Post on 07-Apr-2016
Análise de aberrações cromossômicas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae expostas a radiação
Juan Lucas Argueso - Tom Petes’ LabDepartment of Molecular Genetics & Microbiology
Duke University Medical CenterDurham, North Carolina, EUA.
Pesquisa desenvolvida em colaboração com Jim Westmoreland e Mike ResnickChromosome Stability SectionNational Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS)Research Triangle Park, North Carolina, EUA.
Roteiro do seminário:
- Introdução:danos ao DNA através de radiação ionizante;mecanismos de reparo de quebras de fita dupla (DSBs);consequências de erros no reparo: aberrações cromossômicas.
- Descrição do projeto atual:formação de quebras através de radiação e;caracterização de aberrações cromossômicas em S. cerevisiae.
- Planos para o futuro:caracterização do “hotspot” no cromossomo 5;estabilidade genômica durante processos fermentativos;regulação e reparo de quebras durante a recombinação meiótica.
Estudos pioneiros relacionando radiação ionizante a danos no material genético:
Em 1927, Hermann Muller demostrou em Drosophila melanogaster que agentes
externos (raios X) podem causar mutações.
Em 1931, Barbara McClintock foi a primeira a associar alterações cromossômicas a fenótipos específicos em milho, inaugurando a visão de que a mutagênese também pode ter base citogenética.
Fonte: Preston (2005) Health Physics 88:545
Fonte: Preston (2005) Health Physics 88:545
Danos a bases e nucleotídeos Dímeros
Quebra de fita simples“nick”
Quebra de fita dupla“DSB”
Tipos de dano causados ao DNA por radiação ionizante
Proporção aproximada = 60 bases danificadas : 30 nicks : 1 DSB
Quebra de fita dupla“DSB”
“Crosslinks”
Vias alternativas para o reparo de quebras de fita dupla:
União de terminações(NHEJ)
Recombinação homóloga(DSBR)
Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais:Translocações
2 / 8
Cromossômo Filadélfia:Translocação 9/22 presente
em casos de leucemia.
Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais:Translocações, Deleções, Amplificações, etc...
Stratakis et al. (2000) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 86:3396
Anisomastia:Amplificação no braço
longo do cromossômo 16
Detecção de aberrações cromossômicas geradas através de quebras de dupla fita no DNA em células diplóides
80 krads
3. Irradiação com 137Cs
30% sobrevivência
4. Plaqueamento e obtenção de colônias sobreviventes
1. Cultura de células diplóides em crescimento exponencial2. Sincronização do ciclo celular no estágio G2 (Nocodazole)
Nocodazole
G2(4n DNA)
Análise de aberrações
5. Identificação e análise de aberrações cromossômicas
krads 0 5 10 20 40 60 80
Formação de quebras de dupla fita em células diplóides sincronizadas em G2
cr2 810 kb
cr4 1530 kb
cr1 250 kb
cr45.1 quebras/Mb/80 krad
cr25.0 quebras/Mb/80 krad
cr15.7 quebras/Mb/80 krad
krads 0 5 10 20 30 40 60 80
Restauração de cromossomos após 80 krads de radiação (~250 DSBs por célula)
cr2 810 kb
cr4 1530 kb
cr1 250 kb
Tempo
(horas) 0 0 0.5 1 1.5 2 3 4
cr4
cr2
cr1
(hours) 0 0 0.5 1 1.5 2 3 4
Colônias individuais sobreviventes apresentam numerosas aberrações cromossômicas após exposição a 80 krads de radiação
12
4
7+15
16+13
21410
11
5+8
9
31+6
cr
75% contém pelo menos uma nova banda cromossômica
Segunda fase:Análise qualitativa das aberrações cromossômicas induzidas por radiação
Microarranjos genômicos - Hibridação Genômica Comparada(Comparative Genomic Hybridization - CGH)
Representação esquemática da análise por CGHPurificação e fragmentação de DNA
genômico da linhagem originalPurificação e fragmentação de DNA genômico da colônia sobrevivente
Incorporação de Cy3(fluorescência verde)
Incorporação de Cy5(fluorescência vermelha)
Mistura e hibridação no microarranjo
Amarelo = razão 1:1Verde = DeleçõesVermelho = Amplificações
Detecção de alterações de dosagem gênica
13,000 sondascobertura completa do
genôma de S. cerevisiae
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
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14
15
16
Exemplo de uma análise CGH
Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.
