorganizmów w drodze kometabolizmu (1).

Niskocz¹steczkowe (dwu- lub trójpierœcieniowe) wêglowodory aromatyczne s¹degradowane przez wiele bakterii glebowych, a tak¿e liczne rodzaje grzybów m.in.Rhizopus, Aspergillus, Candida, Penicillium, Psilocybe, Smittum. Natomiast zdolnoœæ roz-k³adu wysokocz¹steczkowych (z 4 i wiêksz¹ liczb¹ pierœcieni) wêglowodorów aro-matycznych wystêpuje stosunkowo rzadko u bakterii. Zwi¹zki te s¹ raczej rozk³ada-ne przez grzyby ligninolityczne, takie jak: Phanaerochaete chrysosporium, Trametes

versicolor, Bjerkandera sp., Pleurotus ostreatus oraz nieligninolityczne np. Cunninghanella

elegant, Penicillium janthinellum, Syncephalastrum sp. (11,40-42).Zdolnoœæ do wzrostu na wysokocz¹steczkowych wielopierœcieniowych wêglowo-

dorach aromatycznych jest prawdopodobnie szeroko rozpowszechniona w obrêbierodzaju Mycobacterium. Odnotowano j¹ dla kilku gatunków np. M. flavescens,

M. vanbaalenii sp. (26) i szczepów takich jak: AP-1, PYR-1, BB1, KR2, GTI-23,RJGII-135, BG1, CH1 (3,40,42,43). Wiele bakterii degraduj¹cych wielopierœcieniowewêglowodory aromatyczne (WWA) z rodzaju Mycobacterium posiada równie¿ zdol-noœæ do rozk³adu wêglowodorów alifatycznych (44,45).

Mikroorganizmy beztlenowe potrafi¹ degradowaæ wêglowodory, takie jak ben-zen, toluen, etylobenzen, ksylen (BTEX) oraz heksadekan i naftalen (26). Szczepy

Joanna Nowak

104 PRACE PRZEGL¥DOWE

RCB i JJ nale¿¹ce do rodzaju Dechloromonas (�-Proteobacteria) ca³kowicie utleniaj¹benzen w warunkach beztlenowych, wykorzystuj¹c azotan jako akceptor elektro-nów (46). Geobacter metallidurans i G. grbicium zdolne s¹ do beztlenowego utlenianiatoluenu do CO2 z redukcj¹ Fe(III). Znanych jest kilka organizmów ³¹cz¹cych beztle-now¹ degradacjê toluenu z oddychaniem azotanowym (Thauera aromatica szczepyK172 i I1, Azoarcus sp. szczep T, A. tolulyticus szczepy To14 i Td15, Dechloromonas

szczepy RCB i JJ), nadchloranowym (Dechloromonas szczepy RCB i JJ) oraz siarczano-wym (Desulfobacterium cetonicum, Desulfobacula toluolica) (47). Scharakteryzowanorównie¿ metanogeniczne konsorcjum degraduj¹ce toluen sk³adaj¹ce siê z dwóchgatunków archeonów spokrewnionych z rodzajem Methanosaeta i Methanospirillum

oraz dwóch gatunków bakterii, z których jeden spokrewniony jest z Desulfotomaculum

(36). Na podstawie przeprowadzonej analizy za pomoc¹ hybrydyzacji fluorescencyj-nej in situ (FISH) denitryfikatorów degraduj¹cych alkilobenzeny i n-alkany wykazano,¿e s¹ to g³ównie bakterie z grupy Azoarcus/Thauera. Stosunkowo ma³o wiadomoo beztlenowej biodegradacji etylobenzenu. Dotychczas opisano tylko trzy organi-zmy (Thauera szczepy EbN1, PbN1, EB1) utleniaj¹ce ten zwi¹zek z jednoczesn¹ re-dukcj¹ azotanów (47).