JW8
Amplificação interna no cromossomo 5 entre
dois elementos Ty e suas LTRs ()
Ty1 Ty1
1
2
3
4
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6
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JW8
Amplificação terminal no braço
esquerdo do cromossomo 7a partir de um grupo de
LTRs ( e )
Exemplo de uma análise CGH
Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.
1
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3
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JW8
Ty1
Deleção termimal no braçodireito do cromossomo 13 a
partir de um Ty1 e suas LTRs
Exemplo de uma análise CGH
Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.
1
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JW8
Deleção terminal no braço esquerdo do cromossomo 5 a partir do gene HXT13
HXT13
Exemplo de uma análise CGH
Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.
1
2
3
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JW8
Amplificação terminal no braço esquerdo do
cromossomo 4 a partir do gene HXT15
HXT15
Exemplo de uma análise CGH
Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.
Elementos retrotransponíveis Ty no genoma de Saccharomyces cerevisiae
Kim et al. (1998) Genome Research 8:464 Inserções completas
Inserções ancestrais
32 217
13 34
2 41
3 32
1 7
Distribuição de aberrações cromossômicas e pontos de resolução (Breakpoints) detectados através de CGH em 37 colônias sobreviventes.
Aberrações numéricas (aneuploidias):(cr1, cr1, cr6 e cr6)4 Monossomias(cr1, cr1, cr5, cr8, cr9, cr9, cr11, cr12, cr13)9 Trissomias
(34.8%)32 Ty ancestrais (LTRs)(6.5%)(7.6%)
67
outros sítios homeólogos sítios heterólogos
(51.1%)47 Ty completos“Breakpoints” posicionados em:
(6.7%)5 Amplificações internas(17.6%)13 Deleções internas(39.2%)29 Amplificações terminais(36.5%)27 Deleções terminais
Aberrações estruturais:
40 deleções : 34 amplificações
86% em Ty’s ou LTRs92% em sítios homeólogos
1
2
3
4
5
6
7
8
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15
16
JW81
2
3
4
5
6
7
8
9
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11
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14
15
16
Ref JW8
12
4
7+15
16+13
2
14
10
11
5+8
9
3
1+6
Translocaçãonão-recíproca
do cr7 para o cr13(~460Kb)
Análise de aberrações cromossômicas específicas e modelos moleculares para o reparo das quebras no DNA.
Análise da translocação of cr7 - cr13 em JW8 por PCR:
7L
POX1 KEX1
13L
NUP116 IOC4Ty1
JAO125 JAO126
JAO124 JAO123
Ref
JW8
125+126R
ef
JW8
124+123
Ref
JW8
125+123
Ref
JW8
124+126
DNA
Primers
7
13
1. Raios causando quebras em um diplóide em G2.
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica
7
13
2. Recombinação ectópica entre sítios homeólogos.
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica
7
13
3. Recombinação ectópica entre sítios homeólogos.
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica
7
13
4. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte.
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica
4a. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte: Balanceada
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica
7
13/7
7
7/13
7
13
13
13
Diplóide com cariótipo normal
Translocação balanceada
4b. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte: Desbalanceada.
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica
7
13/7
7
7/13
7
13
13
13
Translocação desbalanceada
Translocação desbalanceada
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
1. Raios causando quebras em um diplóide em G2.
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
1. Raios causando quebras em um diplóide em G2, quebra no cromossomo 13.
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
2. Ressecção exonucleolítica 5’ - 3’ no DNA quebrado
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
3. Invasão da sequência doadora no cromossomo 7
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
4. Clivagem endonucleolítica das sequências 3’ não-homólogas
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
5. Replicação da fita contínua
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
6. Dissociação do cromossomo doador e replicação da fita descontínua
7
13
Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)
6. Dissociação do cromossomo doador e replicação da fita descontínua
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Recombinação entre outros sítios homeólogos (HXT13/15)
JW8
HXT13
HXT15
90% de identidade
Translocação não-reciproca do cr5 para o cr4 mediada pelos loci HXT13 e HXT15
HXT13
HXT15
Ref
JW8
5F+5R
Ref
JW8
4F+4R
Ref
JW8
4F+5R
Ref
JW8
5F+4R
DNA
Primers
4F 4R
5F 5R
1
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3
4
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14
15
16
Ref JW8
12
4
7+15
16+13
2
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10
11
5+8
9
3
1+6
Amplificação interna no cromossomo 5
(~630Kb)
JW8Análise de aberrações cromossômicas específicas e modelos moleculares para o reparo das quebras no DNA.