7. Mechanizmy biodegradacji wêglowodorów ropopochodnych

Najpowszechniejsz¹ drog¹ tlenowej degradacji n-alkanów jest utlenianie termi-nalne z udzia³em monooksygenazy. Hydroksylacja przy koñcowym wêglu w ³añcu-chu prowadzi do wytworzenia odpowiedniego alkoholu, który jest nastêpnie utle-niany do aldehydów i kwasów t³uszczowych. Kwasy t³uszczowe przechodz¹ proces�-oksydacji, a powsta³y w nim acetylo-CoA zostaje w³¹czony w cykl Krebsa (23). Al-keny ulegaj¹ hydrolizie w miejscu podwójnego wi¹zania, a nastêpnie s¹ metabolizo-wane jak alkany. Krótko³añcuchowe wêglowodory s¹ trudniej degradowane z wyj¹t-kiem metanu, który w warunkach tlenowych jest szybko wykorzystywany jako jedy-ne Ÿród³o wêgla przez metanotroficzne bakterie (np. Methylomonas methanica) i dro¿-d¿e (38).

Degradacjê cykloheksanu zapocz¹tkowuje hydroksylacja prowadz¹ca do powsta-nia cykloheksanolu, który przekszta³cany jest w cykloheksanon i kaprolakton. Na-stêpnie hydrolaza laktozowa otwiera pierœcieñ i powstaje odpowiedni kwas orga-niczny – kwas adypinowy (1).

Bakterie i grzyby wykorzystuj¹ odmienne drogi w tlenowej biodegradacji wêglo-wodorów aromatycznych. U bakterii pocz¹tkowe utlenienie pierœcienia katalizowa-ne jest przez wielosk³adnikow¹ dioksygenazê. Powsta³y cis-dihydrodiol ulega rearo-matyzacji (udzia³ dehydrogenazy cis-dihydrodiolu) do pochodnych dihydroksylo-wych. Dalsze utlenianie prowadzi do utworzenia katecholu (1,2-dihydroksybenzen)lub kwasu protokatechowego (3,4-dihydroksybenzoesan). Potem nastêpuje oksyda-cyjne otwarcie pierœcienia aromatycznego (w pozycji orto lub meta) katecholu lub

Bioremediacja gleb z ropy i jej produktów

BIOTECHNOLOGIA 1 (80) 97-108 2008 105

kwasu protokatecholowego z udzia³em dioksygenaz. Dalszy rozk³ad prowadzi dopowstania intermediatów centralnych szlaków metabolicznych, takich jak burszty-nian, acetylo-CoA, pirogronian (38).

Grzyby nieligninolityczne oraz ligninolityczne utleniaj¹ pierœcieñ aromatycznydo tlenków arenu za pomoc¹ monooksygenazy cytochromu P-450. Tlenki mog¹ na-stêpnie izomeryzowaæ do fenoli lub ulec enzymatycznej hydroksylacji katalizowanejprzez hydrolazê epoksydow¹ z wytworzeniem trans-dihydrodioli. W przeciwieñ-stwie do grzybów nieligninolitycznych, z których stosunkowo niewiele ma zdolnoœædegradowania WWA do CO2, systemy enzymatyczne grzybów ligninolitycznych po-trafi¹ ci¹æ i mineralizowaæ pierœcieñ aromatyczny. Posiadaj¹ one silne zewn¹trzko-mórkowe enzymy odpowiedzialne za degradacjê ligniny, które dzia³aj¹ na szerok¹gamê WWA (48).

Znane s¹, jak dot¹d, dwie drogi beztlenowej degradacji alkanów. Pierwsza z nichpolega na addycji fumaranu, druga zaœ obejmuje karboksylacjê i usuniêcie terminal-nej dwuwêglowej jednostki, co prowadzi do powstania odpowiedniego kwasut³uszczowego (49).

Na podstawie dotychczasowych badañ wskazuje siê na trzy mo¿liwe mechani-zmy pocz¹tkowej aktywacji pierœcienia benzenu, takich jak: karboksylacja, hydrok-sylacja i metylacja. Pierœcieñ ulega przekszta³ceniu do centralnego intermediatu –benzylo-CoA, który jest redukowany do 1,5-dien-1-karboksylo-CoA przez g³ówny en-zym – reduktazê benzoilo-CoA (49).