Análise estrutural do cromossomo 5 de JW8 por Southern blot
5L
AflIIAflII
AflIIAflII
AflII
AflII AflII AflII
sonda
sondasonda
17.1kb 13.4kb
17.1kb
Ref
JW8
Ref
JW8
Parental 17.1kbDuplicação 13.4kb
23.1kb
9.4kb
6.5kb
4.3kb
2.3kb2.0kb
RefTy1 Ty1
JW8 Ty1 Ty1 Ty1
Região duplicada no cromossômo 16 humano: ~15 MbGenôma de S. cerevisiae: ~13 Mb
5
1. Raios causando quebras em um diplóide em G2.
Permuta mitótica desigual como mecanismo de criação de aberrações cromossômicas estruturais
5
2. Reparo por conversão gênica ou permuta no locus: Reparo correto.
Permuta mitótica desigual como mecanismo de criação de aberrações cromossômicas estruturais
5
5
3. Reparo por permuta desigual: Duplicação e deleção.
Permuta mitótica desigual como mecanismo de criação de aberrações cromossômicas estruturais
5
JW8
Observações principais:
- As quebras de fita dupla (DSBs) foram reparadas principalmente através recombinação homóloga em células diplóides sincronizadas em G2;
- Entretanto, a maioria dos indivíduos sobreviventes apresentou aberrações cromossômicas estruturais formadas provavelmente por recombinação homóloga ectópica;
- A maioria dos sítios de resolução (breakpoints) foi detectada em regiões de sequência repetitiva incluindo inserções Ty completas e ancestrais, além de famílias de genes (HXT e FLO);
- Aberrações numéricas tanto de ganho como de perda de cromossômos completos foram detectadas entre os sobreviventes;
- Uma região de aproximadamente 50kb no cromossômo 5 apresentou a maior concentração de aberrações estruturais, representando 25% do total de “breakpoints”.
Planos para o futuro 1: Análise do “hotspot” no cromossomo 5
~ 50kb Ty1 Ty1
- Aberrações detectadas em 8 das 37 colônias sobreviventes analizadas
JW2
A2
JW5
JW12
A24
JW3
JW8
JW9
~ 50kb Ty1 Ty1
- Esta região contém12 dos 47 “breakpoints” (~25%) posicionados em inserções Ty.
- A frequência de aberrações nessa região é muito superior à incidência esperada para a inserção Ty média ( p = 0.002 ).
Número de “breakpoints” por sítio
Núm
ero
de s
ítios
21
14
7
12
1
0
10
20
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Distribuição dos 47 “breakpoints” nas 46 inserções Ty completas do genôma de S. cerevisiae
Planos para o futuro 1: Análise do “hotspot” no cromossomo 5
Colaboração com Duke e NIEHS$$$
Planos para o futuro 2: Análise de aberrações cromossômicas durante processos fermentativos.
Inóculo inicial no começo da safra
Reutilização do inóculo por vários meses
Acumulação de rearranjos cromossômicos
Caracterização dos eventos por campo pulsado, microarranjos e mapeamento físico
Implicações tecnológicas Estudo da dinâmica de populações durante o processo
fermentativo
Planos para o futuro 3: Regulação e reparo de quebras de fita dupla durante a recombinação meiótica.
- Análise do papel de enzimas modificadoras de histonas no controle da formação de quebras meióticas.
- Papel de mecanismos de reparo de bases mal pareadas “Mismatch repair” no controle da conversão gênica meiótica.
Agradecimentos
- Jim Westmoreland and Mike Resnick (NIEHS)
- Gosia Gawel, Piotr Mieczkowski, e Tom Petes (Duke)
- Membros do Petes Lab.
Suporte Financeiro: National Institues of Health
Duke University Medical Center
124
7+15
16+13
21410
11
5+8
9
3
1+6
Ref A3
A31
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Possível translocação balanceada na colônia A3
Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais:Translocações, Deleções
Síndrome cri-du-chat:Deleção no braço curto do
cromossômo 5