8. Podsumowanie

Wiele mikroorganizmów glebowych (g³ównie bakterie i grzyby) jest zdolnych dorozk³adu wêglowodorów wchodz¹cych w sk³ad ropy i jej produktów w warunkachzarówno tlenowych, jak i beztlenowych. Wiêkszoœæ z nich zidentyfikowano dziêkirozwojowi technik molekularnych. W ci¹gu ostatnich lat odkryto geny enzymówszlaków biodegradacji sk³adników produktów ropopochodnych i chemoreceptorówuczestnicz¹cych w kierowaniu mikroorganizmów w stronê wêglowodorów nafto-wych. Wprowadzenie tych genów do bakterii mo¿e mieæ praktyczne zastosowaniew bioremediacji. O efektywnoœci bioremediacji in situ gleb ska¿onych produktamiropopochodnymi w du¿ej mierze decyduj¹ parametry fizykochemiczne œrodowiska.Celowe jest, jak siê wydaje, prowadzenie dalszych badañ nad ich wp³ywem na li-czebnoœæ, ró¿norodnoœæ i aktywnoœæ drobnoustrojów oraz biodostêpnoœæ wêglo-wodorów naftowych.

Literatura

1. Klimiuk E., £ebkowska M., (2003), Biotechnologia w ochronie œrodowiska, Wyd. Nauk. PWN, Warszawa.2. Sztompka E., (1999), Acta Microbiol. Pol., 48, 185-196.

Joanna Nowak

106 PRACE PRZEGL¥DOWE

3. Boldrin B., Tiehm A., Fritzsche Ch., (1993), Appl. Environ. Microbiol., 59, 1927-1930.4. Kasai Y., Takahata Y., Hoaki T., Watanabe K., (2005), Environ. Microbiol., 7(6), 806-818.5. Olañczuk-Neyman K., Prejzner J., Topolnicki M., (1994), Biotechnologia, 2, 50-59.6. Boopathy R., (2000), Bioresource Technology, 74, 63-67.7. Dua M., Singh A., Suthunathan N., Johri A. K., (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol., 59, 143-152.8. Watanabe K., (2001), Curr. Opin. Biotechnol., 12, 237-241.9. Romantschuk M., Sarand I., Petänen T., Peltola R., Jonsson-Vihanne M., Koivula T., Yrjälä K., Haah-

tela K., (2000), Environ. Poll., 107, 179-185.10. Kaszycki P., Ko³oczek H., (2004), Biotechnologie stosowane w odnowie gleby zanieczyszczonej substancja-

mi ropopochodnymi, 41-56 (http://fundacja.ogr.ar.krakow.pl/pdf/Kaszycki%20Koloczek% 20str%2041-56.pdf)11. Antizar-Ladislao B., Lopez-Real J. M., Beck A. J., (2004), Crit. Rev. in Environ. Sci. Technol., 34,

249-289.12. Pandey G., Jain R. K., (2002), Appl. Environ. Microbiol., 68, 5789-5795.13. Parales R. E., Haddock J. D., (2004), Curr. Opin. Biotechnol., 15, 374-379.14. Pieper D. H., Reineke W., (2000), Curr. Opin. Biotechnol., 11, 262-270.15. Bellin C. A., Rao P. S. C., (1993), Appl. Environ. Microbiol., 59, 1813-1820.16. Ortego-Calvo J-J., Saiz-Jimenz C., (1998), Appl. Environ. Microbiol., 64, 3123-3126.17. Cameotra S. S., Bollag J-M., (2003), Crit. Rev. Environ. Sci. Technol., 30, 111-126.18. Desai J. D., Banat J. M., (1997), Microbiology and Molecular Biology Reviews, 61, 47-64.19. Timmis K. N., Pieper D. H., (1999), Trends in biotechnology, 17, 201-204.20. Singer A. C., van der Gast Ch. J., Thompson I. P., (2005), Trends in Biotechnology, 23, 74-77.21. Christofi N., Ivshina I. B., (2002), J. Appl. Microbiol., 93, 915-929.22. Szlaski A., Wojewódka D., (2003), Instalator, 61, 52-53.23. Paul D., Pandey G., Pandey J., Jain R. K., (2005), Trends in Biotechnology, 23, 136-142.24. Maila M. P., Cloete T. E., (2005), International Biodeterioration & Biodegradation, 55, 1-8.25. Vidali M., (2001), Pure Appl. Chem., 73, 1163-1172.26. Gestel K. V., Mergaert J., Swings J., Coosemans J., Ryckeboer J., (2003), Environ. Poll., 125, 361-368.27. Jørgensen K. S., Puustinen1 J., Suortti A-M., (2000), Environ. Poll., 107, 245-254.28. Korda A., Santas P., Tenente A., Santas R., (1997), Appl. Microbiol. Biotechnol., 48, 677-686.29. Kaplan Ch. W., Kitts Ch. L., (2004), Appl. Environ. Microbiol., 70, 1777-1786.30. Vogel T. M., (1996), Curr. Opin. Biotechnol., 7, 311-316.31. Smets B. F., Siciliano S. D., Verstraete W., (2002), Environ. Microbiol., 4, 315-317.32. Elsas J. D., Duarte G. F., Rosado A. S., Smalla K., (1998), Journal of Microbiological Methods, 32,

133-154.33. Heitkamp M. A., Freeman J. P., Miller D. W., Cerniglia C. E., (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54,

2556-2565.34. Samanta S. K., Singh O. V., Rakesh K. J., (2002), Trends in Biotechnology, 20, 243-248.35. Ko³oczek, Kaszycki, (2004), Biologiczne mechanizmy oczyszczania ska¿eñ organicznych w glebie, 28-40,

(http://fundacja.ogr.ar.krakow.pl/pdf/Koloczek%20Kaszycki%20str %2028-40.pdf)36. Prenafeta-Boldu F. X., Vervoort J., Grotenhuis J. T. C., van Groenestijn J. W., (2002) Appl. Environ.

Microbiol., 68, 2660-2665.37. Bieszkiewicz E., Mycielski R., Boszczyk-Maleszak H., Wyszkowska B., (1997), Biotechnologia, 1, 71-78.38. Baj J., Markiewicz Z., (2006), Biologia molekularna bakterii, Wyd. Nauk. PWN, Warszawa.39. Meintanis Ch., Chalkou K. I., Kormas K., A., Karagolini A. D., (2006), Biodegradation, 17, 105-111.40. Bogan B. W., Lahner L. M., Sullivan W. R., Paterek J. R., (2003), J. App. Microbiol., 94, 230-239.41. Boonchan S., Britz M. L., Stanley G. A., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66, 1007-1019.42. Kanaly R. A., Harayama S., (2000), J. Bacteriol., 182, 2059-2067.43. Miller C. D., Hall K., Liang Y. N., Nieman K., Sorensen D., Issa B., Anderson A. J., Sims R. C., (2004),

Microbiol. Ecol., 48, 230-238.44. Dandie C. E., Thomas S. M., Bentham R. H., McClure N. C., (2004), J. Appl. Microbiol., 97, 246-255.45. Solano-Serena F., Marchal R., Casarégola S., Vasnier Ch., Lebeault J-M., Vandecasteele J-P., (2000),

Appl. Environ. Microbiol., 66, 2392-2399.

Bioremediacja gleb z ropy i jej produktów

BIOTECHNOLOGIA 1 (80) 97-108 2008 107

46. Coates J. D., Chakraborty R., McInerney M. J., (2002), Research in Microbiology, 153, 621-628.47. Chakraborty R., Coates J. D., (2004), Appl. Microbiol. Biotechnol., 64, 437-446.48. Bezalel L., Hadar Y., Fu P. P., Freeman J. P., Cerniglia C. E., (1996), Appl. Environ. Microbiol., 62,

2547-2553.49. Zhang Ch., Bennett G. N., (2005), Appl. Microbiol. Biotechnol., 67, 600-618.50. Sikkema J., de Bont J. A. M., Poolman B., (1995), Microbiol. Rev., 59, 201-22.51. Margesin R., Schinner F., (2001), Appl. Environ. Microbiol., 67, 3127-3133.52. Semple K. T., Reid B. J., Fermor T. R., (2001), Environ. Poll., 112, 269-283.

Joanna Nowak

108 PRACE PRZEGL¥DOWE